羊水原位培養(yǎng)法聯(lián)合染色體微陣列分析在產(chǎn)前診斷中的應用

向文秀,錢罡

(1.懷化市婦幼保健院遺傳科,湖南懷化 418099;2.浙江博圣生物技術(shù)股份有限公司,杭州 310012)

染色體病是導致出生缺陷的原因之一,是由染色體數(shù)目異?；蚪Y(jié)構(gòu)異常引起的一類遺傳性疾病?；颊咧饕憩F(xiàn)為智力低下、生長發(fā)育遲緩和多發(fā)畸形等,目前尚無有效治療手段,主要通過產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷來控制并減少患兒的出生。

孕中期對胎兒羊水細胞進行染色體核型分析是產(chǎn)前診斷中檢測胎兒染色體異常的經(jīng)典、常用且經(jīng)濟的方法。該技術(shù)可以明確診斷出胎兒染色體數(shù)目異常和大于5 Mb大片段的結(jié)構(gòu)異常[1]。各指南推薦羊水原位培養(yǎng)法為羊水染色體核型分析的首選方法,有助于提高真假嵌合的判斷[2],但其檢測分辨率有限,對小于5 Mb的微缺失、微重復等小片段結(jié)構(gòu)異常的診斷能力不足。染色體微陣列分析(chromosome microarray analysis,CMA)技術(shù)是在全基因組水平上使用高密度DNA探針對目標DNA進行雜交,通過掃描熒光信號分析其拷貝數(shù)變異(copy number variant,CNV),可檢測出1 kb以上的CNV,對微缺失和微重復具有明顯檢測優(yōu)勢。聯(lián)合應用核型分析和CMA技術(shù),既可檢測顯微水平的結(jié)構(gòu)變異,又可發(fā)現(xiàn)亞顯微水平的CNV,有助于提高產(chǎn)前診斷的檢出效率。

本研究回顧分析采用羊水原位培養(yǎng)法聯(lián)合CMA檢查的3 133例樣本結(jié)果,評估兩種方法在不同產(chǎn)前診斷指征下的檢出效率,為臨床診斷應用提供參考依據(jù)。

1 對象與方法

1.1研究對象 收集2018年10月至2023年2月在懷化市婦幼保健院接受羊水原位培養(yǎng)法聯(lián)合CMA產(chǎn)前診斷的3 133例孕婦資料,孕婦年齡17～46歲,孕周16～39周。所有孕婦均簽署產(chǎn)前診斷知情同意書后在超聲引導下行羊膜腔穿刺術(shù)采集羊水樣本。入選指征包括:孕婦年齡≥35歲;超聲篩查異常(如鼻骨缺失、雙側(cè)脈絡(luò)膜囊腫等軟指標異常和胎兒結(jié)構(gòu)異常);血清篩查高風險(21-三體綜合征MOM值>1/270,18-三體綜合征MOM值>1/274);無創(chuàng)DNA篩查高風險(21-三體綜合征高風險、18-三體綜合征高風險、13-三體綜合征高風險);不良妊娠史(胚胎停育、自然流產(chǎn)等);夫妻一方染色體異常(患染色體病或為攜帶者)。本研究獲本院倫理委員會批準(批準文號:202308)。

1.2方法

1.2.1羊水原位培養(yǎng)法 (1)采樣及接種:在超聲引導下采集16～20 mL羊水,注入2個無菌離心管,378×g水平離心10 min。吸去部分上清液,分別加入1 mL羊水培養(yǎng)基(美國Thermo Fisher Scientific公司),充分混勻后接種至原位培養(yǎng)盒的載玻片上,每例接種2個原位培養(yǎng)盒,在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h,添加3 mL新鮮羊水培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。(2)換液:培養(yǎng)7～8天后,在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況,貼壁細胞克隆5～10個,10倍鏡下面積占據(jù)一半以上視野且透亮細胞較多時,用3 mL新鮮羊水培養(yǎng)基替換后次日收獲細胞。(3)收獲:加入秋水仙素50 μL(終濃度為5 μg/mL),置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中溫育30 min,吸去培養(yǎng)盒中液體。加入5 mL預溫的低滲液(0.75 mol/L氯化鉀),37 ℃培養(yǎng)箱中低滲30 min后加入1 mL 5%冰乙酸,室溫預固定15 min。吸去液體,加入5 mL固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)漂洗后吸去固定液,加入5 mL固定液固定15 min。吸去固定液,再加入5 mL固定液。將玻片轉(zhuǎn)移至25 ℃、50%相對濕度條件的分散儀中進行分散。80 ℃烤片3 h后行G顯帶染色。

