人參皂苷Rh2抑制實(shí)驗(yàn)性大鼠子宮異位內(nèi)膜增殖及其作用機(jī)制探討

盛 磊，郝樹芳，周潔蕓，楊 英，周嫻穎，郭湘潔，李 釗，謝淑武，朱 焰

(1.復(fù)旦大學(xué)，上海 200032;2.上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所生殖藥理組，國(guó)家人口和計(jì)劃生育委員會(huì)計(jì)劃生育藥具重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海生殖健康藥具工程技術(shù)研究中心，上海 200032;3.山西省兒童醫(yī)院婦幼保健院，山西太原 030002;4.寧夏銀川市第一人民醫(yī)院，寧夏銀川 750001)

子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，EMs)雖然是一種良性婦科疾病，但具有惡性腫瘤種植、生長(zhǎng)、浸潤(rùn)等特點(diǎn)。育齡期女性子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病率高達(dá)10～15%［1］。EMs的治療原則是根據(jù)患者年齡、癥狀、病變部位、病情嚴(yán)重程度和范圍以及患者對(duì)生育的要求情況等因素采用藥物治療、手術(shù)治療或手術(shù)聯(lián)合藥物治療等方法［2］。人參皂苷是人參中最主要的活性成分。研究顯示人參皂苷Rh2可抑制癌細(xì)胞向其它器官轉(zhuǎn)移，并通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖周期、誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡來發(fā)揮抗腫瘤作用［3］。因此，我們應(yīng)用實(shí)驗(yàn)性EMs大鼠模型，觀察人參皂苷Rh2對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠子宮內(nèi)膜異位癥的治療作用，并研究了人參皂苷Rh2對(duì)血清E2、P和EMAb水平的影響，以及異位內(nèi)膜中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ♀成熟未孕清潔級(jí)SD(Sprague Dawley)大鼠60只，實(shí)驗(yàn)前體重為200 g～250 g，由上海西普爾-必凱公司提供，合格證號(hào):SCXK(滬)2008－0016。

1.1.2 藥品和試劑 人參皂苷Rh2:HPLC＞99%，購(gòu)自上海順博生物工程有限公司，批號(hào):20100811。Elisa試劑盒(雌激素E2、孕激素P、抗子宮內(nèi)膜抗體EMAb)購(gòu)自美國(guó)ADL生物科技公司;蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Bax、Bcl-2、β-actin購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;Caspase-9、Caspase-3、HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG，HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG購(gòu)自abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備 參照文獻(xiàn)［4］選取動(dòng)情周期規(guī)則的SD大鼠35只進(jìn)行造模，其中造模成功的大鼠共30只。手術(shù)在無菌環(huán)境中進(jìn)行，以3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠1 ml·kg－1。將大鼠仰臥四肢固定于手術(shù)臺(tái)上，腹部消毒后做2～3 cm切口，游離右側(cè)子宮，剪取靠近卵巢處約1.5 cm一段子宮置入含生理鹽水的培養(yǎng)皿中，肌層與子宮內(nèi)膜層分離后，將內(nèi)膜剪成5 mm×5 mm大小與腹壁肌肉縫合固定，常規(guī)關(guān)腹。

1.2.2 模型的判定 模型建立21 d后，第2次開腹，用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量移植物的長(zhǎng)mm、寬mm、高mm，按照V=D1×D2×D3計(jì)算異位內(nèi)膜體積(D1，D2，D3分別是異位內(nèi)膜長(zhǎng)，寬，高)，記錄觀察移植物的生長(zhǎng)情況，存活與否。EMs模型建模成功觀察標(biāo)準(zhǔn)［5］:移植灶體積增大(體積大于25 mm3;高度大于1 mm)，呈透明的結(jié)節(jié)狀、囊狀、有澄清液體積聚，移植物被結(jié)締組織覆蓋并有血管形成，質(zhì)地軟。

