海地瓜硫酸軟骨素對3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響

龍騰騰，王靜鳳，常耀光，賀 敏，武鳳娟，王玉明，薛長湖

(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

肥胖癥是指體內(nèi)脂肪積聚過多和(或)分布異常、體重增加，是導(dǎo)致Ⅱ型糖尿病以及冠心病、高血壓、慢性腎衰等代謝綜合征的重要危險因子［1－2］。脂肪合成的過程包括前脂肪細(xì)胞的增殖和分化，在分化過程中，PPARγ、C/EBPα和 SREBP-1c等調(diào)控脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)，對脂肪積蓄起關(guān)鍵作用［3］。因此，抑制前脂肪細(xì)胞的增殖和分化可減少機(jī)體脂肪的儲存，是治療或預(yù)防肥胖的策略之一。

海參多糖是海參體壁的重要功效成分之一，包括海參硫酸軟骨素和海參巖藻聚糖硫酸酯兩種組分［4］。其中，海參硫酸軟骨素(sea cucumber chondroitin sufate，SC-CHS)是一種具有硫酸巖藻糖支鏈的類硫酸軟骨素，主要由D-N-乙酰氨基半乳糖、D-葡萄糖醛酸和L-巖藻糖組成的分子雜多糖。近年來研究表明，海參硫酸軟骨素具有抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力、抗凝血、抗病毒等生理功效［5］，尚未發(fā)現(xiàn)其降脂功效的相關(guān)報道。

本文以體外培養(yǎng)的小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞為研究對象，檢測AM-CHS對其增殖和分化的抑制作用，并對作用的靶時期和作用機(jī)制進(jìn)行探討，以期為新型海洋功能食品的開發(fā)和低值海參的高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 海地瓜(Acaudina Molpadioides)干品，購自青島市南山集貿(mào)市場;3T3-L1前脂肪細(xì)胞，購自 American Type Culture Collection公司;DMEM(Dulbecco's Modified Eagles Medium)培養(yǎng)基、小牛血清(Calf Serum，CS)由美國Gibco公司提供;四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-Isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、胰島素(insulin)、地塞米松(dexamethasone，Dex)、胰蛋白酶、油紅 O染料，由美國Sigma公司提供;Taq酶、MMLV由日本TaKaRa公司提供;甘油三酯(Triglycerides，TG)測定試劑盒，由北京普利萊基因技術(shù)有限公司提供;小鼠過氧化物酶體增殖體激活受體(PPARγ)、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)及β-actin引物，由上海生工生物技術(shù)公司提供;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備 680型酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司);2711型CO2培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司);TGL-16G型臺式離心機(jī)、WGP-300型隔水恒溫培養(yǎng)箱(上海安亭科學(xué)儀器廠);DL-CJ-1N型超凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司);HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市雙捷實(shí)驗儀器廠);TC-96 Life Pro基因擴(kuò)增儀(杭州博日科技公司);JS-780全自動凝膠成像分析儀(上海培清科技公司);IX51倒置顯微鏡系統(tǒng)(Olympus公司)。

1.3 AM-CHS的制備 海地瓜干品粉碎，丙酮脫脂。用木瓜蛋白酶在60℃水浴下酶解24 h，加入10%的CPC溶液沉淀出粗多糖。粗多糖溶解于3 mol·L－1NaCl∶乙醇(100 ∶15V/V)中，加入 95%乙醇調(diào)溶液醇度至45%，4℃放置24 h，離心取上清。上清調(diào)醇度至75%，過夜取沉淀，得CHS粗品。CHS粗品過DEAE-52陰離子交換柱，以0～1.4 mol·L－1NaCl連續(xù)梯度緩沖鹽溶液進(jìn)行洗脫，每7 ml收集一管。洗脫液過液相TSK4000柱子，檢測組分單一的管，收集后透析，真空冷凍干燥，得AM-CHS純品［6］。

1.4 3 T3-L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)與分化 3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，其中含1×105U·L－1青霉素和1×105μg·L－1硫酸鏈霉素。以0.25%的胰酶消化傳代，于37℃、5%CO2、飽和濕度的孵箱中常規(guī)傳代貼壁培養(yǎng)。

取對數(shù)生長期的3T3-L1前脂肪細(xì)胞，用DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度接種于培養(yǎng)板內(nèi)。待細(xì)胞融合后接觸抑制48 h(此時為誘導(dǎo)分化的0 d)，換用含 0.5 mmol·L－1IBMX、1 μmol·L－1DEX、10 mg·L－1胰島素的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，再換用含10 mg·L－1胰島素的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，以后每2 d更換1次完全培養(yǎng)液，并于d 8進(jìn)行脂肪含量檢測。

