正常形態(tài)精子百分率聯(lián)合精子DNA碎片指數(shù)對體外受精-胚胎移植結局的預測價值

李冷艷,樓麗君,林娜娜

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊906醫(yī)院生殖中心,浙江寧波315000)

近年來,不孕不育癥的發(fā)病率呈逐年上升趨勢,已成為全球性問題,影響了15%～20%的育齡夫婦[1]。隨著中國二胎、三胎政策的放開,高齡夫婦也參與到生育,因此更多的夫婦需要輔助生殖技術助孕。目前,體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)技術是全球使用最廣泛且有效的治療手段之一,其過程中,精子質量的優(yōu)劣對妊娠結局至關重要[2]。

Coban等[3]根據(jù)精子形態(tài)評估各組胚胎的非整倍體率,發(fā)現(xiàn)正常形態(tài)精子百分率降低組的非整倍體率明顯升高。但也有研究發(fā)現(xiàn),精子形態(tài)與IVF-ET妊娠結局無顯著相關性,即使正常形態(tài)精子百分率為0,也有受精及妊娠的可能[4]。而大量實驗數(shù)據(jù)證實,精子DNA碎片化指數(shù)(DNA fragmentation index)與胚胎質量、臨床妊娠率及活產(chǎn)率密切相關[5]。

因此,本研究探討男性正常形態(tài)精子百分率和精子DNA碎片化指數(shù)與IVF-ET助孕過程中的實驗室結果及臨床妊娠結局的相關性,旨在通過聯(lián)合診斷來預測IVF-ET助孕的妊娠結局。

1 材料與方法

1.1研究對象 回顧性分析2020年6月至2023年2月在本生殖中心行IVF-ET助孕的641例患者。所有患者信息按照2001年8月國家衛(wèi)生部頒布的《人類輔助生殖技術管理辦法》(令第14號)進行管理,操作過程符合《人類輔助生殖技術規(guī)范》的要求。納入標準:(1)女方年齡≤35歲;(2)女方基礎激素水平、抗繆勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)水平及卵巢儲備功能正常;(3)女方雙側卵巢及子宮無明顯異常;(4)女方不孕原因為輸卵管因素;(5)男女雙方無吸煙、酗酒等不良嗜好;(6)男女雙方染色體正常;(7)女方在本中心IVF-ET周期數(shù)≤3次。排除標準:(1)女方合并多囊卵巢綜合征、免疫性不孕、子宮慢性炎癥、盆腔炎、重度宮腔粘連等疾病;(2)男方合并無精子癥、重度少精子癥或重度弱精子癥。

根據(jù)WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》(第5版),本研究界定正常形態(tài)精子百分率≥4%為正常。精子DNA碎片化指數(shù)采用精子染色質擴散實驗(SCD)檢測,根據(jù)商品化試劑盒說明,精子DNA碎片化指數(shù)<25%為正常。按正常形態(tài)精子百分率和精子DNA碎片化指數(shù)水平,將研究對象分為A組(正常形態(tài)精子百分率<4%,精子DNA碎片化指數(shù)<25%,403例)、B組(正常形態(tài)精子百分率≥4%,精子DNA碎片化指數(shù)≥25%,9例)、C組(正常形態(tài)精子百分率≥4%,精子DNA碎片化指數(shù)<25%,125例)、D組(正常形態(tài)精子百分率<4%,精子DNA碎片化指數(shù)≥25%,104例)以及A1組(正常形態(tài)精子百分率<1%,精子DNA碎片化指數(shù)<25%,106例)、D1組(正常形態(tài)精子百分率<1%,精子DNA碎片化指數(shù)≥25%,60例)。所有入組患者均已簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標本收集 男方在行輔助生殖技術前1個月內(nèi),禁欲2～7天,采用手淫法取精。將新鮮精液全部置于無毒取精杯中,1 h內(nèi)對液化樣本進行常規(guī)精液分析、精子DNA碎片化指數(shù)檢測及精子嚴格形態(tài)學判定,按實驗室操作流程執(zhí)行。

1.2.2精子形態(tài)學分析 將精液用磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)洗滌、離心(500×g,10分鐘)制備精子懸液,制片后采用Diff-Quik快速染色試劑盒(深圳博銳德生物科技公司)染色。使用計算機輔助精子質量分析(CASA)系統(tǒng)(北京賽司醫(yī)療科技公司)自動采集約200條精子并分類,經(jīng)有經(jīng)驗且參加室間質評的檢驗人員復核。嚴格按照WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》(第5版)進行精子形態(tài)學判定,分析2次,取95%可信區(qū)間內(nèi)均值作為正常形態(tài)精子百分率。

1.2.3精子DNA碎片化指數(shù)檢測 采用精子染色質擴散(SCD)法檢測精子DNA碎片化指數(shù),試劑購自深圳博銳德生物科技公司。操作流程:(1)取60 μL待測精液與融化的易熔凝膠充分混勻;(2)在載玻片包被區(qū)加入30 μL混合物,蓋片置2～8 ℃冰箱5 min凝固;(3)浸入反應液A中反應7 min,再浸入反應液B中反應25 min;(4)蒸餾水洗滌5 min;(5)75%、95%乙醇各脫水2 min;(6)自然干燥后染片。使用CASA系統(tǒng)(北京賽司醫(yī)療科技公司)自動采集500條精子,經(jīng)參加室間質評的檢驗人員復核計數(shù)存在DNA碎片的精子,得出精子DNA碎片化指數(shù)值。

