米非司酮對(duì)2型糖尿病大鼠糖脂代謝的影響

周 珺，賈正平，2，邱建國(guó)，張泉龍，保 蕓，2，張汝學(xué)，2

(1.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院全軍高原環(huán)境損傷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局臨床中藥學(xué)重點(diǎn)學(xué)科，甘肅蘭州 730050;2.蘭州大學(xué)，甘肅蘭州 730000)

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids，GC)作為降糖激素的反調(diào)激素，它對(duì)于維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著巨大的作用［1-2］，研究表明［2］，GC活性升高與胰島素抵抗密切相關(guān)，GC與其受體結(jié)合后，發(fā)揮著促進(jìn)肝糖異生、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)異常等多方面作用。本文采用高脂飼料加小劑量STZ聯(lián)合誘導(dǎo)的大鼠糖尿病模型模擬人類臨床2型糖尿病，研究HPA軸的功能變化及HPA軸調(diào)節(jié)劑，即糖皮質(zhì)激素受體 (glucocorticoids receptor，GR)拮抗劑—米非司酮對(duì)HPA軸的調(diào)節(jié)作用，研究其對(duì)糖尿病大鼠血糖血脂代謝的影響。

1 材料、試劑及器材

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠，♀，清潔級(jí)，體質(zhì)量(200±20)g，由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(甘)2009-0004，動(dòng)物合格證號(hào):No.0000789，自由攝食進(jìn)水，室溫19℃ ～24℃。

1.2 主要試劑和儀器 鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司);米非司酮(mifepristone，MIF，北京紫竹藥業(yè));血糖、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)檢測(cè)試劑盒(四川邁克科技有限責(zé)任公司);胰島素放射免疫分析測(cè)定試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所);CRH、ACTH、CORT-ELISA測(cè)定試劑盒(R＆D公司)。生化分析儀(Vitalab ISP-21，Vital Scientific公司);電子天平(BP210S，賽多利斯有限公司);紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(HP-8453，美國(guó)惠普公司);離心機(jī)(IEC MICROMAX，Thermo Electron公司);酶標(biāo)儀(Multiscan MK3，Thermo Electron公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 2 型糖尿病大鼠模型的建立、分組及給藥 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，以高脂飼料飼養(yǎng)2個(gè)月，大鼠禁食16 h后給與STZ(30 mg·kg-1，i.p.)誘發(fā)2型糖尿病模型。將血糖值≥11.1 mmol·L-1大鼠納入實(shí)驗(yàn)，分為糖尿病組、MIF-L組(10 mg·kg-1·d-1)、MIF-H 組(25 mg·kg-1·d-1)。連續(xù)灌胃(i.g.)給藥5周后，禁食6 h后斷頭處死并收集軀干血，4℃ 4 000 r·min-1離心10 min，血漿-20℃保存待用。

2.2 體重、血糖 每周測(cè)定一次空腹體重和血糖，測(cè)血糖前大鼠禁食不禁水6-7 h，乙醚麻醉后采血;實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)斷頭處死大鼠，收集所有血液。0.1 mol·L-1肝素鈉抗凝，立即離心并分離血漿。用葡萄糖氧化酶法測(cè)定血漿葡萄糖含量。結(jié)果以mmol·L-1表示。

2.3 血脂的測(cè)定 血漿室溫解凍后測(cè)定血脂水平，TG用GPO-PAP法測(cè)定，TC用 COD-CE-PAP法測(cè)定，HDL-C用PTA-Mg2+沉淀法測(cè)定，LDL-C用聚乙烯硫酸沉淀法測(cè)定。結(jié)果以mmol·L-1表示。

2.4 血漿中激素水平的測(cè)定 血漿室溫放置解凍后，測(cè)定其中胰島素、CRH、ACTH及皮質(zhì)酮水平。胰島素采用放免法測(cè)定，CRH、ACTH及皮質(zhì)酮用ELISA測(cè)定，結(jié)果以mIU·L-1，ng·L-1，ng·L-1，μg·L-1表示。

2.5 肝糖原含量測(cè)定(蒽酮—硫酸法) 采用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定肝糖原含量。結(jié)果以mg·g-1表示。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 11.5軟件處理，結(jié)果用±s表示，組間差異用t檢驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大鼠體重變化 與正常組相比，模型組大鼠體重明顯降低(P＜0.01)，MIF-L組體重明顯降低(P＜0.05)，MIF-H組大鼠體重?zé)o明顯下降;與模型組相比，第4周時(shí)，MIF-H組體重明顯升高(P＜0.01)。

Tab 1Effects of mifepristone on weight(g，±s)

Tab 1Effects of mifepristone on weight(g，±s)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs model

group n dose/mg·kg-1·d-10 week 1 week 2 week 3 week 4 week 5 week Control9 0 258.72±25.60 261.16±22.83 268.22±22.55 273.44±24.58 273.30±21.43 273.30±21.43 Model 8 0 234.61±28.59 219.65±31.76＊＊ 234.63±26.73* 231.88±30.86* 224.38±14.00＊＊ 220.13±17.8＊＊MIF-L 9 10 235.33±22.30 220.56±21.95＊＊236.66±25.23* 237.56±26.21* 238.96±23.21* 240.07±16.32*MIF-H 8 25 236.52±23.36 242.24±22.69 244.63±24.25 252.50±23.89 262.86±26.49##269.07±22.26##

