黃連素通過(guò)S1P2-MAPK信號(hào)通路抗糖尿病腎纖維化作用機(jī)制研究

劉慰華，劉世明，林雙峰，黃河清

(1．廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院廣州心血管疾病研究所，廣東廣州 510260;2．廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405;3．中山大學(xué)藥學(xué)院藥理毒理實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510006)

黃連素(berberine，［C20H18NO4］+)存在于小檗屬植物黃連(Coptidis Rhizoma，CR)、黃柏(Cortex Phellodendri)中，屬于異喹啉類生物堿。研究表明黃連素通過(guò)降低血糖、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減輕氧化應(yīng)激，改善胰島素抵抗和胰島細(xì)胞保護(hù)等多方面發(fā)揮抗糖尿病的作用［1－2］，我們以往研究顯示黃連素通過(guò)Akt信號(hào)通路增加糖尿病小鼠肝糖原合成從而降低血糖［3］，還發(fā)現(xiàn)黃連素從抑制多元醇通路，減少氧化應(yīng)激，抑制NF-κB信號(hào)通路等方面發(fā)揮改善糖尿病腎功能損傷的作用［4－7］。研究證據(jù)充分顯示出黃連素多靶點(diǎn)，作用廣泛，機(jī)制復(fù)雜的藥理學(xué)特點(diǎn)。

S1P2受體是1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)2型高親和力受體，介導(dǎo)S1P誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、存活、細(xì)胞遷移，MAPK、Rho 激活等［8－9］。近年的研究主要從免疫調(diào)節(jié)、炎癥、血管生成等方面闡述S1P受體在糖尿病并發(fā)癥中的作用，然而S1P受體尤其是S1P2受體的作用及其機(jī)制目前仍未完全闡明。我們既往研究表明:糖尿病腎組織及腎小球系膜細(xì)胞鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1，SphK1)-S1P信號(hào)通路激活、優(yōu)勢(shì)表達(dá)的S1P2受體參與細(xì)胞外基質(zhì)包括纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)等生成增加過(guò)程，提示SphK1/S1P/S1P2通路在糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)病理進(jìn)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［10－11］。近期研究發(fā)現(xiàn)黃連素改善糖尿病小鼠腎臟肥大，減少細(xì)胞外基質(zhì)生成如TGF-β1、FN和膠原IV的作用與其減少SphK1表達(dá)及活性，減少S1P生成相關(guān)，提示SphK1-S1P通路可能是黃連素抗糖尿病腎纖維化另一個(gè)新穎的作用機(jī)制［12］。在此基礎(chǔ)上，黃連素是否影響S1P2受體的變化，從受體環(huán)節(jié)發(fā)揮抑制糖尿病腎臟細(xì)胞外基質(zhì)積聚的作用需要進(jìn)一步研究。

本研究主要觀察黃連素干預(yù)后四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎組織、高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中S1P2受體mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化情況，以及對(duì)高糖條件下S1P2受體介導(dǎo)的FN生成和MAPK信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)參照中國(guó)動(dòng)物福利法案，經(jīng)中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后進(jìn)行。健康♂ C57BL/6小鼠，SPF級(jí)，40只，體質(zhì)量為(20±5)g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明號(hào):0055294，生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2008-0002。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部屏障環(huán)境實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，小鼠禁食6 h后，給予單次腹腔注射200 mg·kg－1四氧嘧啶 (Alloxan)制作糖尿病小鼠模型。注射72 h后測(cè)禁食6 h血糖，小鼠血糖值≥11.1 mmol·L－1確定為糖尿病小鼠。隨機(jī)分為4組:正常、糖尿病、黃連素低劑量(0.15 g·kg－1)和高劑量(0.3 g·kg－1)組，每天灌胃給藥，共觀察12周，實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由進(jìn)食、飲水，不使用胰島素等降糖藥物。每周定期稱量記錄各組動(dòng)物體重變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 d，用代謝籠收集24 h尿液，用磺基水楊酸－硫酸鈉比濁法檢測(cè)24 h尿蛋白(urine protein for 24 hours，UP 24 h)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)大鼠禁食6 h后稱重，麻醉取血，分離血清，用于檢測(cè)血糖、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)。腎臟剝離并稱量后－80℃保存，用于Real-time PCR和Western blot等檢測(cè)。

