枸杞多糖對NMDA致大鼠視網(wǎng)膜損傷保護作用的研究

白 雙，于 鑫，杜瑛培，鄭 萍，2，鄭 婕，2，閆 琳，2，戴貴東

(1.寧夏醫(yī)科大學藥學院2.寧夏回藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心3.寧夏醫(yī)藥研究所;寧夏銀川 750004)

枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide，LBP)是從寧夏特色回藥材枸杞的干燥成熟果實中提取所得。已有文獻報道［1－3］，枸杞多糖具有抗氧化、防衰老、抗輻射等多種生物學活性，尤其是對急性眼高壓、糖尿病眼病等視網(wǎng)膜損傷具有保護作用。本實驗旨在通過建立NMDA致大鼠視網(wǎng)膜損傷動物模型，研究枸杞多糖的保護作用及可能機制，為臨床視網(wǎng)膜損傷疾病防治提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 清潔級♂Sprague-Dawley大鼠，7～8周齡，體質(zhì)量120～150 g，由寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK(寧)2012-0006

1.2 藥品與試劑 枸杞多糖購自寧夏沃福百瑞生物食品有限公司，含量≥30.0%，批號:64WFBR100501;戊巴比妥鈉、NMDA、氯化鈉、多聚甲醛均購自Sigma公司;凱基全蛋白提取試劑盒、凱基BCA蛋白含量檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;兔抗大鼠eNOS、iNOS抗體購自Abcam公司;兔抗大鼠NMDAR2A抗體、兔抗β-actin抗體購自Cell Signaling公司;山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate購自Thermo Scientific公司;實驗用水為超純水。

1.3 儀器 TY96-ⅡN型超生細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司);H1850R型臺式高速冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司);5 μl微量注射器(上海安亭微量進樣器廠);Mutiskan Go酶標儀(美國Thermo Fisher公司);PowerPac Basic電泳儀(美國BIO-RAD公司);培清JS-860B凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司)。

2 方法

2.1 實驗動物分組及模型的建立 56只清潔級♂Sprague-Dawley大鼠隨機分為4組:NMDA組、NMDA+枸杞多糖(100、200 和400 mg·kg－1)組，每組14只大鼠。NMDA組大鼠的左眼為正常對照組。NMDA致大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元損傷模型，根據(jù)Kawasaki等采用的方法略為改進［4］，具體方法:各組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg·kg－1麻醉，采用微量注射器大鼠右眼玻璃體內(nèi)注射2 μl濃度為40 nmol·L－1的 NMDA。枸杞多糖分別按100、200和400 mg·kg－1于NMDA注射前7天灌胃給藥，共14 d。模型組給予等體積生理鹽水。d14處死各組大鼠。每組取5只大鼠眼球剔除玻璃體縱切后浸入4%多聚甲醛固定，其余大鼠眼球剔除玻璃體后置液氮中速凍后放－80℃冰箱中凍存。

2.2 病理學組織觀察 多聚甲醛固定24 h后，用流水沖洗3 h，然后梯度乙醇脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片和蘇木精-伊紅(HE)染色處理，每張切片隨機選取視神經(jīng)根部周圍5個圓形視野，于顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜內(nèi)叢狀層厚度并對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層的神經(jīng)元進行計數(shù)。計數(shù)方法:同一倍率下，記錄視野中神經(jīng)節(jié)細胞層長為100 μm(長度以標尺為準，平行于神經(jīng)節(jié)細胞層方向)的任意區(qū)域內(nèi)神經(jīng)元個數(shù)，取平均值。

