精子相關參數(shù)與體外受精受精率的相關性研究*

黃玲,楊帆,江利,李蘇萍

(郴州市第一人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心,湖南郴州423000)

據(jù)統(tǒng)計,大約有15%～20%的夫婦存在不孕不育,其中男性因素高達40%～50%[1-2]。造成男性不育的主要原因是精子質(zhì)量下降,近年來,男性精子質(zhì)量呈現(xiàn)不斷下降的趨勢[3-5]。在不孕不育高發(fā)的背景下,一些夫婦無法獲得自然妊娠而選擇輔助生殖技術(assisted reproductive technology,ART)助孕治療。精子功能不僅在自然生育中扮演了不可替代的角色,在體外受精(invitrofertilization,IVF)治療中也起著非常關鍵的作用。目前評估男性生育潛能的指標多依據(jù)精子濃度、精子活力和正常形態(tài)精子百分率等精液常規(guī)分析指標[6]。研究顯示精子DNA作為父系遺傳信息的直接載體,對胚胎發(fā)育、妊娠結局及子代的安全性均有重要影響[7]。精子DNA碎片指數(shù)(DNA fragmentation index,DFI)是反映精子完整性的關鍵指標,DNA損傷的精子即使能夠正常啟動受精和早期胚胎發(fā)育,但仍會導致流產(chǎn)等不良妊娠結局[8]。頂體酶是精子頂體區(qū)域非常重要的一種蛋白質(zhì)水解酶,其能夠溶解卵子表面的透明帶,讓精子核DNA順利進入卵細胞中。相關研究顯示,男性精子頂體酶活性與IVF受精率有相關性[9]。也有一些研究認為精子頂體酶活性、精子DFI、精子形態(tài)學分析等檢測與體外受精-胚胎移植(invitrofertilization and embryo transfer,IVF-ET)臨床結局不相關[10-14]。目前,國內(nèi)外對IVF受精率的相關研究多是單因素分析,男方精液參數(shù)多因素對IVF受精率綜合作用的評估研究較少。因此,本研究的目的在于探討精子相關參數(shù)與IVF受精率的相關性,以提高患者輔助生殖的成功率。

1 資料與方法

1.1研究對象 以2020年4月至2023年4月在我院行IVF的327例男性為研究對象。納入標準:(1)男方年齡22～50歲,配偶年齡小于40歲;(2)同居或婚后未避孕一年以上而未孕,因女方輸卵管障礙首次來我院行IVF治療;(3)雙方性生殖器官及功能正常,無自身免疫病、遺傳性疾病;(4)半年內(nèi)未服用對檢驗結果有影響的藥物;(5)女方采用早卵泡期長方案促排且獲卵數(shù)≥3枚、卵母細胞成熟度≥50%。排除標準:(1)男方合并有心臟、肝臟、腎臟等器質(zhì)性疾病者;(2)男女雙方有生殖道感染者;(3)生殖器官有腫瘤或者發(fā)育不良者;(4)服用嚴重影響精子質(zhì)量和生精功能的藥物者;(5)重度少精子癥(<5×106/mL)者。依據(jù)我中心胚胎實驗室質(zhì)控數(shù)據(jù)考核標準分為低受精組(受精率<30%,n=19)和正常受精組(受精率≥30%,n=308)。

1.2主要儀器及試劑 精液常規(guī)分析采用WLJY-9000型計算機輔助精子分析(CASA)系統(tǒng)(北京偉力公司),精子頂體酶活性定量、精子膜表面抗體檢測及精子DNA完整性檢測試劑盒購自深圳華康生物醫(yī)學工程公司。HR801型酶標儀購自深圳華科瑞科公司,CX33型普通光學顯微鏡購自日本Olympus公司,Eppenddorf AG 5424高速離心機購自美國Eppenddorf公司。

1.3精液樣本采集及常規(guī)分析 納入對象禁欲2～7天,手淫法取精,樣本采集完成后置于37 ℃溫箱內(nèi)液化,參照WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》(第5版)對精液量、精子濃度、活力和精子形態(tài)進行分析[15]。精液常規(guī)室內(nèi)質(zhì)控采用自制質(zhì)控品,每天取2支低濃度和高濃度質(zhì)控品,室溫平衡30 min后充分混勻按日常樣品檢測,結果均在控。精子形態(tài)學染色采用改良巴氏染色,并常規(guī)進行室內(nèi)質(zhì)控。留取新鮮精液量用作精子頂體酶活性檢測,留取至少100 μL精液用于精子DNA完整性檢測。