1.2.2核型分析 每例計數(shù)2張原位載玻片上20個細胞克隆的20個細胞,每克隆僅計數(shù)1個細胞,分析5個細胞核型,分辨率不低于400條帶。如遇異常,則加大計數(shù)或分析細胞數(shù)。核型結(jié)果按國際人類細胞遺傳命名系統(tǒng)(International System for Human Cytogenetic Nomenclature,ISCN)描述。若發(fā)現(xiàn)羊水染色體嵌合體,則根據(jù)中國衛(wèi)生行業(yè)標準WS322.2—2010,對不同類型嵌合體分別進行高強度額外工作(額外檢查24個克隆細胞)、中強度額外工作(額外檢查12個克隆細胞)以及無需額外工作。

1.2.3染色體微陣列分析 收集羊水于無菌離心管,采用全基因組DNA提取試劑盒(北京天根公司)提取DNA。經(jīng)質(zhì)檢后,DNA進行酶切消化形成粘性末端,在酶切產(chǎn)物兩端加上特異性識別該末端的接頭,使用特異性引物通過PCR擴增獲得高豐度基因組DNA。采用磁珠法純化PCR產(chǎn)物,測定濃度達標后,使用片段化酶將DNA片段化,脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶標記小片段末端。標記產(chǎn)物加入Cytoscan 750K Array微陣列芯片(美國Affymetrix公司)雜交16～18 h,洗滌去除未雜交DNA。放入芯片掃描儀中掃描,使用Chas軟件讀取數(shù)據(jù),將芯片結(jié)果比對實驗室本地數(shù)據(jù)庫及公共數(shù)據(jù)庫,對染色體CNV進行分類評估。

1.2.4觀察指標 因單一產(chǎn)前診斷指征行產(chǎn)前診斷者歸為單指征組,同時具有2種產(chǎn)前診斷指征者歸為雙指征組(本研究未見≥3種指征者)。比較分析不同產(chǎn)前診斷指征組孕婦羊水樣本的核型及CMA結(jié)果。記錄聯(lián)合檢查的異常情況,其中任一單項檢查結(jié)果提示異常則統(tǒng)計為聯(lián)合檢查異常;核型分析檢出異常但CMA未檢出異常統(tǒng)計為核型分析檢出異常;核型分析未檢出異常但CMA檢出異常統(tǒng)計為CMA檢出異常。

2 結(jié)果

2.1不同指征下的異常檢出率 共3 133例采用羊水原位培養(yǎng)法聯(lián)合CMA進行產(chǎn)前診斷(表1),其中,1 993例(63.61%)孕婦因單項指征進行產(chǎn)前診斷,1 140例(36.39%)孕婦因兩項指征進行產(chǎn)前診斷。血清學篩查高風險是主要指征,單純因血清學篩查高風險進行產(chǎn)前診斷者占34.98%(1 096/3 133),血清學篩查高風險合并其他指征者占30.89%(968/3 133);其次為年齡高風險,單純年齡高風險及合并其他指征者分別占7.98%(250/3 133)和35.27%(1 105/3 133);再其次為超聲異常,單純超聲異常及合并其他指征者分別占14.59%(457/3 133)和3.38%(106/3 133)。

表1 不同產(chǎn)前診斷指征羊水原位培養(yǎng)法聯(lián)合CMA檢出結(jié)果[n(%)]

單指征組聯(lián)合檢查異常483例,異常檢出率24.23%,其中羊水原位培養(yǎng)法分析異常184例,異常檢出率9.23%;CMA異常432例樣本,異常檢出率21.68%。雙指征組聯(lián)合檢查共檢出313例,異常檢出率27.46%,其中羊水原位培養(yǎng)法異常116例,異常檢出率10.18%;CMA異常274例,異常檢出率24.04%。雙指征組異常檢出率均高于單指征組(羊水原位培養(yǎng)法增加0.95%,CMA法增加2.36%),CMA異常檢出率均高于核型分析。

2.2羊水原位培養(yǎng)法和CMA對染色體異常檢出的一致性 3 133例樣本中,羊水原位培養(yǎng)法和CMA結(jié)果均正常的樣本2 726例(含染色體多態(tài)),異常檢出結(jié)果一致的176例,其中非整倍體(不含嵌合體)共145例,包含21-三體綜合征85例、18-三體綜合征23例、13-三體綜合征2例、性染色體非整倍體35例(見表2),其余31例為染色體結(jié)構(gòu)異常。

