1例c.1117C>T/c.7288-9T>G復(fù)合雜合突變所致血管性血友病家系的發(fā)病機(jī)制分析

譚忠州,陸遙,苗林子,李園園,朱梓靜,宋一楠,龔巖,屈晨雪

(北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京100034)

血管性血友病(von Willebrand disease, vWD)是一種以血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)數(shù)量或質(zhì)量缺陷為特征的常見(jiàn)遺傳性出血性疾病。vWF是由內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞合成的多聚體糖蛋白[1-2]。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷時(shí),在高血流剪切力作用下vWF可介導(dǎo)血小板與內(nèi)皮下膠原的黏附,此外vWF還可作為血漿FⅧ的載體,保護(hù)其不被血漿中的絲氨酸蛋白酶(如蛋白酶C)水解,延長(zhǎng)其半衰期[3]。因此vWF功能缺陷患者主要臨床表現(xiàn)為自發(fā)性皮膚黏膜出血、拔牙或術(shù)后過(guò)度出血。

根據(jù)國(guó)際血栓與止血委員會(huì)(International Society on Thrombosis and Haemostasis, ISTH)的建議可將vWD分為1型(vWF數(shù)量部分缺乏)、2型(vWF質(zhì)量或數(shù)量缺乏)和3型(vWF數(shù)量完全缺乏)。其中2型vWD又可進(jìn)一步分為2A型(vWF高分子多聚體減少或缺乏)、2B型(vWF和血小板親和力增加)、2M型(vWF和血小板或膠原結(jié)合能力減低)和2N型(vWF與FⅧ結(jié)合能力減低)[4]。vWD診斷是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,需要收集患者及家系的出血史并進(jìn)行多種檢測(cè),包括止血篩查試驗(yàn)、vWD診斷實(shí)驗(yàn)和分型試驗(yàn)。

本研究將對(duì)臨床1例可疑vWD患者及其家系進(jìn)行診斷,并采用全外顯子組測(cè)序和生物信息學(xué)等方法探討該家系的發(fā)病機(jī)制,為探尋更好的臨床診斷、治療路徑和方案提供更多理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1對(duì)象 先證者(Ⅲ1),女,13歲,自3歲起易發(fā)生自發(fā)性鼻黏膜出血,每天1～2次,持續(xù)約30分鐘,不易止血。先證者的母親(Ⅱ4)磕碰后皮膚易形成瘀斑,哥哥(Ⅲ2)和父親(Ⅱ3)無(wú)明顯出血表現(xiàn)。父親家族無(wú)手術(shù)史、家族史,先證者的外婆(Ⅰ3)易發(fā)生牙齦出血(見(jiàn)圖1)。

注:,vWF:c.7288-9T>G雜合突變;,vWF:c.1117C>T雜合突變;,vWF:c.1117C>T雜合突變;,vWF:c.1117C>T和c.7288-9T>G雜合突變;□,男性;○,女性;,先證者。

本研究涉及1個(gè)患者家系共4人,通過(guò)北京大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審核[批準(zhǔn)文號(hào):(2019)科研第(47)號(hào)]。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集與處理 收集先證者及其家系成員0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝血、 1.8 mg/mL乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝血及惰性分離膠促凝血。其中EDTA-K2抗凝血用于全血細(xì)胞分析、鏡下血小板形態(tài)檢查及外周血基因組DNA提取。惰性分離膠促凝血用于免疫球蛋白IgA、IgG、IgM及生化全項(xiàng)檢查。枸櫞酸鈉抗凝血用于活化部分凝血酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time APTT)、凝血酶原時(shí)間(prothrombin time, PT)、纖維蛋白原定量(fibrinogen concentration, Fib-C)、凝血酶時(shí)間(thrombin time,TT)、D-二聚體及纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物(fibrin or fibrinogen degradation products,FDPs)分析以及vWF活性(vWF activity, vWF:Ac)、vWF抗原(vWF:Ag)、凝血因子Ⅷ活性(factor Ⅷ activity, FⅧ:C)、vWF瑞斯托霉素輔因子試驗(yàn)(vWF ristocetin co-factor,vWF:RCo)、瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板凝集試驗(yàn)(restocetin-induced platelet aggragation,RIPA)、vWF膠原結(jié)合試驗(yàn)(vWF collagen binding assays, vWF:CB)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)室檢查 用BC-6800Plus血細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞公司)進(jìn)行全血細(xì)胞分析;ACL-TOP700全自動(dòng)血凝分析儀(西班牙沃芬公司)進(jìn)行APTT、PT、Fib-C、TT、FDP、vWF:Ac及vWF:Ag檢測(cè);用CS2000i分析儀(日本希森美康公司)檢測(cè)FⅧ:C;用日立H7600-4全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行生化全項(xiàng)檢查;采用IMAGE800特種蛋白分析儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)進(jìn)行免疫球蛋白IgG、IgA和IgM檢測(cè);采用LBY-NJ14血小板聚集儀(中國(guó)泰利康信公司)進(jìn)行RIPA、vWF:RCo試驗(yàn),瑞斯托霉素購(gòu)自美國(guó)Chrono-log公司;vWF:CB采用ZYMUTESTTMvWF:CBA試劑盒(法國(guó)HYPHEN BioMed公司)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3全血基因組DNA提取 采用Lab-Aid 824核酸提取Midi試劑盒(廈門(mén)致善公司)提取先證者及其家系成員的EDTA-K2抗凝全血基因組DNA。