2.3 Western blot檢測 在約100 mg經(jīng)液氮研磨的視網(wǎng)膜組織中加入0.5 ml冷裂解緩沖液，冰浴下超聲破碎細胞。4℃，10 000 r·min－1離心 10 min，取上清蛋白定量，剩余上清加入上樣緩沖液100℃水浴10 min，－20℃保存。取蛋白樣本75 μg上樣，7.5%SDS-PAGE凝膠電泳(80V/120V電壓)，200 mA恒定電流轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后，分別用抗NMDAR2A抗體(1∶200)、抗eNOS抗體(1∶200)、抗iNOS抗體(1∶200)及抗βactin抗體(內(nèi)參，1∶1 000)4℃孵育過夜。加入山羊抗兔二抗(偶聯(lián)有HRP，1∶4 000)常溫孵育2 h，加入超級化學發(fā)光底物反應液，曝光膠片。膠片掃描結(jié)果采用Quantity-one軟件分析，將目的條帶的光密度值與其相對應的內(nèi)參β-actin的光密度值相比以校正誤差，所得比值代表該目的蛋白的相對含量。2.4統(tǒng)計學處理實驗結(jié)果以±s表示。用SPSS 19.0軟件包進行統(tǒng)計分析。多組間均數(shù)的比較采用One-way ANOVA分析。

Fig 1 Effect of LBP on retinal damage in NMDA treated rats

3 結(jié)果

3.1 視網(wǎng)膜組織學改變 光鏡下正常對照組大鼠視網(wǎng)膜HE染色后各層組織結(jié)構(gòu)清晰，完整，染色均勻，清晰可見3個核層。由內(nèi)向外依次為神經(jīng)節(jié)細胞層(GCL)，內(nèi)核層(INL)以及外核層(ONL)。神經(jīng)節(jié)細胞呈單層排列，細胞大小不一，呈圓形或橢圓形，INL及ONL細胞呈多層分布，內(nèi)叢狀層(IPL)位于GCL與INL之間，外叢狀層(OPL)位于INL與ONL之間。NMDA組以GCL和IPL損傷最為明顯，神經(jīng)節(jié)細胞減少，胞內(nèi)空泡樣變性，核固縮濃染，IPL變薄。枸杞多糖(100、200和400 mg·kg－1)均能抑制NMDA所致神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡和IPL的變薄。高劑量枸杞多糖(400 mg·kg－1)對正常視網(wǎng)膜無影響(Fig 1)。

3.2 視網(wǎng)膜NMDAR2A的表達 Western blot檢測結(jié)果顯示，正常對照組視網(wǎng)膜組織NMDAR2A蛋白表達較低。玻璃體內(nèi)注射NMDA后，NMDAR2A的蛋白表達明顯增高(P＜0.01)。枸杞多糖(100、200 和 400 mg·kg－1)明 顯 降 低 NMDA 所 致NMDAR2A的蛋白表達增多(P＜0.01)，并且NMDA+LBP 200和400 mg·kg－1組使 NMDAR2A的表達基本降到正常水平。高劑量枸杞多糖(400 mg·kg－1)對正常視網(wǎng)膜NMDAR2A的蛋白表達無影響(Fig 2)。

Fig 2 Effect of LBP on expression of NMDAR2A in NMDA treated rats

3.3 視網(wǎng)膜eNOS和iNOS的表達 Western blot檢測結(jié)果顯示，與正常對照組比較，NMDA組eNOS的表達明顯降低(P＜0.01)。枸杞多糖(100、200和400 mg·kg－1)可明顯抑制NMDA致eNOS表達的減少(P＜0.01)。高劑量枸杞多糖(400 mg·kg－1)對正常視網(wǎng)膜 eNOS蛋白表達無影響(Fig 3B)。正常對照組視網(wǎng)膜組織中iNOS幾乎不表達。玻璃體內(nèi)注射NMDA后，視網(wǎng)膜iNOS蛋白表達明顯增高(P＜0.01)。枸杞多糖(100、200和400 mg·kg－1)可明顯抑制NMDA致iNOS表達的增多(P＜0.01)。高劑量枸杞多糖(400 mg·kg－1)對正常視網(wǎng)膜iNOS蛋白表達無誘導作用(Fig 3C)。