3.2 米非司酮對(duì)血糖水平的影響 Tab 2結(jié)果顯示:相比較正常對(duì)照組，模型組和MIF-L、MIF-H各組大鼠血糖明顯升高，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，相比較模型組，給藥前各組血糖無(wú)明顯差異，造模后，模型組血糖逐漸升高，MIF給藥組空腹血糖低于模型組，MIF-H組在給藥第3周即可達(dá)到明顯降糖效果(P＜0.05)。

3.3 米非司酮對(duì)血脂水平的影響 與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠 TC(mmol·L-1)(3.88±1.35，P＜0.05)、TG、LDL-C含量升高，HDL-C含量下降，MIF-L組TC含量明顯升高(3.79±1.46，P＜0.05);相比較糖尿病模型組，MIF可明顯降低LDL-C含量(1.79±0.31，P＜0.01)，有降低TC、TG含量，升高HDL-C含量趨勢(shì)。

Tab 2Effects of mifepristone on fasting glucose level(mmol·L-1，±s)

Tab 2Effects of mifepristone on fasting glucose level(mmol·L-1，±s)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs model

group n dose/mg·kg-1·d-1 FPG/mmol·L -1 0 week 1 week 2 week 3 week 4 week 5 week Control9 0 6.36±0.59 6.20±0.93 6.22±1.10 6.31±0.92 6.68±1.03 6.72±1.21 Model 8 0 20.19±6.40＊＊ 21.83±3.43＊＊ 24.44±3.44＊＊ 25.01±9.97＊＊ 25.92±6.21＊＊ 25.67±5.33＊＊MIF-L 9 10 20.11±6.61＊＊ 20.19±5.92＊＊ 23.02±5.12＊＊ 21.51±4.23＊＊ 21.21±6.96＊＊ 21.02±6.01＊＊MIF-H 8 25 19.89±7.15＊＊ 19.27±4.79＊＊ 18.79±8.13＊＊ 18.44±6.61＊＊# 18.22±6.06＊＊# 17.93±7.68＊＊#

3.4 米非司酮對(duì)激素水平的影響 與正常組相比，模型組血漿CORT及CRH水平和胰島素水平增高，MIF-H組使CORT、ACTH、CRH明顯高于正常(P＜0.05)，MIF-L和 MIFH均可使胰島素高于正常水平，但差異無(wú)顯著性(P＞0.05);與模型組相比，MIF-H可明顯升高ACTH水平(P＜0.01)。

Tab 3Effects of mifepristone on hormones(±s)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs model

3.5 米非司酮對(duì)大鼠肝糖原的影響 相比較正常對(duì)照組(4.89±4.35)mg·g-1，模型組(4.42 ±3.48)mg·g-1和MIF-L組(4.55±3.78)mg·g-1大鼠肝糖原含量有所下降;相比較模型組，MIF-H(5.21±4.33)mg·g-1能增加肝糖原含量。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，糖尿病大鼠體重降低，血糖升高，血脂紊亂，HPA軸激素水平增加，胰島素水平升高，肝糖原含量減少。這與相關(guān)研究報(bào)道一致［3］。下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸分別在下丘腦、垂體和腎上腺水平產(chǎn)生三類激素:CRH、ACTH和GC(大鼠體內(nèi)為皮質(zhì)酮(CORT))，GC又反饋性的調(diào)節(jié)CRH和ACTH的合成分泌。本實(shí)驗(yàn)糖尿病大鼠CRH和CORT水平升高，說(shuō)明其負(fù)反饋調(diào)節(jié)已消失或減弱，HPA軸功能紊亂。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病的發(fā)生與HPA軸功能紊亂有關(guān)，GC直接參與糖代謝調(diào)節(jié)［4］。長(zhǎng)期慢性應(yīng)激使HPA軸活性增高，GC生成釋放增加，其與受體結(jié)合后發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，包括誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞功能障礙［5］，拮抗胰島素的降糖作用，削弱胰島素對(duì)機(jī)體各方面的作用，促進(jìn)脂肪分解、糖原異生，減少細(xì)胞對(duì)糖的攝取，使機(jī)體血糖升高，造成或加重組織胰島素抵抗，使糖代謝紊亂難以控制等［3，6-7］。

MIF是一種GR拮抗劑，它可抑制GC與其受體結(jié)合，使得GC無(wú)法發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。機(jī)體內(nèi)游離的GC與GR結(jié)合后，可介導(dǎo)機(jī)體內(nèi)從抗炎反應(yīng)到血脂、蛋白、核酸代謝等一系列生物學(xué)效應(yīng)。同時(shí)，GR作為參與調(diào)節(jié)糖代謝的激素受體，與進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)的配體結(jié)合并啟動(dòng)催化肝糖生成的相關(guān)酶的基因轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮作用［8］。利用GR拮抗劑，一方面抑制過(guò)量的GC發(fā)揮作用，另一方面可抑制GR的過(guò)量表達(dá)，削弱其調(diào)控酶基因的作用，抑制糖異生的同時(shí)削弱胰島素抵抗，降低血糖水平。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，低劑量的MIF對(duì)2型糖尿病大鼠糖脂代謝影響較弱，而MIF-H組可明顯緩解糖尿病大鼠體重的明顯下降，明顯降低糖尿病大鼠的高血糖，說(shuō)明MIF可通過(guò)拮抗GC的作用從而達(dá)到改善2型糖尿病的目的。但是長(zhǎng)期使用非選擇性GR拮抗劑，會(huì)使得糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)減少，導(dǎo)致HPA軸活性更加亢進(jìn)，此方面有待進(jìn)一步深入研究。

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