1.2.4基因檢測(cè)及分析 提取的先證者及其家系成員的外周血基因組DNA進(jìn)行全外顯子組測(cè)序分析并對(duì)發(fā)現(xiàn)的vWF基因突變位點(diǎn)采用一代測(cè)序方法進(jìn)行驗(yàn)證。采用MutationTaster、CADD、SIFT和PolyPhen-2以及NetGene2等生物信息分析工具預(yù)測(cè)基因突變位點(diǎn)的致病性。

2 結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)檢查結(jié)果

2.1.1常規(guī)檢查 血常規(guī)、生化常規(guī)、免疫球蛋白(IgA、M和G)等常規(guī)實(shí)驗(yàn)檢查及鏡下血小板形態(tài)分析,先證者及家系成員未見(jiàn)明顯異常。除先證者APTT 37.8 s為輕度延長(zhǎng)外,家系其他成員(父親、母親及哥哥)結(jié)果均正常,Fib-C、PT、TT及FDP檢測(cè)先證者及家系成員結(jié)果均正常,見(jiàn)表1。

表1 先證者及其家系常規(guī)凝血結(jié)果

2.1.2vWD相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢查 FⅧ:C先證者在參考區(qū)間的偏低水平,家系其他成員(父親、母親及哥哥)均正常。先證者vWF:Ag為27.6%,明顯減低,哥哥為48.6%,輕度減低,父親和母親均正常。與正常對(duì)照相比,先證者及家系成員的vWF:Ac、vWF:CB均有不同程度減低,其中先證者(14%、10.37%)減低最為顯著。先證者、哥哥及父親vWF:RCo均有不同程度減低。1.25 mg/mL RIPA試驗(yàn)顯示先證者(12%)及哥哥(45%)均減低,且1.0 mg/mL瑞斯托霉素誘導(dǎo)下RIPA試驗(yàn)先證者及其家系成員均減低,見(jiàn)表2。

表2 先證者及其家系vWF相關(guān)檢查結(jié)果

2.2基因突變分析結(jié)果

2.2.1DNA測(cè)序結(jié)果 全外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn)先證者存在vWF基因編碼區(qū)(轉(zhuǎn)錄本號(hào):NM_000552)第7 288號(hào)核苷酸前內(nèi)含子(42號(hào)內(nèi)含子)中倒數(shù)第9位氨基酸由T突變?yōu)镚(c.7288-9T>G)、第1 117號(hào)核苷酸由C突變?yōu)門(mén)(c.1117C>T)的復(fù)合雜合突變,父親vWF基因存在c.7288-9T>G雜合突變,母親和哥哥vWF基因均存在c.1117C>T雜合突變(表3、圖2、圖3)。

表3 先證者及家系成員的臨床特征與基因分析結(jié)果

注:A為父親,野生型;B為母親,雜合突變型;C為先證者,雜合突變型;D為哥哥,雜合突變型。

注:A為父親,雜合突變型;B為母親,野生型;C為先證者,雜合突變型;D為哥哥,野生型。

2.2.2生物信息學(xué)分析結(jié)果 采用NetGene2、NNSplice、FSPLICE和MaxEntScan對(duì)vWF基因c.7288-9T>G突變進(jìn)行剪切位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析,突變前(后)預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)分別為0.81(0.19)、0.88(0.54)、剪切位點(diǎn)正常(剪切位點(diǎn)破壞)和-4.17(-11.12),見(jiàn)表4。

表4 vWF基因突變位點(diǎn)致病性預(yù)測(cè)

3 討論

本研究報(bào)道了1例遺傳性vWD家系。先證者為女性,表現(xiàn)為皮膚黏膜出血,其血小板計(jì)數(shù)正常,但APTT輕度延長(zhǎng),FⅧ:C接近參考區(qū)間下限,vWF:Ag明顯減低,因此,考慮該患者可能為vWD。為了明確診斷和分型,本研究進(jìn)一步檢測(cè)了vWF:Ag、vWF:Ac、vWF:RCo、RIPA試驗(yàn)以及vWF:CB試驗(yàn)。vWF:Ag反映血漿vWF多聚體的抗原性。vWF:RCo和vWF:Ac試驗(yàn)直接反映vWF多聚體A1結(jié)構(gòu)域的GpⅠbα結(jié)合位點(diǎn)活性。RIPA試驗(yàn)反映了vWF與自身血小板的結(jié)合能力。vWF:CB試驗(yàn)反映vWF與膠原結(jié)合能力,對(duì)vWF高分子多聚體缺失敏感,當(dāng)vWF高分子多聚體缺失時(shí),vWF:CB具有不同程度減低。

