創(chuàng)傷后深靜脈血栓形成遺傳危險(xiǎn)因素的全基因組關(guān)聯(lián)分析

章文潔,蘇玉,盧山,陳玉瑩,曹翔宇,劉蕾,楊麗,吳俊,

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京積水潭醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心,北京100035;2.北京大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心,北京100035;3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院檢驗(yàn)科,武漢430077;4.中國(guó)科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院,重慶400714)

創(chuàng)傷是40歲以下年輕人死亡的主要原因之一,約占世界范圍內(nèi)死亡人數(shù)的1/10[1-2]。靜脈血栓栓塞(venous thromboembolism,VTE)包括深靜脈血栓形成(deep vein thrombosis,DVT)和肺栓塞,是創(chuàng)傷24 h后存活患者的第三大死亡原因[1,3]。研究發(fā)現(xiàn),創(chuàng)傷性下肢骨折患者VTE發(fā)生率高,約為10%～60%[4-6]。然而,創(chuàng)傷性下肢骨折后DVT的發(fā)生機(jī)制尚不清楚,故闡明其機(jī)制對(duì)預(yù)測(cè)和診斷DVT具有重要意義。

創(chuàng)傷性下肢骨折后DVT的發(fā)生受環(huán)境因素和遺傳因素的影響[7-8]。下肢骨折患者臥床時(shí)血流減慢,研究表明停滯血液中抗凝因子含量低于流動(dòng)血液[9-10]。內(nèi)皮細(xì)胞可釋放纖溶酶原激活劑抑制物,抑制纖溶[11]。血液停滯導(dǎo)致靜脈回流減少,帶給內(nèi)皮細(xì)胞的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少[12],在缺血缺氧條件下,內(nèi)皮細(xì)胞壞死,加速血栓形成。此外,既往研究發(fā)現(xiàn)一些遺傳變異與DVT密切相關(guān)[7],如蛋白C、蛋白S和抗凝血酶的遺傳缺陷[13-15],FV Leiden突變[16],凝血酶原20210A突變[16]。ABO血型基因也與血栓易感性相關(guān),非O型血人群比O型血人群具有更高的血栓風(fēng)險(xiǎn)[17]。盡管一些研究已明確了部分與DVT相關(guān)的基因缺陷,但尚無(wú)研究報(bào)道可能增加創(chuàng)傷性下肢骨折后DVT風(fēng)險(xiǎn)的特定基因變異。

隨著適用于高通量和大數(shù)據(jù)的新型DNA分析技術(shù)的發(fā)展,全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome wide association study,GWAS)將流行病學(xué)研究設(shè)計(jì)與分子遺傳分析技術(shù)相結(jié)合,用于發(fā)現(xiàn)與表型相關(guān)的基因組位點(diǎn)上的單核苷酸多態(tài)性或變異。本研究應(yīng)用GWAS篩選創(chuàng)傷性下肢骨折后術(shù)前DVT的遺傳危險(xiǎn)因素。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 本研究對(duì)創(chuàng)傷性下肢骨折患者進(jìn)行巢式病例對(duì)照研究。納入2019年5月至2019年9月北京積水潭醫(yī)院382例創(chuàng)傷性下肢骨折患者。納入標(biāo)準(zhǔn)為創(chuàng)傷性下肢骨折患者的年齡≥18歲;下肢骨折包括髖部骨折、股骨干骨折、股骨遠(yuǎn)端骨折、髕骨骨折、脛骨平臺(tái)骨折、脛腓骨骨干骨折、踝關(guān)節(jié)骨折和足部骨折。排除標(biāo)準(zhǔn)為活動(dòng)性炎癥、癌癥、妊娠、自身免疫病及未進(jìn)行靜脈造影檢查。創(chuàng)傷性下肢骨折患者于術(shù)前行靜脈造影檢查,以診斷是否發(fā)生DVT;共50例創(chuàng)傷性下肢骨折患者發(fā)生DVT,進(jìn)而在332例非DVT患者中隨機(jī)選擇50例與DVT患者的年齡、性別、骨折部位相匹配的對(duì)照。最后,將50例創(chuàng)傷性下肢骨折后發(fā)生DVT患者和50例未發(fā)生DVT患者納入分析。自入院之日起,兩組患者均每日皮下注射40 mg的依諾肝素。本研究已獲得北京積水潭醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào):201904-06)。