1.2.3 分組給藥及解剖取材 造模成功的大鼠共30只，每組6只，按模型異位內(nèi)膜大小隨機(jī)分為5組:模型對(duì)照組給予溶劑0.5%羧甲基纖維素鈉(0.5%CMC-Na 1.5 ml·kg－1·d－1)、陽(yáng)性對(duì)照組給予孕三烯酮(1.5 mg·kg－1·d－1)、Rh2 低、中、高組分別給予 Rh2(5、10、40 mg·kg－1·d－1)，分別相當(dāng)于人(60 kg)用劑量 50、100、400 mg·d－1。Rh2混溶于0.5%CMC-Na中配成混懸液。連續(xù)灌胃21 d，在末次給藥24 h內(nèi)麻醉解剖大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，測(cè)量異位內(nèi)膜大小，立即取出異位內(nèi)膜組織，于4%多聚甲醛和液氮保存。異位內(nèi)膜抑制率按如下公式計(jì)算:抑制率/%=(V給藥前－ V給藥后)/V給藥前×100%，V為異位內(nèi)膜體積。

1.2.4 HE染色 將置于4%多聚甲醛中固定的正常子宮和異位內(nèi)膜進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察正常子宮及異位內(nèi)膜組織病理形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。

1.2.5 ELISA 檢測(cè) 血清中 E2、P和 EMAb水平測(cè)定方法按照說明書操作步驟進(jìn)行，所有樣本均設(shè)置復(fù)孔檢驗(yàn)以減少誤差。最后在450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出各指標(biāo)的濃度。

1.2.6 Western blot分析 異位內(nèi)膜組織加蛋白裂解液冰上勻漿，12 000×g離心15 min后取上清液，BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。每組每份樣本取100 μg進(jìn)行12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(濃縮膠80 V，15 min;分離膠110 V，1 h)，轉(zhuǎn)膜(110 V，1.5 h)，Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)、β-actin(1∶1 000)、Caspase-9(1∶1 000)和 Caspase-3(1∶1 000)4℃孵育過夜，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶2 000)，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG(1∶5 000)室溫孵育1 h，ECL顯色液顯影，暗室曝光掃描灰度值。各目的條帶與β-actin條帶灰度值比值作為該目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 Rh2對(duì)在位子宮內(nèi)膜及異位內(nèi)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，模型對(duì)照組的異位內(nèi)膜體積明顯增大(Fig 1A～B)，而Rh2高劑量組(40 mg·kg－1)明顯抑制異位內(nèi)膜生長(zhǎng)，異位內(nèi)膜明顯縮小(Fig 1C～D)。

模型對(duì)照組大鼠與Rh2各劑量組大鼠在位子宮無明顯差異。均可見子宮平滑肌層較薄，平滑肌細(xì)胞細(xì)長(zhǎng)，內(nèi)環(huán)外縱，規(guī)則排列。內(nèi)膜腺體形態(tài)規(guī)則，呈圓形或橢圓形，數(shù)量多，腺腔小，腺體上皮細(xì)胞均為單層立方或柱狀，核下可見空泡和頂漿分泌(Fig 2A)。與在位內(nèi)膜相比，手術(shù)移植的異位內(nèi)膜生長(zhǎng)良好，在鏡下可見生成一個(gè)腔樣結(jié)構(gòu)，囊內(nèi)有豐富的分泌物(Fig 2B)，提示異位內(nèi)膜模型建立成功。給藥21 d后，與模型對(duì)照組相比，Rh2各劑量組大鼠異位內(nèi)膜生長(zhǎng)受到不同程度抑制，并可觀察到異位內(nèi)膜組織萎縮，間質(zhì)疏松，腺體數(shù)目減少，腺腔明顯萎縮，腔內(nèi)積液體積縮小(Fig 2D～F)。

Fig 1 Effect of Rh2 on gross morphology of ectopic endometrium in the rat model of endometriosis

2.2 Rh2對(duì)SD大鼠異位內(nèi)膜生長(zhǎng)的抑制作用在連續(xù)給予21 d 0.5%CMC-Na、孕三烯酮和Rh2后，模型對(duì)照組異位內(nèi)膜體積明顯增大，而孕三烯酮組和Rh2低、中、高劑量組在給予不同劑量后異位內(nèi)膜生長(zhǎng)受到抑制，異位內(nèi)膜體積明顯減小。Rh2(5、10、40 mg·kg－1)對(duì)異位內(nèi)膜生長(zhǎng)的抑制率呈劑量依賴性地增加。與模型對(duì)照組相比，孕三烯酮(1.5 mg·kg－1)和 Rh2(5、10、40 mg·kg－1)能明顯抑制異位內(nèi)膜生長(zhǎng)(P＜0.05)(Tab 1)。