1.4精子頂體酶活性檢測 采用改良Kennedy法按照試劑盒說明書檢測精子頂體酶活性。試劑配套質(zhì)控品稀釋和保存:質(zhì)控品凍干粉加入1 mL蒸餾水溶解成質(zhì)控液,分裝后-20 ℃冷凍保存,避免反復凍融,每次取試劑配套的質(zhì)控品室溫平衡后,與臨床樣本平行測定,質(zhì)控品檢測結果在給定的范圍內(nèi)該批樣本結果有效。

1.5抗精子抗體檢測及結果判斷 采用混合抗球蛋白反應(mixed antiglobulin reaction,MAR)法按照試劑盒說明書檢測精子膜表面抗體。結果判讀:記錄涂片中附著在致敏微球上的活動精子百分率(忽略尾尖結合)。每張涂片至少計數(shù)200個活動的精子,記錄微球同精子結合的部位(頭、中段、尾)。

1.6精子DNA完整性檢測及判讀 用精子染色質(zhì)擴散(SCD)法按照試劑盒說明書要求檢測精子DNA的完整性。在普通顯微鏡400×鏡頭下,觀察400個染色的精子,分為大、中、小、無暈環(huán),暈環(huán)寬度(b)/精子頭直徑(a)≥2/3為大暈環(huán);>1/4且≤2/3為中暈環(huán);≤1/4為小暈環(huán);觀察不到暈環(huán)的精子為無暈環(huán);觀察不到暈環(huán)且精子核區(qū)染色較淺的精子為無暈環(huán)和退化。精子核DNA較完整的精子,能觀察到深染的精子頭部,且有明顯的核暈環(huán),呈中暈環(huán)或大暈環(huán);而精子核DNA斷裂較多的精子,染色后僅能觀察到深染的精子頭部,看不到暈環(huán)或僅有少量核暈存在。精子DNA完整率=(大暈環(huán)+中暈環(huán))精子/被觀察精子總數(shù)×100%。精子DFI=1-精子DNA完整率。精子DFI增高,表明DNA損傷增加,完整性降低。質(zhì)量控制措施:合適、穩(wěn)定的反應溫度(20～28 ℃)是SCD試驗成功的關鍵;試驗操作應嚴格遵循試驗程序,變性時間、裂解時間對SCD試驗的成功至關重要。

2 結果

2.1低受精組與正常受精組基本信息及精液參數(shù)分析 見表1。低受精組正常形態(tài)精子百分率及精子頂體酶活性水平低于正常受精組,而精子DFI水平高于正常受精組(P均<0.01);男女雙方年齡、體質(zhì)指數(shù)及其他精液參數(shù)在兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2精液相關參數(shù)與受精率的相關性分析 受精率與精子頂體酶活性、正常形態(tài)精子百分率及精子DFI相關,相關系數(shù)(r)分別為0.168、0.306、-0.243(P均<0.05),與禁欲天數(shù)、精液量、pH、精子濃度、前向運動精子百分率、非前向運動精子百分率、不活動精子百分率及抗精子抗體陽性率無相關性(P>0.05)。

2.3男女雙方基本參數(shù)及精子相關參數(shù)對IVF受精率的影響 采用Logistic回歸分析相關基本參數(shù)對IVF受精率的影響,IVF受精率受頂體酶活性、正常形態(tài)精子百分率及精子DFI的影響(P均<0.05,見表2),并得到預測IVF受精率的Logistic回歸方程:IVF受精率=-2.561+0.035×精子頂體酶活性+2.066×正常形態(tài)精子百分率-1.51×精子DFI。

表2 進入法Logistic回歸分析相關基本參數(shù)對IVF受精率的影響

2.4精子頂體酶活性、正常形態(tài)精子百分率、精子DFI對IVF受精率的預測價值 用ROC曲線分析精子頂體酶活性、正常形態(tài)精子百分率、精子DFI及三者聯(lián)合對IVF受精率的預測價值,其曲線下面積分別為0.806、0.889、0.827、0.899(圖1),均>0.7,提示三者均是IVF受精率較好的預測指標。

注:預估結果指三者聯(lián)合的預估值

精子頂體酶活性、正常形態(tài)精子百分率、精子DFI及三項聯(lián)合預測IVF受精率的cut-off值、敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值,見表3。

表3 精子頂體酶活性、正常形態(tài)精子百分率、精子DFI及三項聯(lián)合預測IVF受精率的性能比較

3 討論

2019年35歲以下不孕癥患者約71.39%選擇IVF助孕治療,其中選擇常規(guī)IVF者占51.17%,是目前治療不孕不育的主要途徑[16]。但是常規(guī)IVF助孕過程中仍有可能出現(xiàn)低受精或者完全不受精的情況,其發(fā)生率為3%～5%[17]。對此,構建有效評估模型預測受精率,并采取有效措施來避免受精失敗對提升IVF成功率非常有必要。

