血性羊水細胞培養(yǎng)方法的改良與應用

黃道奇,涂華玉,童克婷,王朝紅,朱健生

(安徽醫(yī)科大學附屬安徽省婦幼保健院遺傳醫(yī)學中心,合肥 230011)

自從首次報道將羊水細胞染色體核型分析應用于胎兒染色體疾病的產前診斷以來,這一技術一直是產前診斷胎兒染色體疾病的金標準和核心項目[1-2]。但實際工作中,血性羊水包括混有新鮮血細胞的紅色羊水和以往有出血的褐色羊水中混有的血細胞會給胎兒脫落細胞的貼壁培養(yǎng)帶來困難,尤其是單獨的載玻片原位培養(yǎng)盒法(簡稱原位培養(yǎng)法)受影響更為明顯。鑒于此,本實驗室對于血性羊水采用塑料培養(yǎng)瓶和載玻片原位培養(yǎng)盒聯合培養(yǎng)法(簡稱聯合培養(yǎng)法),獲得了很好的成功率?，F總結分析如下。

1 資料和方法

1.1研究對象 收集2021年1月至2022年12月安徽省婦幼保健院遺傳中心行產前診斷孕婦的31例血性羊水樣本作為研究對象。產前診斷的指征包括35歲以上高齡孕婦、血清學產前篩查高風險、無創(chuàng)產前檢測(noninvasive prenatal test,NIPT)高風險、夫妻雙方中一方有染色體疾病、胎兒超聲軟指標異常及不良孕產史等。離心后肉眼可見鮮紅色沉淀的血性樣本為新鮮出血,褐色沉淀者為陳舊性出血。

1.2主要試劑與儀器 BIO AMF-2型羊水培養(yǎng)基(以色列BI公司)和15 mL無菌離心管(美國BD公司);CDS-5型染色體分散儀(美國Thermotron公司),Cytovision120型染色體核型分析工作站(德國Leica公司)。

1.3樣本采集 在孕16～27+6周時,產前診斷醫(yī)師在超聲引導下行羊膜腔穿刺,棄去最初的5 mL,再抽取胎兒羊水20 mL分裝于2個15 mL無菌離心管中。

1.4樣本培養(yǎng) 將兩管羊水580×g離心10 min,棄上清液后,留取約0.5 mL混懸細胞。血性羊水一管加入1 mL羊水培養(yǎng)基,吹打混勻后直接接種在原位載玻片上,編號1線;另一管加入4 mL羊水培養(yǎng)基,吹打混勻后接種至塑料培養(yǎng)瓶內,輕輕晃動使細胞懸液均勻平鋪,編號2線。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1線培養(yǎng)2天后,輕輕加入新鮮37 ℃預熱培養(yǎng)基3 mL,繼續(xù)培養(yǎng)。1周后,倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁生長情況,鏡下細胞集落中圓亮細胞較多時,超凈工作臺中吸出培養(yǎng)液,轉移至另一塑料培養(yǎng)瓶再加入新鮮培養(yǎng)基1 mL繼續(xù)傳代培養(yǎng)備用。1線原載玻片培養(yǎng)盒中加入3 mL新鮮培養(yǎng)基,2線塑料培養(yǎng)瓶中加入5 mL新鮮培養(yǎng)基。換液后,1線放回37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后收獲。2線血性羊水培養(yǎng)瓶倒置顯微鏡下標記細胞集落位置,超凈工作臺中將標記的細胞集落刮下,再轉移到載玻片原位培養(yǎng)盒中,3日后觀察、換液、收獲。載玻片原位培養(yǎng)盒中加入2滴秋水仙素(終濃度0.25 μg/mL),輕輕晃動混勻,37 ℃培養(yǎng)箱溫育30 min,傾斜培養(yǎng)盒,吸干培養(yǎng)液,加入37 ℃預熱低滲液(1%檸檬酸鈉)5 mL,37 ℃培養(yǎng)箱溫育30 min。棄低滲液,加入新鮮配制的預固定液(5%冰乙酸)5 mL,室溫7 min后棄掉,再加入新鮮配制的固定液(甲醇∶冰乙酸按體積比3∶1)5 mL,室溫固定10 min。固定2次后分散儀中將玻片從培養(yǎng)盒中取出,玻片四邊立在衛(wèi)生紙上,吸干殘留的固定液,玻片平鋪于分散儀中,分散條件:溫度21 ℃,濕度42%,分散15 min。再將玻片放入80 ℃烤箱2 h?？酒蟛Ｆ?7 ℃胰酶消化15 s,生理鹽水清洗終止胰酶反應,吉姆薩染液染色10 min。

徠卡Cytovision120分析系統(tǒng)掃描拍攝采集圖像,以人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN2016)G顯帶400條帶水平為標準對染色體核型進行分析,計數原位載玻片中至少5個克隆,分析5個細胞,核型配對2個細胞。達到此標準視為細胞培養(yǎng)成功。達到400條帶水平且各條染色體間無明顯重疊計為有效核型。

2 結果

2.1血性羊水標本類型 共納入3 408例羊水中的31例血性羊水,其中新鮮出血3例(9.7%),陳舊性出血28例(90.3%)。

2.2兩種培養(yǎng)方法成功率比較 新鮮出血羊水標本3例,使用原位培養(yǎng)法成功1例,失敗2例,成功率33.3%;聯合培養(yǎng)法3例均培養(yǎng)成功,成功率100%。

陳舊性出血羊水28例,運用原位培養(yǎng)法成功20例,失敗8例,成功率71.4%;運用聯合培養(yǎng)法的28例陳舊性出血羊水均培養(yǎng)成功,成功率100%。

