計算機輔助精子分析用精液樣本的稀釋條件及標準化研究*

伍細言,郝瑞龍,李維娜

(1.湖南省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心,長沙410008;2.湖南師范大學(xué)附屬光琇醫(yī)院,長沙410205;3.中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院男科學(xué)部,長沙410221)

在男性生殖和不育診療中,精液常規(guī)檢驗扮演著關(guān)鍵角色,對于臨床診療和患者滿意度至關(guān)重要。然而,在日常工作中,醫(yī)師經(jīng)常遇到高濃度精液樣本的挑戰(zhàn)。根據(jù)WHO《人類精液檢查和處理實驗室手冊》(第5版和第6版),當使用20 μm深計數(shù)板時,如果精子濃度超過50×106/mL,應(yīng)使用自身精漿進行稀釋,以確保計算機輔助精子分析(CASA)系統(tǒng)分析結(jié)果的準確性[1-2]。然而,國內(nèi)調(diào)查顯示高達76%(57/75)的實驗室使用10 μm深計數(shù)板[3]且部分樣本精液量較少,無法獲取自身精漿進行稀釋。

有學(xué)者建議,對于無法使用自身精漿稀釋且精子濃度超過100×106/mL的樣本,可以使用生理鹽水1∶3稀釋后檢測[4]。國內(nèi)生殖檢驗專家也推薦,當精子濃度高于100×106/mL時,可用生理鹽水代替自身精漿稀釋[5]。吳穎等[6]研究顯示,健康男性精子濃度的第50百分位數(shù)(P50)為64×106/mL,即超過一半樣本需要常規(guī)稀釋。鑒于目前使用的計數(shù)板深度與WHO推薦存在差異,加之需要稀釋的精液樣本比例較高,制定符合中國國情的實驗室標準迫在眉睫。因此,我們在使用10 μm深計數(shù)板的條件下,開展針對無法使用自身精漿稀釋的高濃度精液樣本,使用生理鹽水稀釋后進行CASA檢測的研究,旨在為國內(nèi)男科實驗室準確檢驗高濃度精液樣本提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1樣本來源 選取2022年4月于中信湘雅生殖與遺傳專科醫(yī)院就診的男性患者,常規(guī)檢測后剩余精液樣本201例,所有樣本精子濃度≥15×106/mL。

1.2樣本采集 要求患者禁欲2～7天,采用手淫法將全部精液射于清潔干燥的取精杯中。將采集的精液樣本及時送至實驗室,置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)利用溫浴法使之液化。

1.3樣本檢測 采用賽司SAS-Ⅱ型精子質(zhì)量分析儀檢測精子濃度、前向運動精子百分率(PR)、非前向運動精子百分率(NP)、精子活動率(PR+NP)和不活動精子百分率(IM)等精液常規(guī)參數(shù)。儀器采用直線速率(straight-line velocity,VSL)對精子運動進行分類:VSL≥15 μm/s為前向運動(PR),5 μm/s≤VSL<15 μm/s為非前向運動(NP),VSL<5 μm/s為不活動(IM)。使用10 μm深度SC-Ⅳ一次性精子檢測板(北京賽司公司)計數(shù),經(jīng)驗證計數(shù)池深度誤差≤1 μm,視野內(nèi)無雜質(zhì),滿足質(zhì)量要求。

1.4精子濃度及活力檢驗 每日使用乳膠質(zhì)控珠QC-BeadsTM(美國Bioscreen公司)進行2個不同水平精子濃度質(zhì)控,變異系數(shù)均<5%。待精液充分液化后,用移液器吸取3 μL加樣至一次性檢測板。當精子濃度≤50×106/mL時,則不稀釋,按WHO標準重復(fù)計數(shù)2次;當精子濃度(n)>50×106/mL時,按1∶[n/(50×106)]的比例用生理鹽水稀釋至<50×106/mL,即1份(100 μL)精液加n/(50×106)×100 μL生理鹽水稀釋,充分混勻后立即(1 min內(nèi))檢驗,盡可能減少對精子活力的影響。每份高濃度樣本,稀釋前后均檢測精子濃度、PR+NP、PR、NP和IM等。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 27.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。對精子濃度<50×106/mL(組1,未稀釋組)、50×106/mL≤精子濃度<100×106/mL(組2)、精子濃度≥100×106/mL(組3)的精液參數(shù)(精子濃度、PR+NP、PR、NP、IM)進行正態(tài)性檢驗。利用改良Bland-Altman圖評估稀釋前后一致性,使用Kruskal-Wallis檢驗比較3組數(shù)據(jù)差異,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。繪制ROC曲線,確定最佳稀釋閾值。

2 結(jié)果

2.1稀釋前后精液參數(shù)的分布情況 未稀釋組(組1,精子濃度<50×106/mL)、50×106/mL≤濃度<100×106/mL組(組2)和濃度≥100×106/mL組(組3)均呈非正態(tài)分布,各組稀釋前后精液參數(shù)的分布情況見表1、2。

表1 精液樣本稀釋前精液參數(shù)分布情況[M(P25,P75)]

表2 精液樣本稀釋后精液參數(shù)分布情況[M(P25,P75)]

注:A為精子濃度的一致性;B為精子活力參數(shù)的一致性。

表3 稀釋前后精液參數(shù)可接受結(jié)果

表4 精液參數(shù)Z或值與精液稀釋前精子濃度的相關(guān)性

2.4ROC曲線分析 根據(jù)稀釋前后精子濃度、PR+NP、PR、NP、IM的可接受度,繪制ROC曲線預(yù)測高濃度精液樣本的最佳稀釋閾值,見表5。5個指標單獨判斷時均具有一定預(yù)測價值(P均<0.05)。其中,精子濃度預(yù)測的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.694(95%CI:0.582～0.806),最佳稀釋閾值為133.05×106/mL,此時特異性最高(0.887);NP預(yù)測的AUCROC為0.742(95%CI:0.666～0.818),最佳稀釋閾值為90.90×106/mL,此時敏感性最高(0.771)。精子濃度和NP兩項聯(lián)合預(yù)測價值最高,AUCROC為0.900(95%CI:0.796～1.000)。

表5 精液參數(shù)的可接受度判斷高濃度精液樣本最佳稀釋閾值的價值

3 討論

《醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室管理辦法》要求實驗室檢驗結(jié)果須準確可靠。目前國內(nèi)92%生殖檢驗實驗室采用CASA進行精液檢測[3],其合適檢測范圍應(yīng)盡可能涵蓋大部分臨床樣本。然而,CASA在檢驗高濃度樣本時,由于精子重疊、碰撞等原因,CASA系統(tǒng)無法精確識別部分精子,導(dǎo)致檢測結(jié)果低于實際值[7]。

與WHO第5版推薦使用20 μm深計數(shù)板不同,國內(nèi)生殖檢驗實驗室多采用10 μm深Makler計數(shù)板(50.67%)、10 μm深一次性計數(shù)板(25.33%),遠高于使用20 μm深計數(shù)板(10.67%)[6]。理論上,使用10 μm深計數(shù)板時,其精子重疊和碰撞概率是20 μm計數(shù)板的1/2[7]。研究表明,當視野內(nèi)精子數(shù)控制在50～150個時,CASA表現(xiàn)出較高的準確性[8]。

本研究考慮了計數(shù)板深度對CASA檢測精子濃度范圍的影響,解釋了我們預(yù)測的稀釋閾值與WHO第5版和第6版推薦的稀釋標準存在差異的原因,結(jié)果有助于制定符合國情的精液檢測標準。