精漿肉堿測(cè)定在男性生育力評(píng)估和弱精子癥療效監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用*

開(kāi)鈞,朱來(lái)晴,李敏環(huán),孫國(guó)海,周雪,汪珣,韓友峰,石亮

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院男科,南京 210008)

肉堿(carnitine),又稱(chēng)肉毒堿,是一種廣泛存在于肌肉和乳制品中的類(lèi)似于膽堿的小分子物質(zhì)。其中生物活性存在于L-肉堿(L-carnitine,LC),而D-肉堿則無(wú)生物活性[1]。作為長(zhǎng)鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)載體,L-肉堿的主要功能是促進(jìn)脂質(zhì)在線粒體內(nèi)發(fā)生β氧化,從而產(chǎn)生能量:長(zhǎng)鏈?；毾冉?jīng)肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1(carnitine palmitoyl transferase 1,CPT1)催化與肉堿形成酰基肉堿,再通過(guò)肉堿?；D(zhuǎn)位酶(carnitine-acylcarnitine translocase,CACT)進(jìn)入線粒體內(nèi)膜,最后由CPT2重新生成脂酰輔酶A[2]。當(dāng)飲食中缺乏肉堿時(shí),將導(dǎo)致代謝異常和內(nèi)分泌紊亂,因此保持適當(dāng)?shù)娜鈮A攝入十分重要。目前L-肉堿作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑廣泛添加于健身產(chǎn)品中[3]。

精漿是附睪及附睪性腺分泌物的混合物,對(duì)于精子的發(fā)生、新陳代謝和活力至關(guān)重要。其中約90%的肉堿來(lái)源于附睪,能夠促進(jìn)精子線粒體發(fā)生氧化磷酸化以獲取能量[4]。盡管附睪不能自身合成肉堿,但能從血漿中攝取大量游離態(tài)肉堿,使其濃度遠(yuǎn)高于血漿[5]。當(dāng)精漿肉堿水平偏低時(shí),精子線粒體內(nèi)脂肪酸β氧化減弱,活力降低,抗氧化能力下降,臨床表現(xiàn)為弱精子癥(精子活力低下)[6]。因此,精漿肉堿水平不僅能反映附睪功能,也可評(píng)估精子活力。

弱精子癥指精液量、精子濃度和精子形態(tài)等指標(biāo)正常但精子活力低下的病癥[7]。弱精子癥患者精漿中的肉堿含量顯著低于正常男性,但其檢測(cè)方法存在成本高、操作復(fù)雜、人為誤差大等缺點(diǎn)[8]。本研究采用檢測(cè)試劑盒(固定時(shí)間法)檢測(cè)正常男性和弱精子癥患者精漿中肉堿濃度,分析其與精子前向運(yùn)動(dòng)性(progressive motility,PR)的關(guān)系,旨在評(píng)估精漿肉堿能否作為反映精子活力和生育能力的新型指標(biāo)。前期研究發(fā)現(xiàn),外源性補(bǔ)充肉堿可明顯提高弱精子癥患者的精子活力,為臨床治療提供新思路。如Ma等[9]發(fā)現(xiàn)給予L-肉堿3個(gè)月后患者精漿肉堿水平顯著上升;Micic等[10]聯(lián)合給予L-肉堿和L-乙酰肉堿6個(gè)月后患者精子活力顯著改善;李偉等[11]發(fā)現(xiàn)體外向精液中加入L-肉堿后正常男性精子活力下降延緩,而弱精子癥患者精子活力則上升?；诖?本研究擬進(jìn)一步觀察弱精子癥患者在服用肉堿補(bǔ)充劑后,精漿肉堿水平和精子活力的變化情況。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 收集就診于南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院男科511例就診者的精液樣本,其中:(1)正?？捎行?03例(精子濃度≥15×106/mL,精液量≥1.5 mL,PR≥32%,正常形態(tài)精子百分率≥4%);(2)弱精子癥患者408例(精子濃度≥15×106/mL,精液量≥1.5 mL,PR<32%,正常形態(tài)精子百分率≥4%)。

1.2主要儀器與試劑 BS-350E全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞公司);精漿肉堿檢測(cè)試劑盒、精漿復(fù)合質(zhì)控品(南京欣迪生物藥業(yè)公司);左卡尼汀口服液(東北制藥公司)。