1.2樣本采集與處理 收集創(chuàng)傷性下肢骨折患者急診入院時(shí)的血液樣本。抽取患者靜脈全血分別至含有EDTA-K2和0.109 mol/L枸櫞酸鈉的抗凝管(美國(guó)BD公司)中,輕輕顛倒混勻。將枸櫞酸鈉抗凝全血在室溫下1 500×g離心15 min,上層血漿即為乏血小板血漿(platelet-poor plasma,PPP)。

1.3方法 用Sysmex XT4000i分析儀(日本Sysmex公司)檢測(cè)EDTA-K2抗凝全血樣本的血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和血小板計(jì)數(shù)。用Sysmex CS2100i分析儀(日本Sysmex公司)檢測(cè)PPP樣本的D-二聚體濃度。

基因組DNA提取由北京艾吉泰康公司進(jìn)行,按照QIAamp 全血DNA提取試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)說(shuō)明書所示操作步驟,提取EDTA-K2抗凝全血中白細(xì)胞的基因組DNA。用Qubit 3.0檢測(cè)提取后DNA樣本的濃度,用Nanodrop檢測(cè)提取后DNA樣本的純度。當(dāng)濃度>20 ng/μL,且A260 nm/A280 nm為1.7～2.0、A260 nm/A230 nm>2.0,則視為DNA質(zhì)量合格。通過(guò)Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行全外顯子測(cè)序。測(cè)序后獲得的原始數(shù)據(jù)通過(guò)質(zhì)檢、過(guò)濾、比對(duì)、注釋,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

對(duì)于GWAS分析,用R語(yǔ)言分析表型數(shù)據(jù),用Plink分析基因型數(shù)據(jù)。首先,分析興趣基因區(qū)域的單核苷酸變異(single nucleotide variant,SNV)與表型之間的相關(guān)性。采用單因素統(tǒng)計(jì)分析比較DVT組和非DVT組的性別、年齡、創(chuàng)傷距離入院時(shí)間等因素的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用BCFtools過(guò)濾掉非雙等位基因變異、有缺失的基因型變異、次等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)<5% 的 變 異。設(shè)定閾值為R2<0.8,采用Plink對(duì)基因型進(jìn)行連鎖不平衡(linkage disequilibrium,LD)剪切。但剪切后的基因型組中仍存在大量LD。繼而,用RSpectra的eigs_sym函數(shù)對(duì)相關(guān)基因型矩陣進(jìn)行特征分解,用correlateR的cor函數(shù)生成相關(guān)矩陣,采用R-rrBLUP進(jìn)行GWAS及數(shù)據(jù)的可視化。

其次,分析興趣基因與表型之間的相關(guān)性。從基于GFF3文件的hg19中查詢興趣基因位點(diǎn)。用BEDtools的intersect函數(shù)挑選位于上述興趣基因區(qū)域的變異,并用SnpEff 預(yù)測(cè)每種變異對(duì)基因型的影響。為了評(píng)估基因型和表型之間的關(guān)系,本研究假設(shè)每個(gè)基因的變異效應(yīng)一致。繼而,采用廣義線性混合模型(generalized linear mixed model,GLMM)分析基因型與表型之間的相關(guān)性。用lme4的glmer函數(shù)進(jìn)行GLMM分析,并用pbkrtest的PBmodcomp函數(shù)評(píng)估完整模型與簡(jiǎn)化模型在GLMM分析中的效果。用ggplot2進(jìn)行數(shù)據(jù)的可視化。