2.3 Rh2對(duì)血清中E2，P，EMAb水平的影響結(jié)果顯示，連續(xù)給予 Rh2(5、10、40 mg·kg－1)21 d后，大鼠血清中E2、P和EMAb水平呈劑量依賴性地降低。與模型對(duì)照組相比，Rh2(40 mg·kg－1)血清中E2、P和 EMAb水平明顯降低(P＜0.05)(Tab 2)。

Fig 2 Effect of Rh2 on histopathological change of ectopic endometrium in the rat model of endometriosis

Tab 1 Inhibitory effect of Rh2 on the growth of ectopic endometrium in the model rat of endometriosis(±s，n=6)

Tab 1 Inhibitory effect of Rh2 on the growth of ectopic endometrium in the model rat of endometriosis(±s，n=6)

*P＜0.05 vs model control

Group Dose/mg·kg－1inhibition/%Model Control － －67±70 Gestrinone 1.5 59 ±19*Rh2 low 5 46±25*Rh2 medium 10 45±22*Rh2 high 40 81±11*

Tab 2 Effect of Rh2 on the serum level of E2，P and EMAb in the rat model of endometriosis( ± s，n=6)

Tab 2 Effect of Rh2 on the serum level of E2，P and EMAb in the rat model of endometriosis( ± s，n=6)

*P＜0.05 compared with model control

Group Dose/mg·kg－1 E2/ng·L －1 P/ng·L－1 EMAb/ng·L －1 Model Control － 78±16 44±2 4 143±64 Gestrinone 1.5 46±15 29±12* 3 938±840 Rh2 low 5 57±18 30±5 3 865±101 Rh2 medium 10 54±30 25±5* 3 799±39*Rh2 high 40 44±11* 25±4* 3 606±112*

2.4 Rh2對(duì) Bcl-2、Bax表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，Bax隨Rh2劑量增大表達(dá)增加，而Bcl-2隨Rh2劑量增大表達(dá)減少。與模型對(duì)照組相比，Rh2高劑量組(40 mg·kg－1)Bax蛋白的表達(dá)差異有顯著性(P＜0.05)，Bax/Bcl-2的比例明顯增加(P＜0.05)(Fig 3)。

2.5 Rh2對(duì)Caspase-3 and Caspase-9表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，在模型對(duì)照組中，Caspase-3、剪切后Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)較少;而在孕三烯酮對(duì)照組和 Rh2(5、10、40 mg·kg－1)組中，Caspase-3、剪切后Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)增加，且與Rh2劑量效應(yīng)呈正相關(guān)。與模型對(duì)照組相比，在Rh2高劑量組(40 mg·kg－1)中Caspase-3、剪切后Caspase-3和Caspase-9表達(dá)明顯升高(P＜0.05)(Fig 4)。

3 討論

人參是我國(guó)名貴的中藥材，其中人參皂苷是人參主要的生物活性物質(zhì)。到目前為止，已分離鑒定40余種單體，人參皂苷單體化合物中Rg1、Rb1、Re、Rb2等含量較高，往往作為主要人參皂苷進(jìn)行研究。而Rh2、Rd、Rg3和Compound K等稀有皂苷，藥理活性則優(yōu)于主要人參皂苷，與其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同作用，現(xiàn)在也逐漸成為研究的熱點(diǎn)［6］。人參皂苷Rh2具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎等各種生物活性，尤其抗腫瘤活性更為國(guó)內(nèi)外學(xué)者所重視［7］。本文首次觀察了人參皂苷Rh2對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠子宮內(nèi)膜異位癥的抑制作用，目的在于探索將天然產(chǎn)物單體用于治療子宮內(nèi)膜異位癥的可能性。我們的研究結(jié)果顯示，給予人參皂苷 Rh2(5、10、40 mg·kg－1)后，異位內(nèi)膜生長(zhǎng)減緩，體積減小，隨著Rh2劑量增加，對(duì)異位內(nèi)膜生長(zhǎng)的抑制率呈劑量依賴性地增加;而給予溶劑0.5%CMC-Na的模型對(duì)照組中，異位內(nèi)膜生長(zhǎng)迅速，體積增大，不能抑制異位內(nèi)膜生長(zhǎng)，提示人參皂苷Rh2可用于治療子宮內(nèi)膜異位癥。