31例血性羊水標本使用聯合培養(yǎng)法均培養(yǎng)成功,成功率100%;使用原位培養(yǎng)成功21例,成功率67.7%。兩種方法的培養(yǎng)成功率差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001),聯合培養(yǎng)法的成功率明顯高于單獨的原位培養(yǎng)法。

2.3兩種培養(yǎng)方法有效核型數比較 新鮮出血羊水標本3例,原位培養(yǎng)法平均有效核型數為8;聯合培養(yǎng)法的平均有效核型數為32。陳舊性出血羊水28例,原位培養(yǎng)法平均有效核型數為13;聯合培養(yǎng)法的平均有效核型數為53。聯合培養(yǎng)法的有效核型數明顯高于原位培養(yǎng)法,且陳舊性出血羊水標本的有效核型數高于新鮮出血羊水標本。

2.431例血性羊水核型結果 31例血性羊水核型分析發(fā)現,2例陳舊性出血羊水樣本核型結果為47,XXX,其余樣本核型結果均正常。

3 討論

羊水中胎兒脫落細胞貼壁培養(yǎng)及核型分析是產前診斷中的常規(guī)診斷方法,成功的羊水細胞培養(yǎng)是核型分析的基礎和前提。正常羊水的性狀是清亮、淡黃色,但在羊膜腔穿刺時偶爾會有血細胞混入羊水中,呈現鮮紅色羊水或在羊水離心后可見紅色沉淀。有學者曾統(tǒng)計新鮮出血羊水在羊水穿刺中的出現概率為2.76%[3],胎盤位置的影響、穿刺過程中胎兒突然的肢體動作、穿刺針碰到了臍帶或胎兒、穿刺時反復進針導致母體血流入羊膜腔中等因素均可導致羊水中混有新鮮血液。除了新鮮出血,日常我們還會遇到褐色羊水或在離心后肉眼可見的褐色沉淀,此為陳舊性出血羊水,該性狀的羊水與穿刺過程無關,此現象的出現原因是在羊膜腔穿刺前有過出血,但經過一段時間的吸收后,有血細胞碎片殘留在羊水中從而呈現出褐色羊水。血性羊水中混有的紅細胞和凝血因子的活性抑制胎兒脫落細胞的貼壁生長[4],而在離心收集沉淀過程中又無法將其分離,給細胞培養(yǎng)帶來困難,尤其對我們常用的原位培養(yǎng)法干擾更為明顯。

日常工作中我們發(fā)現原位培養(yǎng)法由于載玻片面積小,再受血細胞影響,克隆數較培養(yǎng)瓶法少許多,但收獲步驟簡單,無需轉管,收獲損失小;塑料培養(yǎng)瓶由于面積大,能夠貼壁生長的克隆較多[5],倒置顯微鏡下觀察發(fā)現培養(yǎng)瓶法血性羊水細胞貼壁的克隆數及細胞數明顯多于原位培養(yǎng)法,但培養(yǎng)瓶法收獲步驟繁瑣,需多次轉管,造成細胞的大量丟失耗損,最終有效核型數偏少[6]。鑒于此情況,我們結合兩種方法的優(yōu)點,對于難培養(yǎng)的血性羊水采用塑料培養(yǎng)瓶和載玻片原位培養(yǎng)盒聯合培養(yǎng)。聯合培養(yǎng)法增加了細胞刮取再培養(yǎng)的步驟,且原位培養(yǎng)法更易于真假嵌合的溯源與鑒別,所以本中心對血性羊水一線先使用培養(yǎng)瓶進行細胞接種,培養(yǎng)一周后顯微鏡下挑選克隆部位刮下細胞轉接至載玻片原位培養(yǎng)盒中,這樣可以在一定程度上將血細胞與羊水細胞分離,使接種到載玻片上的細胞更好地貼壁生長。而另一線我們仍采用原位培養(yǎng)法,也是考慮到原位培養(yǎng)法能夠鑒別真假嵌合的優(yōu)點[7-8],起到對照補充作用。

對本中心2021年1月至2022年12月3 408例羊水樣本回顧性分析發(fā)現,淡黃色清亮羊水載玻片原位培養(yǎng)法成功率為100%,原位培養(yǎng)法既保證了成功率、簡化了操作流程,又便于真假嵌合的鑒別,可以在正常性狀羊水中常規(guī)使用。3例新鮮出血羊水原位培養(yǎng)法成功率僅為33.3%,28例陳舊性出血羊水原位培養(yǎng)法成功率71.4%;而聯合培養(yǎng)法31例血性羊水均培養(yǎng)成功,成功率100%,且聯合培養(yǎng)法獲得的染色體分裂相可計數和可分析數均明顯高于單獨原位培養(yǎng)法,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。所以對于血性羊水,我們推薦一線原位培養(yǎng)法,一線聯合培養(yǎng)法,這樣既可以提高培養(yǎng)成功率,又可以保障結果的可溯源性。另外,31例血性羊水核型分析發(fā)現, 2例陳舊性出血羊水樣本核型結果為47,XXX。47,XXX綜合征又稱超雌綜合征,是一種性染色體異常綜合征,據報道47,XXX綜合征的發(fā)生率約為6.5/1 000[9],在28例陳舊性出血羊水中47,XXX占7.14%,高于該綜合征的發(fā)生率,目前還不能明確血性羊水與超雌綜合征的相關性,未來將增加樣本數量,進一步確定兩者是否有相關性。