2 結(jié)果

2.1研究對(duì)象的人口學(xué)特征和臨床數(shù)據(jù) 創(chuàng)傷性下肢骨折后發(fā)生DVT和未發(fā)生DVT患者的人口學(xué)特征和臨床數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。非DVT組僅高血壓病史人數(shù)略多于DVT組(P=0.006),其他特征參數(shù)在兩組之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

表1 DVT患者和非DVT患者的人口學(xué)特征和臨床數(shù)據(jù)

2.2SNVs與表型的相關(guān)性分析 為排除性別、年齡、創(chuàng)傷距離入院時(shí)間等因素對(duì)DVT的個(gè)體差異影響,入選上述因素相互匹配的DVT患者和非DVT患者,故只將創(chuàng)傷性下肢骨折后DVT發(fā)生和D-二聚體水平等表型性狀進(jìn)行GWAS。

首先,本研究共納入分析2 662個(gè)SNVs,包括89個(gè)結(jié)構(gòu)性變異和2 573個(gè)非結(jié)構(gòu)性變異。其中,89個(gè)結(jié)構(gòu)性變異被排除,不用于GWAS分析;2 573個(gè)非結(jié)構(gòu)性變異中包含1 897個(gè)MAF<5%的罕見(jiàn)非結(jié)構(gòu)變異,因其會(huì)對(duì)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果造成嚴(yán)重偏倚,故也被排除。最后,應(yīng)用GWAS評(píng)估676個(gè)SNVs與表型之間的相關(guān)性。

如圖1所示,應(yīng)用GWAS評(píng)估676個(gè)SNVs與創(chuàng)傷性下肢骨折后DVT之間的相關(guān)性。結(jié)果表明,共27個(gè)SNVs與創(chuàng)傷性下肢骨折后DVT發(fā)生顯著相關(guān)。其中,5個(gè)SNVs位于非基因區(qū),其余22個(gè)SNVs位于10個(gè)基因區(qū),分別為ARPC1A、KCND3、HLA-DPA2、KDM5A、C1org198、PTPRT、FAM13A、TMEM2556、AL365295、ZNF234。這22個(gè)SNVs中,8個(gè)SNVs位于假基因區(qū),13個(gè)SNVs位于基因內(nèi)含子區(qū),僅chr19:44156472位于ZNF234的外顯子區(qū)。

注:紅點(diǎn)表示與創(chuàng)傷性下肢骨折后術(shù)前DVT發(fā)生顯著相關(guān)的SNVs,每個(gè)點(diǎn)代表1個(gè)SNV,所有的點(diǎn)均根據(jù)其在基因組中位置而繪制。圖中y軸數(shù)值是將P值轉(zhuǎn)換為-lg計(jì)算而得。

進(jìn)而,應(yīng)用GWAS評(píng)估676個(gè)SNVs與創(chuàng)傷性下肢骨折后D-二聚體水平之間的相關(guān)性,如圖2所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn),共21個(gè)SNVs與創(chuàng)傷性下肢骨折后D-二聚體水平顯著相關(guān)。其中,10個(gè)SNVs位于非基因區(qū),其余11個(gè)SNVs位于7個(gè)基因區(qū),分別為ZAN、CES5A、LINC00661、LOC107986845、SLC01A2、RFX7、ZNF234。這11個(gè)SNVs中,8個(gè)SNVs位于基因內(nèi)含子區(qū),3個(gè)SNVs位于基因外顯子區(qū),分別是chr19:16023377和 chr19:16023464位于LINC00661的外顯子區(qū),chr19:44156472位于ZNF234的外顯子區(qū)。

注:紅點(diǎn)表示與創(chuàng)傷性下肢骨折后D-二聚體水平顯著相關(guān)的SNVs,每個(gè)點(diǎn)代表1個(gè)SNV,所有的點(diǎn)均根據(jù)其在基因組中位置而繪制。圖中y軸數(shù)值是將P值轉(zhuǎn)換為-lg計(jì)算而得。