Fig 3 Effect of Rh2 on the expression of Bcl-2，Bax of ectopic endometrium in the rat model of endometriosis(n=6)

子宮內(nèi)膜異位癥是一種激素依賴性疾病，降低激素的水平可用來治療該疾病。EMAb是一種自身抗體，當(dāng)子宮內(nèi)膜有炎癥發(fā)生時(shí)EMAb的水平會(huì)明顯升高，造成子宮內(nèi)膜功能異常，甚至導(dǎo)致不孕或流產(chǎn)。EMAb的產(chǎn)生，一方面是因異位子宮內(nèi)膜刺激免疫系統(tǒng)，另一方面是機(jī)體的免疫系統(tǒng)失常的原因［8］。本實(shí)驗(yàn)通過Elisa方法測(cè)定Rh2作用后的大鼠血清E2、EMAb和P水平，發(fā)現(xiàn)血清中E2、EMAb和P水平隨著Rh2劑量的加大而降低，其中Rh2(40 mg·kg－1)明顯降低 E2、EMAb和 P 水平，表明Rh2抑制異位內(nèi)膜的生長(zhǎng)與E2、EMAb和P水平降低有關(guān)。

Fig 4 Effect of Rh2 on the expression of Caspase-9，Caspase-3 and cleaved Caspase-3 of ectopic endometrium in the rat model of endometriosis(n=6)

Bcl-2基因是一種原癌基因，具有抑制凋亡的作用。Bax基因?qū)儆贐cl-2基因家族，其編碼的Bax可與Bcl-2形成異二聚體，對(duì) Bcl-2產(chǎn)生阻抑作用［9－10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Rh2(5、10 和 40 mg·kg－1)可增加 Bax表達(dá)，降低 Bcl-2表達(dá)，其中 Rh2(40 mg·kg－1)明顯增加Bax的表達(dá)，升高Bax/Bcl-2比例(P＜0.05)，該結(jié)果提示Rh2可以通過增加Bax/Bcl-2的表達(dá)，發(fā)揮抑制異位內(nèi)膜生長(zhǎng)的作用。該結(jié)果和Bilotas等［11］發(fā)現(xiàn)GnRHa通過增加Bax表達(dá)，降低Bcl-2表達(dá)，誘導(dǎo)子宮異位內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡，而達(dá)到治療疾病的結(jié)果相似。

然而凋亡發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的、由Caspase家族介導(dǎo)的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程，即凋亡信號(hào)首先活化啟動(dòng)型 Caspase(如 Caspase-2，8，9)，再介導(dǎo)水解效應(yīng)型 Caspase酶原，使效應(yīng)型 Caspase活化(如Caspase-3，6，7)，然后作用于底物，使蛋白分解引起細(xì)胞凋亡［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Rh2(40 mg·kg－1)能明顯提高異位內(nèi)膜細(xì)胞的 Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)，提示了Rh2可通過Caspase家族介導(dǎo)的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)子宮異位內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，本文首次發(fā)現(xiàn)了Rh2(40 mg·kg－1)可明顯抑制大鼠子宮異位內(nèi)膜的生長(zhǎng)，其作用機(jī)制可能與降低 E2、P、EMAb水平、上調(diào) Bax/Bcl-2表達(dá)、激活細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性途徑啟動(dòng)因子Caspase-9蛋白、激活執(zhí)行因子Caspase-3蛋白表達(dá)和誘導(dǎo)子宮異位內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡有關(guān)。該結(jié)果表明天然產(chǎn)物單體人參皂苷Rh2可用于治療子宮內(nèi)膜異位癥。

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