1.2.4妊娠結局判定標準 胚胎移植后4周超聲見孕囊并有心血管搏動為臨床妊娠。所有患者均行卵泡期高孕激素狀態(tài)下促排卵(progestin-primed ovarian stimulation,PPOS)方案獲卵。

1.2.5觀察指標 輔助生殖助孕結局包括實驗室結局、妊娠結局。(1)實驗室結局:受精率、可利用胚胎率、優(yōu)胚率。受精率=受精數(shù)/成熟卵子數(shù)×100%,可利用胚胎率=可利用胚胎數(shù)/卵裂胚胎數(shù)×100%,優(yōu)胚率=優(yōu)質胚胎數(shù)/正常受精卵裂胚胎數(shù)×100%。(2)妊娠結局:臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%,早期流產(chǎn)率=早期流產(chǎn)數(shù)/臨床妊娠數(shù)×100%,活產(chǎn)率=活產(chǎn)分娩數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

2 結果

2.1一般資料比較 見表1。女方年齡、男方年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),但6組間精子活動率、前向運動精子百分率、精子總數(shù)、精子DNA碎片化指數(shù)、正常形態(tài)精子百分率比較差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

表1 6組患者一般資料比較

2.2實驗室結局比較 見表2。隨著正常形態(tài)精子百分率的降低和精子DNA碎片化指數(shù)的增高,卵母細胞的受精率顯著下降(P<0.05),而胚胎發(fā)育情況可利用胚胎率、優(yōu)胚率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 6組患者的實驗室結局比較

2.3妊娠結局比較 見表3。6組患者臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

表3 6組患者的妊娠結局比較

3 討論

據(jù)報道,不孕不育癥已成為全球第三大疾病,影響15%的夫婦,其中男性因素占40%～50%[6]。我國不孕率從2007年的12%上升至2010年的15%,2020年又上升到18%左右[7],約一半源于男性因素[7]。隨著輔助生殖技術(ART)的發(fā)展,男性因素與ART結局的關系受到越來越多關注。

研究表明精子DNA損傷影響男性生育力及ART結局[8],但單一變量下其與ART結局尚無統(tǒng)一結論。有研究發(fā)現(xiàn)精子DNA碎片化指數(shù)與流產(chǎn)相關,但與受精率、2PN胚胎形成率、臨床妊娠率無關[9];也有研究認為精子DNA碎片化指數(shù)增加會顯著降低生化妊娠率和臨床妊娠率[10]。Oleszczuk等[11]發(fā)現(xiàn)精子DNA碎片化指數(shù)與優(yōu)胚率無明顯相關,但與流產(chǎn)率正相關、與活產(chǎn)率負相關。

精子形態(tài)學分析被認為是評價男性生育力的重要方法,但也有研究發(fā)現(xiàn)畸形精子癥對IVF-ET結局無顯著影響[4]。本研究顯示,男方正常形態(tài)精子百分率聯(lián)合精子DNA碎片化指數(shù)異常組的受精率顯著降低(P<0.05)。既往研究發(fā)現(xiàn)正常形態(tài)精子百分率<4%會顯著增加總受精失敗率,但不會影響臨床妊娠結局[4]。精子形態(tài)缺陷可能影響精子與卵子間相關蛋白和受體的正常表達,導致受精失敗[12]。

2019年中華醫(yī)學會生殖醫(yī)學分會數(shù)據(jù)顯示,新鮮移植和冷凍移植周期的臨床妊娠率分別為51.95%和52.23%[13]。本研究對象為女方年齡≤35歲、移植周期≤3次的患者,臨床妊娠率明顯高于上述大數(shù)據(jù)。對男方作單一變量分析,不區(qū)分受精方式,正常形態(tài)精子百分率聯(lián)合精子DNA碎片化指數(shù)正常組的臨床妊娠率略高于異常組,但差異無統(tǒng)計學意義,與既往研究發(fā)現(xiàn)不同受精方式對結局無明顯影響結論一致[14]。我們認為,密度梯度離心后的上游精液處理可改善正常形態(tài)精子總數(shù);女方年齡≤35歲、卵巢儲備功能正常,優(yōu)質成熟卵母細胞可能具有修復精子缺陷的功能。研究顯示,低齡卵母細胞ART結局差異不大,但高齡卵母細胞注射來自高DNA碎片化指數(shù)精子會發(fā)育成質量較差的胚胎,導致著床率、妊娠率降低及流產(chǎn)率升高[15]。

綜上所述,對于年齡≤35歲且無自身慢性炎癥和疾病的女性患者,男方正常形態(tài)精子百分率降低和精子DNA碎片化指數(shù)升高對IVF-ET結局的影響不大,預測價值有限。鑒于本研究為單中心、樣本量較小,可能存在選擇性偏倚,需開展更多高質量、多中心、大樣本研究以得出更有說服力的結論。