1．2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 常規(guī)原代培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞于含10%胎牛血清(Gibco，USA)的DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2，每2～3 d用含0.25%的胰酶消化傳代，取3～15代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞無(wú)血清同步化處理后進(jìn)行分組干預(yù)實(shí)驗(yàn)。分為6組:①正常糖組 (NG，5.5 mmol·L－1glucose);② 高糖組(HG，22 mmol·L－1glucose);③ HG+S1P(1 μmol·L－1);④ HG+S1P+siRNA;⑤ HG+S1P+berberine(30 μmol·L－1);⑥ HG+S1P+siRNA+berberine，處理24 h后，提取蛋白用于Western blot檢測(cè)。

1．3 Real-time PCR 用TRIzolTM試劑 (Invitrogen，USA)抽提腎組織總RNA，應(yīng)用相應(yīng)試劑盒［TaKaRa(大連)有限公司］進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)。小鼠S1P2受體引物序列為:Forward:5'-GCTCTACGGCAGTGACAAAAGC-3';Reverse:5'-GAGAGGCAGCACGGTGGAGCAG-3'。

1．4 小分子 RNA干擾(small interfering RNA，siRNA) S1P2受體特異性的小分子干擾RNA(siRNA)序列購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司。S1P2-siRNA序列為:sense:5'-CAGGAACACUACAAUUACADTDT-3'，antisense:5'-UGUAAUUG UAG UGUUCCUGDTDT-3'。按照產(chǎn)品說(shuō)明書采用 Lipofectamine 2000(Invitrogen，USA)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系膜細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞。

1．5 Western blot 用于檢測(cè) S1P2，F(xiàn)N，磷酸化MAPK等的蛋白表達(dá)。腎皮質(zhì)或細(xì)胞經(jīng)裂解液處理后收集蛋白用 BCA法(BCATMProtein Assay Kit，Pierce，USA)進(jìn)行蛋白定量。10%SDS-PAGE電泳、電轉(zhuǎn)、封閉后4℃孵育一抗過(guò)夜，所用一抗如下:S1P2(1 ∶500，Cayman Chemical Company，USA)，F(xiàn)N(1 ∶1 000，Santa Cruz Biotechnology，USA)，MAPK(ERK1/2，p38MAPK，JNK，1 ∶1 000，Sigma，USA)，tubulin(1∶1 000，Sigma，USA)。分別用相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(anti-rabbit IgG或anti-mouse IgG，1 ∶10 000，Cell Signaling Technology，USA)室溫孵育1 h。加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液ECL液(Pierce，USA)，X線片曝光，顯影，定影。利用圖像分析系統(tǒng)(UVP's Gel Documentation System GDS8000和Gel works LABWORK 4.0 Analysis Software)掃描確定X線片目的條帶的光密度值。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析，多組比較用方差分析(單因素方差分析、LSD法)，組間比較、組內(nèi)比較用t檢驗(yàn)，結(jié)果用±s表示。

Tab 1Biochemical characteristics of alloxan-induced diabetic mice treated with berberine(±s)

Tab 1Biochemical characteristics of alloxan-induced diabetic mice treated with berberine(±s)

KW/BW:kidney weight/body weight，BUN:blood urea nitrogen，Cr:creatinine，UP 24h:urine protein for 24 hours，*P＜0.05 vs normal，#P＜0.05 vs diabetes

Items Normal(n=10)Diabetes(n=6)Diabetes+Berberine(0．15 g·kg－1，n=7)Diabetes+Berberine(0．3 g·kg－1，n=10)Blood glucose/mmol·L －1 5．00 ±0．69 28．25 ±4．51* 22．67 ±4．59* 19．26 ±3．64*#Bodyweight/g 24．20 ±0．51 17．83 ±0．79* 18．29 ±0．87* 18．80 ±0．44*Kidneyweight/g 0．33 ±0．01 0．30 ±0．02 0．31 ±0．02 0．29 ±0．02 KW/BW/% 1．36 ±0．05 1．72 ±0．13* 1．73 ±0．12* 1．56 ±0．08 BUN/mmol·L －1 14．26 ±0．98 20．87 ±1．04* 13．51 ±1．46# 13．32 ±2．03#Cr/μmol·L －1 8．33 ±1．55 13．00 ±1．69* 11．50 ±0．76 8．14 ±1．08#UP24 h/μg·d－1 13．26 ±0．12 36．48 ±1．56* 30．72 ±1．61 21．57 ±1．14#