表2 羊水原位培養(yǎng)法和CMA檢出的非整倍體異常分類

2.3羊水原位培養(yǎng)法和CMA對染色體異常檢出的差異性 在羊水原位培養(yǎng)法檢測結(jié)果正常的病例中,CMA檢出169例提示致病或可能致病CNV,其中主要的異常類型為≤10 Mb的微缺失/微重復共117例,占69%,其次為雜合性缺失(LOH)共29例,占17%,然后是15例雜合性不存在(AOH)/純合區(qū)域(ROH)占9%,8例經(jīng)家系驗證為單親二倍體(UPD),占5%。

在CMA檢測正常的病例中,羊水原位培養(yǎng)法檢出11例染色體結(jié)構(gòu)異常。其中包含5例羅氏易位,3例平衡易位,2例插入以及1例環(huán)狀染色體,見表3。

表3 羊水原位培養(yǎng)法檢測異常但CMA檢測正常結(jié)果

在嵌合體檢出方面,羊水原位培養(yǎng)法和CMA共發(fā)現(xiàn)23例嵌合體,其中羊水原位培養(yǎng)法檢測出20例嵌合體,CMA檢測出11例嵌合體。有7例嵌合體羊水原位培養(yǎng)法與CMA結(jié)果一致;有12例羊水原位培養(yǎng)法檢測為嵌合體,CMA檢測為微缺失/微重復或正常;另有4例CMA檢測為嵌合體,羊水原位培養(yǎng)法檢測為衍生染色體或正常,見表4。

表4 羊水原位培養(yǎng)法和CMA在嵌合體方面的檢出情況

3 討論

本研究中羊水原位培養(yǎng)法異常檢出率為9.58%,與國內(nèi)報道一致[3]。引入CMA技術(shù)后,聯(lián)合檢測異常檢出率較單獨使用羊水原位培養(yǎng)法提高15.83%(達25.41%),顯著提升了對染色體病的診斷效率及準確性,與潘云等[3]研究結(jié)論一致。將不同產(chǎn)前診斷指征分組后分析發(fā)現(xiàn),雙指征組羊水原位培養(yǎng)法及CMA異常檢出率分別為10.18%和24.04%,均高于單指征組(分別為9.23%和21.68%),說明多項產(chǎn)前診斷指征可有助于提高發(fā)現(xiàn)高危孕婦的概率。分析羊水原位培養(yǎng)法與CMA異常檢出率差異發(fā)現(xiàn),兩者對于染色體非整倍體異常及大片段結(jié)構(gòu)異常均有極高的檢出率。但CMA也在羊水原位培養(yǎng)法染色體核型分析正常病例中檢出微缺失/微重復、LOH和UPD(核型無法檢測<5 Mb異常),而羊水原位培養(yǎng)法則檢出平衡性重排(易位、環(huán)狀、插入)異常(CMA技術(shù)無法檢出)[4]。因此,兩者結(jié)合后互補長短,聯(lián)合的異常檢出率(25.41%)高于單獨使用任一技術(shù)。

本研究聯(lián)合檢測出嵌合體發(fā)生率為0.73%(23/3 133),主要為21-三體嵌合,其次為性染色體嵌合。其中,羊水原位培養(yǎng)法檢出20例嵌合體(0.64%),與國內(nèi)報道[5]的真性嵌合發(fā)生率接近;但有12例CMA未提示嵌合,可能因PCR擴增改變原嵌合比例,導致低于10%的低比例嵌合體出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象。CMA檢測出11例嵌合體(0.35%),其中4例羊水原位培養(yǎng)法未發(fā)現(xiàn),主要由于細胞培養(yǎng)過程中部分細胞丟失或者優(yōu)勢生長導致。本研究中羊水原位培養(yǎng)法嵌合體檢出率(0.64%)高于CMA(0.35%),與付愛紅等[6]研究結(jié)果一致。

綜上所述,羊水原位培養(yǎng)法聯(lián)合CMA技術(shù)對非整倍體異常及嵌合體檢出率更高。前者在檢測染色體平衡重排上優(yōu)勢明顯,而后者高分辨率可有效檢出微小片段異常,因此羊水原位培養(yǎng)法聯(lián)合CMA技術(shù)可互補長短,極大提升了臨床上診斷染色體病的準確性,在產(chǎn)前診斷中具有重要應用價值。