4 討論

本實驗研究了枸杞多糖對NMDA致大鼠視網(wǎng)膜損傷的保護作用及其機制。研究結(jié)果顯示，大鼠眼玻璃體內(nèi)注射NMDA后，視網(wǎng)膜的厚度變薄，細胞數(shù)量減少，細胞層次減少，而其中尤以神經(jīng)節(jié)細胞層(GCL)和內(nèi)叢狀層(IPL)損傷最為明顯，神經(jīng)節(jié)細胞明顯減少，胞內(nèi)空泡樣變性，核固縮濃染，IPL明顯變薄，這與Mori等研究報道一致［5］。枸杞多糖可以減輕視網(wǎng)膜病理損傷，以200、400 mg·kg－1給藥最為明顯。提示，枸杞多糖對NMDA誘導的大鼠視網(wǎng)膜損傷有保護作用。

Fig 3 Effect of LBP on expression of eNOS and iNOS in NMDA treated rats

興奮性氨基酸對視網(wǎng)膜內(nèi)層細胞具有毒性作用。大量文獻報道，NMDA激動其受體介導的興奮性毒性與視網(wǎng)膜缺血和青光眼等多種眼部疾病有關［6－7］。NMDA 受體至少有五個亞基:NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、NMDAR2C、NMDAR2D。其中NMDAR1是NMDA受體一個基本亞基，沒有它受體將沒有功能。NMDAR2A～D亞基可能是調(diào)節(jié)亞基［8］。NMDAR1在視網(wǎng)膜的興奮性毒性損傷中不發(fā)揮作用，而NMDAR2A與氨基酸興奮性毒性損傷機制有關［9］。本實驗研究結(jié)果顯示，NMDA可誘導大鼠視網(wǎng)膜組織NMDAR2A蛋白表達增加，這與Matteucci等［10］研究報道相一致。枸杞多糖干預后可使大鼠視網(wǎng)膜組織NMDAR2A表達降低，提示，枸杞多糖可抑制大鼠視網(wǎng)膜組織中NMDAR2A表達的上調(diào)。

越來越多的證據(jù)表明，一氧化氮在視網(wǎng)膜的生理性修復及病理過程中發(fā)揮重要作用［11］。一氧化氮由L-精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)作用下生成。NOS包括:神經(jīng)型(nNOS)、內(nèi)皮型(eNOS)和誘導型(iNOS)3種。nNOS和eNOS為結(jié)構(gòu)型，在正常視網(wǎng)膜細胞中表達，催化生成生理量的一氧化氮，對視網(wǎng)膜產(chǎn)生保護作用，在視網(wǎng)膜損傷時，表達下降。iNOS為誘導型，正常情況下不表達，在視網(wǎng)膜受各種病理損傷性刺激后大量表達，導致大量具有自由基毒性作用一氧化氮過量的生成，對視網(wǎng)膜產(chǎn)生損傷作用［12］。NMDA受體激活后，可開放電壓門控性鈣通道引起鈣離子內(nèi)流，激活鈣離子敏感的酶，其中包括iNOS表達的增加。同時鈣離子升高誘導產(chǎn)生大量超氧陰離子并與一氧化氮結(jié)合，生成過氧亞硝酸基，誘導神經(jīng)節(jié)細胞凋亡［13］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，NMDA玻璃體注射的大鼠視網(wǎng)膜組織中eNOS蛋白表達下降，iNOS蛋白表達明顯增加，這與Nakamichi等研究報道一致［14］。不同劑量枸杞多糖給藥后，尤其高劑量枸杞多糖可以有效的逆轉(zhuǎn)由NMDA誘導損傷的大鼠視網(wǎng)膜組織中eNOS表達下調(diào)和iNOS表達的上升。提示，枸杞多糖對由NMDA誘導的大鼠視網(wǎng)膜損傷保護作用的機制與抑制eNOS/iNOS異常表達有關。

綜上所述，枸杞多糖對NMDA致大鼠視網(wǎng)膜損傷具有保護作用，其機制與調(diào)控視網(wǎng)膜NMDAR2A表達以及eNOS/iNOS水平有關。由于視網(wǎng)膜病變存在多種發(fā)生機制［15］，枸杞多糖對視網(wǎng)膜病變的保護是否通過其他作用靶點，尚需進一步研究。

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