2 結(jié)果

2．1 黃連素作用下四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠生化指標(biāo)的變化 與正常小鼠相比較，糖尿病小鼠空腹血糖明顯升高，體重降低，第12周時(shí)腎重/體重比增加，血尿素氮、血肌酐和24 h尿蛋白明顯增加(P＜0.05)。黃連素明顯抑制糖尿病小鼠血糖升高，改善血尿素氮、血肌酐，24 h尿蛋白等腎功能相關(guān)指標(biāo)(P＜0.05，Tab 1)。

Fig 1 Effectof berberine on the renal S1P2 receptor mRNA level in alloxan-induced diabetic mice(±s)

2．2 黃連素對(duì)糖尿病小鼠腎組織S1P2受體表達(dá)的影響 糖尿病小鼠腎組織S1P2受體mRNA水平與正常小鼠相比增加約3倍(P＜0.05)。黃連素干預(yù)后，S1P2受體mRNA表達(dá)降低約75%，幾乎接近正常水平(P＜0.05，F(xiàn)ig 1)。與S1P2受體mRNA表達(dá)變化相一致，糖尿病小鼠腎組織S1P2受體蛋白水平較正常組增加約2.5倍(P＜0.05)。黃連素明顯減少S1P2受體蛋白表達(dá)，與模型組相比降低約60%(P＜0.05，F(xiàn)ig 2)。

Fig 2 Effect of berberine on the renal S1P2 receptor protein level in alloxan-induced diabetic mice(±s)

2．3 黃連素對(duì)高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞S1P2受體介導(dǎo)的FN表達(dá)的影響 我們既往研究表明黃連素可以降低糖尿病小鼠腎臟和高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞FN表達(dá)［3，12］。黃連素下調(diào)FN表達(dá)的作用是否與其影響S1P2受體表達(dá)相關(guān)，我們引入了S1P2-siRNA作為陽(yáng)性對(duì)照，觀察黃連素對(duì)高糖下S1P-S1P2受體介導(dǎo)的FN表達(dá)的影響。高糖環(huán)境下S1P2受體和FN表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，外源性S1P明顯上調(diào)FN表達(dá)(P＜0.05)。S1P2-siRNA明顯抑制S1P誘導(dǎo)的FN表達(dá)(P＜0.05)。與S1P2-siRNA結(jié)果相似，黃連素也明顯降低了高糖環(huán)境下S1P2受體和FN表達(dá)水平(P＜0.05)。S1P2-siRNA預(yù)處理后再給予黃連素，發(fā)現(xiàn)S1P2受體和FN表達(dá)抑制作用更加明顯，幾乎完全取消S1P誘導(dǎo)的FN表達(dá)的作用(P＜0.05，F(xiàn)ig 3A、B)。

Fig 3 Effect of berberine on fibronectin expression induced by S1P-S1P2 axis in mesangial cells under hyperglycemic condition(±s)

2．4 黃連素對(duì)高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞S1P2受體介導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路的影響 我們以往研究發(fā)現(xiàn)黃連素抑制p38MAPK信號(hào)通路激活從而減少FN生成［13］，那么黃連素是否通過(guò) S1P2受體發(fā)揮調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路的作用，本研究顯示高糖環(huán)境下，p-ERK1/2、p-p38MAPK和p-JNK磷酸化水平明顯增加(P＜0.05 Fig 4A、B)。外源性 S1P刺激下 p-ERK1/2，p-p38MAPK和p-JNK磷酸化程度進(jìn)一步增強(qiáng)(P＜0.05)。S1P2-siRNA干預(yù)后S1P誘導(dǎo)的ERK1/2和p38MAPK磷酸化增加的作用被抑制，p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白水平明顯降低(P＜0.05)。給予黃連素干預(yù)，S1P誘導(dǎo)的p-ERK1/2，pp38MAPK和p-JNK磷酸化水平均明顯下降(P＜0.05)。S1P2-siRNA預(yù)處理再給予黃連素后發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)S1P2-siRNA相比，p-ERK1/2，p-JNK表達(dá)水平進(jìn)一步降低，p-p38MAPK表達(dá)則無(wú)明顯改變?？偟腅RK1/2、p38MAPK和JNK蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯變化。