受精是精子與卵子結合形成合子的過程,任何一方的問題都可能導致受精失敗或者異常。前期研究發(fā)現(xiàn)[18],男女雙方年齡、精子頂體酶活性及卵子成熟度是影響精卵受精的相關因素;女方年齡大于40歲時,精子頂體酶活性對精卵受精率無明顯影響。為進一步研究男方精子相關參數(shù)與IVF受精率的關系,盡量減少女方因素的干擾,新增了排除標準:女方年齡>40歲、卵子成熟度<50%。本研究中,Pearson相關分析發(fā)現(xiàn)正常形態(tài)精子百分率、精子頂體酶活性、精子DFI是影響受精率的相關因素。這可能與傳統(tǒng)的精液常規(guī)檢測結果波動與男方身體及精神狀態(tài)變化大有關。朱春輝[19]的研究也提示傳統(tǒng)的精液常規(guī)檢測無法對精子的受精潛能及男性生育力進行準確評估。

本研究采用Logistic回歸分析相關基本參數(shù)對IVF受精率的影響,IVF受精率顯著受精子頂體酶活性、正常形態(tài)精子百分率及精子DFI的影響。眾所周知,受精過程是多因素綜合作用的結果。因此,本研究用多因素回歸分析這3個精子相關參數(shù)與受精率的關系,得出方程式:受精率預估值=-2.561+0.035×精子頂體酶活性+2.066×正常形態(tài)精子百分率-1.51×精子DFI。進一步用ROC曲線分析三者及三者聯(lián)合對IVF受精率的預測價值,AUCROC分別為0.806、0.889、0.806、0.899,均>0.7,提示三者均是較好的預測指標。精子作為生殖細胞,結構比較復雜,可分為頭部、主段和尾部,任何部位的缺失或形態(tài)的改變均可能影響精子功能。相關研究表明,畸形精子頭部多伴有頂體或核膜的異?；蛉笔?細胞核的固縮(凋亡),主段線粒體及微管結構的紊亂,這些異常會導致卵子與精子間相關蛋白及受體表達的失常,從而導致受精失敗[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)正常形態(tài)精子百分率<2.98%,是低受精率的預警指標,其風險值達7.730。

精子頭前部的頂體區(qū)是包裹在精子細胞核上面的細胞器,是精子特有的結構,含有豐富的水解酶,主要是頂體酶。精子穿過卵子透明帶發(fā)生頂體反應的過程中,頂體酶由低活性轉變?yōu)楦呋钚詠韼椭该鲙?有利于精子穿透透明帶從而完成受精過程。因此,精子頂體酶活性高低直接影響受精過程,多項臨床研究表明精子頂體酶活性可以作為評價精子受精功能的重要指標[22-23]。本研究結果顯示,精子頂體酶活性是預測IVF受精率的重要因素,頂體酶活性<61.20 μIU/106精子者,低受精的概率高于活性>61.20 μIU/106精子者,二者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

精子DNA完整性反映精子DNA損傷的程度。相關研究表明DNA損傷超過一定閾值時,會影響正常受精、胚胎發(fā)育,導致流產(chǎn)率增加[24]。本研究中,ROC曲線分析精子DFI預測IVF受精率的cut-off值為27.50%,敏感性為68.40%,特異性為87.70%,且精子DFI與受精率呈負相關。此外,多項研究也表明精子DFI與受精率和胚胎質(zhì)量呈負相關[25-26]。

單因素分析提示精子頂體酶活性、正常形態(tài)精子百分率及精子DFI對IVF受精率均有影響,多因素聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn),三者聯(lián)合分析時其AUCROC最大,敏感性、特異性最高,預測效能較單一因素更好。因此可以通過前期檢測三項指標來預估患者的受精率以選擇合適的助孕方案來提高其成功率。

本中心在女方取卵日對男方精子采用的是密度梯度離心法和上游法優(yōu)選精子。在本研究中由于優(yōu)選后精子數(shù)量有限,并沒有對優(yōu)選后精子進行常規(guī)分析、精子形態(tài)學檢測、精子頂體酶活性及精子DFI等精子功能檢測,存在沒有對上述檢測指標進行優(yōu)選前后對比的不足,也沒有對優(yōu)選后精子相關參數(shù)與IVF受精率進行相關性分析,這是本研究的不足之處,在今后的研究中將進一步完善。