先證者vWF:Ac、vWF:RCo及vWF:CB明顯減低,1.25 mg/mL及1.0 mg/mL瑞斯托霉素誘導(dǎo)下RIPA試驗(yàn)也明顯減低,且vWF:CB/vWF:Ag小于0.6[5-7],這提示vWF高分子量多聚體減少。根據(jù)最新vWD診斷指南[8-9],該患者最可能是2型vWD。通過(guò)全基因組測(cè)序并未發(fā)現(xiàn)GPIbα基因相關(guān)突變且低劑量瑞斯托霉素誘導(dǎo)下RIPA試驗(yàn)并無(wú)明顯聚集,故排除2B型vWD,最終先證者(Ⅲ1) 診斷為2A型vWD。哥哥(Ⅲ2)的FⅧ:C正常,vWF:Ag、vWF:Ac、vWF:RCo及vWF:CB輕度減低,1.25 mg/mL及1.0 mg/mL瑞斯托霉素誘導(dǎo)下RIPA活性減低。根據(jù)英國(guó)血友病中心醫(yī)師組織(UKHCDO)建議vWF:Ag小于50%,大于30%且伴隨異常出血癥狀的患者可診斷為“低vWF”[10],但哥哥(Ⅲ2)不表現(xiàn)明顯出血癥狀,不符合“低vWF”診斷。母親(Ⅱ4)的FⅧ:C、vWF:Ag及vWF:RCo正常,vWF:Ac、vWF:CB及1.0 mg/mL瑞斯托霉素誘導(dǎo)的RIPA活性減低。父親(Ⅱ3)的FⅧ:C、vWF:Ag、vWF:Ac及1.25 mg/mL瑞斯托霉素誘導(dǎo)下RIPA活性正常,而vWF:RCo、vWF:CB及1.0 mg/mL瑞斯托霉素誘導(dǎo)下RIPA活性相比正常對(duì)照均有不同程度減低。

為進(jìn)一步探討先證者(Ⅲ1)的發(fā)病機(jī)制,對(duì)該家系4位成員進(jìn)行全外顯子測(cè)序分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)先證者(Ⅲ1)以及其母親(Ⅱ4)、哥哥(Ⅲ2) 均存在vWF基因編碼區(qū)第10號(hào)外顯子c.1117C>T(rs62643625)雜合突變,檢索dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn),突變c.1117C>T在人群中的發(fā)生頻率極低,不屬于多態(tài)性變化。該突變?yōu)闊o(wú)義突變,導(dǎo)致vWF前肽第373號(hào)氨基酸(精氨酸)的密碼子變?yōu)榻K止密碼子,從而使肽鏈合成終止在vWF前肽的D1與D2結(jié)構(gòu)域之間,這就導(dǎo)致合成的vWF分子無(wú)功能結(jié)構(gòu)域,因此攜帶有該突變的患者FⅧ:C、vWF:Ag、vWF:Ac和vWF:CB等結(jié)果不同程度減低。文獻(xiàn)報(bào)道攜帶有該純合突變患者或復(fù)合雜合突變患者表現(xiàn)出嚴(yán)重的出血癥狀,vWF:Ag小于1%、FⅧ:C小于5%,診斷為3型vWD[11-13]?；驕y(cè)序結(jié)果還顯示先證者(Ⅲ1)及其父親(Ⅱ3)均存在vWF基因編碼區(qū)第42號(hào)內(nèi)含子c.7288-9T>G(rs1348526788)雜合突變。該突變?yōu)閮?nèi)含子剪切突變,其致病性尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),先證者(Ⅲ1)表現(xiàn)出明顯出血癥狀,但攜帶vWF基因c.1117C>T雜合突變的母親(Ⅱ4)和哥哥(Ⅲ2)無(wú)明顯出血表現(xiàn),因此推測(cè)先證者(Ⅲ1)的發(fā)病除來(lái)自母親(Ⅱ4)遺傳的c.1117C>T突變外,遺傳自父親(Ⅱ3)的c.7288-9T>G突變可能也發(fā)揮作用,兩種基因突變共同作用導(dǎo)致先證者(Ⅲ1)2A型vWD表型。通過(guò)生物信息軟件預(yù)測(cè)c.7288-9T>G突變的致病性及攜帶有這一雜合突變的父親(Ⅱ3)表型一定程度驗(yàn)證了推測(cè)。

本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)室檢查診斷了1例血管性血友病家系,對(duì)該患者的后續(xù)預(yù)防及臨床治療非常重要,同時(shí)也對(duì)vWD實(shí)驗(yàn)診斷具有啟示作用。但在測(cè)量血小板依賴(lài)的vWF活性時(shí),本研究采用的傳統(tǒng)的vWF:RCo方法相對(duì)新的vWF:GPⅠbM和vWF:GPⅠbR方法變異較大,故為提高診斷的準(zhǔn)確性,建議應(yīng)采用新的vWF:GPⅠbM或vWF:GPⅠbR方法測(cè)量血小板依賴(lài)的vWF活性[8-9]。此外,本例家系檢測(cè)到的新發(fā)突變vWF基因內(nèi)含子c.7288-9T>G突變,僅僅通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)可能具有致病作用,故還需進(jìn)一步進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證該突變的致病性。