3 討論

在四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎損傷模型中，黃連素降低血糖、改善腎功能作用與我們既往研究結(jié)果相一致［7，12］。然而黃連素抗糖尿病腎損傷的作用機(jī)制目前尚未完全明確。本研究發(fā)現(xiàn)黃連素明顯抑制糖尿病小鼠腎臟S1P2受體表達(dá)上調(diào)，黃連素抗糖尿病效應(yīng)是否與影響S1P2受體作用密切相關(guān)值得進(jìn)一步研究。

Fig 4 Effect of berberine on MAPK signaling pathway elicited by S1P-S1P2 axis in mesangial cells under hyperglycemic condition(±s)

近年來(lái)，關(guān)于S1P受體在糖尿病腎病發(fā)病過(guò)程中作用及其機(jī)制的研究主要集中在免疫調(diào)節(jié)、炎癥、血管生成等方面。有研究顯示S1P和S1P2受體拮抗劑JTE-013聯(lián)合局部注射可促進(jìn)糖尿病db/db小鼠的傷口愈合，可能與促進(jìn)肉芽組織血管生成，增強(qiáng)成纖維細(xì)胞化學(xué)趨化性等有關(guān)［14］。另有研究發(fā)現(xiàn)在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎皮質(zhì)中S1P2/S1P1表達(dá)分布失衡，引起血管通透性改變，參與血管內(nèi)皮損傷病變過(guò)程［15］。我們既往研究表明在四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎組織和高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中，SphK1-S1P通路激活和S1P2受體優(yōu)勢(shì)表達(dá)促進(jìn)糖尿病腎臟纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程［10－12］。這些研究結(jié)果提示SphK1-S1P-S1P2信號(hào)通路在DN病理進(jìn)程中可能發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)黃連素在下調(diào)系膜細(xì)胞S1P2受體蛋白表達(dá)的同時(shí)，也降低S1P誘導(dǎo)的FN表達(dá)水平;S1P2-siRNA和黃連素聯(lián)合處理后高糖狀態(tài)下S1P誘導(dǎo)FN表達(dá)增加效應(yīng)幾乎完全消失，提示下調(diào)S1P2受體表達(dá)可能是黃連素抗糖尿病腎臟纖維化作用機(jī)制之一。

研究證據(jù)顯示在腎損傷疾病中包括糖尿病腎病、炎癥、毒性反應(yīng)等，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)積聚病理病變過(guò)程中發(fā)揮重要作用［16－18］。MAPK家族包括5大類:細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK1/2)、p38MAPK、c-Jun N 端激酶(c-jun NH2-terminal kinase，JNK)/應(yīng)激激活的蛋白激酶(stress activated protein kinase，SAPK)以及 ERK5/BMK1。糖尿病狀態(tài)下，高血糖、高血脂、氧化應(yīng)激等均可激活MAPK，進(jìn)而磷酸化下游轉(zhuǎn)錄因子如AP-1、CREB等，調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)，導(dǎo)致或加速糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。我們研究發(fā)現(xiàn)S1P2受體介導(dǎo)S1P誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖和FN表達(dá)增加的作用與激活MAPK(主要是 ERK1/2、p38MAPK)信號(hào)通路密切相關(guān)［11］。本研究顯示黃連素可通過(guò)抑制S1P-S1P2-MAPK(ERK1/2和p38MAPK)信號(hào)通路而減少FN等細(xì)胞外基質(zhì)的生成。另外還發(fā)現(xiàn)與S1P2-siRNA干預(yù)后ERK1/2和p38MAPK磷酸化水平降低不同的是，黃連素除了抑制ERK1/2、p38MAPK激活外，也明顯降低JNK磷酸化水平，提示除了S1P2受體，黃連素可能存在其他的抑制MAPK信號(hào)通路激活的途徑。S1P2-siRNA預(yù)處理后再給予黃連素，與單獨(dú)干預(yù)相比ERK1/2磷酸化水平進(jìn)一步降低而p-p38MAPK沒(méi)有出現(xiàn)預(yù)期的疊加變化，考慮可能與黃連素對(duì)MAPK各成分的抑制作用強(qiáng)度不同有關(guān)。

綜上，黃連素作用廣泛，機(jī)制復(fù)雜，減少S1P2受體表達(dá)，抑制S1P2-MAPK(ERK1/2和p38MAPK)通路介導(dǎo)的FN表達(dá)增加是其抗糖尿病腎纖維化可能作用機(jī)制之一。黃連素降低S1P2受體表達(dá)的具體調(diào)節(jié)機(jī)制是我們感興趣并將繼續(xù)深入研究的內(nèi)容。

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