1.3方法

1.3.1精液樣本收集 所有精液樣本均通過(guò)手淫法(禁欲2～7天)獲得。將新鮮精液置于37 ℃水浴鍋內(nèi)溫育至完全液化,再進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3.2精液常規(guī)分析 參照WHO《人類(lèi)精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第6版),采用SSA-Ⅱ計(jì)算機(jī)輔助精子分析(CASA)系統(tǒng)(北京穗加公司)進(jìn)行精液分析。收集4～5個(gè)視野,計(jì)數(shù)≥200條精子,由軟件自動(dòng)識(shí)別并追蹤記錄精子運(yùn)動(dòng)軌跡,從而得出精子濃度和活動(dòng)精子百分率。室間質(zhì)控采用江蘇省婦幼健康研究會(huì)生殖檢驗(yàn)質(zhì)控中心提供的質(zhì)控品(每半年1次);室內(nèi)質(zhì)控采用本實(shí)驗(yàn)室自制非定值質(zhì)控品(每日1次)。

1.3.3精漿肉堿檢測(cè) 精漿L-肉堿檢測(cè)原理為肉堿在肉堿乙酰轉(zhuǎn)移酶催化下與乙酰輔酶A反應(yīng)生成輔酶A,輔酶A進(jìn)而與5,5′-二硫代-雙(2-硝基)苯甲酸發(fā)生顏色反應(yīng)生成具有最大吸收峰(400～420 nm)的5-巰基-2-硝基苯甲酸陰離子。通過(guò)測(cè)定不同濃度樣本的吸光度變化,即可計(jì)算出樣本中肉堿含量。取≥1 mL精液,3 000×g離心5 min后收集上層精漿。嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)配制工作液,利用試劑盒內(nèi)校準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每次檢測(cè)采用質(zhì)控品作為質(zhì)控。

1.3.4治療方法 弱精子癥患者服用左卡尼汀口服液[1 g肉堿(10 mL)/次,3次/日],連續(xù)30日為1個(gè)療程。

2 結(jié)果

2.1可育男性和弱精子癥患者精漿肉堿濃度的比較 見(jiàn)表1?？捎行越M和弱精子癥患者組的精液量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但弱精子癥患者組精子濃度、PR和精漿肉堿濃度均低于可育男性組(P均<0.05)。

表1 可育男性與弱精子癥患者精液常規(guī)參數(shù)和精漿肉堿濃度比較

表2 精漿肉堿與精子PR的一致性比較

2.3左卡尼汀治療對(duì)精漿肉堿及PR的影響 見(jiàn)表3。77例弱精子癥患者給予左卡尼汀口服溶液(1 g/次,3次/日,30日/療程)治療后,精漿肉堿濃度和PR均顯著升高(P均<0.01)。

表3 左卡尼汀治療前后PR和精漿肉堿濃度比較

3 討論

據(jù)WHO調(diào)查顯示,約有15%育齡夫婦存在不育問(wèn)題,其中男性因素約占一半[12]。精子活力能夠直接反映精子質(zhì)量,提示男性生育力強(qiáng)弱。弱精子癥指精子濃度正常,但PR低于32%。精子前向運(yùn)動(dòng)需要靠尾部的線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生動(dòng)力[13]。L-肉堿是線粒體膜上介導(dǎo)脂肪酸β氧化的關(guān)鍵載體,直接調(diào)控線粒體產(chǎn)能。當(dāng)精漿肉堿水平偏低時(shí),精子線粒體產(chǎn)能減少,精子活力降低,導(dǎo)致男性生育力下降[14]。

本研究采用精漿肉堿檢測(cè)試劑盒(固定時(shí)間法)檢測(cè)精漿肉堿發(fā)現(xiàn),弱精子癥組精漿肉堿含量顯著低于正?？捎行?且與PR呈高度一致性(Kappa=0.81),提示精漿肉堿水平可作為男性生育力評(píng)估的新型指標(biāo)。進(jìn)一步觀察到,服用L-肉堿后,弱精子癥患者精漿肉堿濃度和PR均顯著升高,說(shuō)明外源性補(bǔ)充肉堿有助于提高生育能力。

除了增強(qiáng)線粒體活力,肉堿的抗氧化特性也有利于改善精子質(zhì)量:(1)清除活性氧簇積累,緩解細(xì)胞DNA損傷[15];(2)阻斷線粒體凋亡通路,逆轉(zhuǎn)細(xì)胞命運(yùn)[16];(3)降低精液中氧化應(yīng)激水平[17-18];(4)抑制氧化應(yīng)激和自噬反應(yīng)等[19-20]。此外,商學(xué)軍等[21]發(fā)現(xiàn)L-肉堿還可改善精子DNA完整性,降低DNA碎片化指數(shù)(DNA fragmentation index,DFI)。然而,本研究未對(duì)精子氧化應(yīng)激水平進(jìn)行檢測(cè),這將在后續(xù)研究中開(kāi)展。

雖然肉堿在臨床上廣泛應(yīng)用于男性不育癥治療,但部分患者療效欠佳,反映其發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性。本研究建立了快速、準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)精漿肉堿的方法,為臨床上肉堿治療的個(gè)體化指導(dǎo)和療效評(píng)估提供了有力支持。