2.3興趣基因與表型的相關(guān)性分析 上述分析的2 662個(gè)SNVs位于144個(gè)興趣基因中,包括與血栓形成相關(guān)的基因和抗栓藥物代謝相關(guān)的基因,其中1 614個(gè)SNVs位于92個(gè)與血栓形成相關(guān)的基因中。繼而,本研究應(yīng)用GWAS分別評(píng)估92個(gè)興趣基因與創(chuàng)傷性下肢骨折后DVT發(fā)生和D-二聚體水平的相關(guān)性。

如表2所示,GWAS發(fā)現(xiàn)10個(gè)基因與創(chuàng)傷性下肢骨折后DVT發(fā)生顯著相關(guān),分別為F5(P=0.022)、THBD(P=0.040)、SERPIND1(P=0.020)、ITGA2(P=0.021)、CALU(P=0.021)、GGCX(P=0.022)、CYP3A4(P=0.039)、CYP2C19(P=0.020)、CYP1A1(P=0.020)、CYP2B6(P=0.023)。另外,GWAS結(jié)果表明6個(gè)基因與創(chuàng)傷性下肢骨折后D-二聚體水平顯著相關(guān),如表3所示,分別為FGB(P=0.021)、F13A1(P=0.021)、CALU(P=0.020)、GGCX(P=0.045)、NQO1(P=0.022)、CYP2D6(P=0.020)。

表2 與創(chuàng)傷性下肢骨折后DVT發(fā)生相關(guān)的基因

表3 與創(chuàng)傷性下肢體骨折后D-二聚體水平相關(guān)的基因

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)THBD、F5、SERPIND1、ITGA2與創(chuàng)傷后DVT發(fā)生顯著相關(guān),表明止血機(jī)制輔因子可能是創(chuàng)傷性下肢骨折后DVT發(fā)生的重要影響因素。THBD編碼的血栓調(diào)節(jié)蛋白(Thrombomodulin,TM)位于內(nèi)皮細(xì)胞表面,與凝血酶形成復(fù)合物后,可將蛋白C轉(zhuǎn)化為活化蛋白C(activated protein C,APC),發(fā)揮抗凝功能。TM功能受損或表達(dá)減低,可引起凝血功能異常,導(dǎo)致血栓栓塞性疾病[18]。Sugiyama等[19]報(bào)道THBD中含有2729>C和A455V錯(cuò)義的單倍型突變,會(huì)影響可溶性TM水平,可能與日本人群的DVT發(fā)生相關(guān)。F5編碼的FⅤ是活化FⅩ的關(guān)鍵輔因子。研究表明,F5基因突變可導(dǎo)致APC對(duì)FⅤ的滅活能力減弱,抗凝活性下降,造成血液高凝狀態(tài)[20]。SERPIND1編碼的肝素輔因子Ⅱ(heparin cofactor Ⅱ,HCⅡ),在糖胺聚糖、肝素或硫酸皮膚素存在時(shí),可取代抗凝血酶成為主要的凝血酶抑制劑。Blinder等[21]報(bào)道Arg-189突變可造成HCⅡ功能異常。Corral等[22]發(fā)現(xiàn)HCⅡ缺乏在血栓形成中發(fā)揮重要作用。ITGA2編碼的整合素α2在血小板表面又稱糖蛋白Ⅰa,是層粘連蛋白、膠原、膠原C-前肽、纖維連接蛋白和鈣粘蛋白E的受體,在血小板和其他細(xì)胞與膠原的粘附中起重要作用[23],而膠原作為血小板活化的強(qiáng)誘導(dǎo)劑之一,參與血栓形成的發(fā)生和發(fā)展[24]。

本研究發(fā)現(xiàn)FGB和F13A1與創(chuàng)傷性下肢骨折后D-二聚體水平顯著相關(guān)。F13A1和FGB分別編碼FA鏈和纖維蛋白原β鏈。F被凝血酶和鈣離子活化,催化纖維蛋白鏈中γ-谷氨酰-ε-賴氨酸交聯(lián)的形成,從而穩(wěn)定纖維蛋白凝塊[25]。纖維蛋白原β鏈與α、γ鏈一起被凝血酶裂解為單體,成為血栓凝塊的主要成分之一,在血栓形成中發(fā)揮重要作用。

VKD羧化對(duì)某些蛋白維持生理功能至關(guān)重要。目前數(shù)種凝血因子已被認(rèn)定為VKD羧化蛋白,包括促凝蛋白(如FⅦ、FⅨ、FⅩ等)和抗凝蛋白(如蛋白C、蛋白S、蛋白Z)等[26]。本研究發(fā)現(xiàn)3個(gè)VKD羧化相關(guān)因子與創(chuàng)傷后DVT發(fā)生和D-二聚體水平顯著相關(guān),分別是GGCX、CALU、NQO1,分別編碼VKD γ-羧化酶、網(wǎng)腔鈣結(jié)合蛋白、NAD(P)H 醌氧化還原酶1。網(wǎng)腔鈣結(jié)合蛋白參與對(duì)多個(gè)N端谷氨酸殘基VKD羧化的調(diào)控,發(fā)揮抑制γ-羧化酶的作用[27]。NAD(P)H 醌氧化還原酶1參與解毒和生物合成過(guò)程中對(duì)苯二酚偶聯(lián)反應(yīng),如合成凝血酶原時(shí)谷氨酸殘基的VKD γ-羧化[28]。

本研究結(jié)果顯示,部分細(xì)胞色素P450家族成員與創(chuàng)傷性下肢骨折后DVT發(fā)生和D-二聚體水平顯著相關(guān),分別為CYP1A1、CYP3A4、CYP2C19、CYP2B6、CYP2D6,分別編碼細(xì)胞色素P450 1A1、P450 3A4、P450 2C19、P450 2B6、P450 2D6。上述分子均參與多種內(nèi)源性物質(zhì)的代謝,如花生四烯酸、二十碳五烯酸、類固醇激素、甾醇、類視黃醇和維生素等[29-31]。細(xì)胞色素P450 1A1可將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為環(huán)氧二十碳三烯酸的區(qū)域異構(gòu)體,作為脂質(zhì)代謝介質(zhì)參與心血管系統(tǒng)的生理功能和病理變化[30]。細(xì)胞色素P450 2C19負(fù)責(zé)多種治療藥物的代謝,如氯吡格雷。細(xì)胞色素P450 2B6參與外源性物質(zhì)的氧化代謝,如植物脂類和藥物[32]。

創(chuàng)傷性下肢骨折患者具有較高的DVT發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),但其機(jī)制尚未被闡明。依據(jù)文獻(xiàn)所述,遺傳因素在創(chuàng)傷后DVT的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。結(jié)合本研究結(jié)果可知,創(chuàng)傷性下肢骨折后DVT發(fā)生可能受止血機(jī)制輔因子、VKD羧化相關(guān)因子和細(xì)胞色素P450家族成員的調(diào)控。本研究為創(chuàng)傷后深靜脈血栓的遺傳易感性提供了價(jià)值信息。

然而,本研究仍存在局限性。首先,需要納入更大的樣本人群,來(lái)驗(yàn)證本研究結(jié)果中與表型具有強(qiáng)相關(guān)性的變異,以便發(fā)現(xiàn)更多與表型具有中等強(qiáng)度相關(guān)性的變異。此外,本研究所納入的創(chuàng)傷患者均為中國(guó)人。眾所周知,遺傳易感性與種族多樣性密切相關(guān),故本研究結(jié)論的推廣僅限于中國(guó)人群。因此,本研究需要納入其他種族人群,以進(jìn)行下一步研究。