1.5 AM-CHS對3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖活性的影響 取密度為2×107·L－1的3T3-L1前脂肪細(xì)胞懸液接種于96孔板內(nèi)，每孔100 μl。24 h后棄培養(yǎng)基，加入含不同濃度AM-CHS的完全培養(yǎng)基(分別為 0、50、100 和 200 mg·L－1)，每孔 200 μl，每個濃度4個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72和96 h。于實(shí)驗結(jié)束前4 h加MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄培養(yǎng)基，加入酸化異丙醇200 μl/孔，吹打至藍(lán)色結(jié)晶完全溶解，于酶標(biāo)儀570 nm處測定吸光度A值，細(xì)胞增殖活性以樣品組A值/對照組A值×100%表示。

1.6 AM-CHS對不同分化時期的3T3-L1脂肪細(xì)胞增殖活性的影響 取密度為2×107·L－1的3T3-L1前脂肪細(xì)胞懸液接種于96孔板內(nèi)，每孔200 μl。誘導(dǎo)細(xì)胞分化方法如“1.4”所述，分別在細(xì)胞分化的早期(0 d)、中期(2 d)、晚期(4 d)加入不同濃度的 AM-CHS(分別為 0、50、100 和 200 mg·L－1)，并在d 8用MTT法于570 nm處測定吸光度A值，并計算樣品組A值/對照組A值×100%。

1.7 AM-CHS對3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞增殖活性的影響 取密度為2×107·L－1的3T3-L1前脂肪細(xì)胞懸液接種于96孔板內(nèi)，每孔200 μl。誘導(dǎo)細(xì)胞分化方法如“1.4”所述，在分化后的d 8加入不同濃度的 AM-CHS(分別為 0、50、100 和 200 mg·L－1)，分別培養(yǎng)24、48、72和96 h，MTT法于570 nm 處測定吸光度A值，并計算樣品組A值/對照組A值×100%。

1.8 AM-CHS對3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響

取密度為3×107·L－1的3T3-L1前脂肪細(xì)胞懸液接種于24孔板內(nèi)，每孔1 ml。誘導(dǎo)細(xì)胞分化方法如“1.4”所述，分別在細(xì)胞分化的早期(0 d)、中期(2 d)、晚期(4 d)加入不同濃度的AM-CHS(分別為0、60、120和240 mg·L－1)，將誘導(dǎo)分化8 d的脂肪細(xì)胞用10%多聚甲醛固定1 h，0.5%油紅O染色30 min后，于倒置顯微鏡下觀察并拍照。加入異丙醇溶解脂肪細(xì)胞中的油紅O，于490 nm波長下檢測吸光度值，半定量檢測細(xì)胞內(nèi)的脂肪含量［7］。

將誘導(dǎo)分化8 d的脂肪細(xì)胞用PBS洗3次去除釋放的甘油，加入細(xì)胞裂解液并超聲破碎，離心取上清，參照試劑盒檢測TG含量。

1.9 Real time PCR 檢測 PPARγ、C/EBPα 和SREBP-1c mRNA的表達(dá) 3T3-L1細(xì)胞分化干預(yù)方法如“1.8”所述，于分化的d 8收集細(xì)胞，采用Trizol法提取總RNA。取1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用30 μl反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括 500 ng cDNA、45 mmol·L－1MgCl2、3 μl 10 ×緩沖液、12 mmol· L－1dNTPs、6 μmol 引物、3U TaqDNA聚合酶。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性 45 s，退火 30 s，72℃延伸 45 s，最后72℃延伸10 min，不同基因的引物序列、退火溫度和循環(huán)數(shù)見Tab 1。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，并進(jìn)行條帶的灰度掃描，以β-actin作為內(nèi)參校正，目的基因的相對表達(dá)量以目的基因灰度值/β-actin灰度值×100%表示。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，同時進(jìn)行LSD兩兩比較，實(shí)驗結(jié)果用±s表示。

2 結(jié)果

2.1 AM-CHS對分化不同時期3T3-L1細(xì)胞增殖活性的影響 結(jié)果如Fig 1所示，與正常組相比，AM-CHS能明顯抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞(Fig1A)的增殖，其96 h的抑制率達(dá)到18.73%(P＜0.01)。AM-CHS可明顯抑制3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞(圖1C)的增殖，其72 h和96 h的平均抑制率分別為20.40%(P＜0.01)和21.61%(P＜0.01)。AMCHS對分化不同時期3T3-L1細(xì)胞(Fig 1B)的增殖均無明顯性影響。說明AM-CHS對3T3-L1前脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞有高度的靶向性，而并不影響分化過程中的3T3-L1細(xì)胞數(shù)目。

Tab 1 Primer sequences，annealing temperature and cycles of different genes

2.2 AM-CHS對分化不同時期3T3-L1脂肪細(xì)胞成脂的影響 如Fig 2所示，正常組細(xì)胞呈現(xiàn)典型的脂肪細(xì)胞表型，90%以上的細(xì)胞富含脂滴。分別在分化的d 0和d 2加入AM-CHS均可明顯抑制3T3-L1細(xì)胞分化，細(xì)胞的脂滴明顯減少，與正常組相比，其平均抑制率分別為27.82%(P＜0.01)和12.14%(P＜0.01);另外，d 0加樣后抑制分化作用呈現(xiàn)量效關(guān)系，200 mg·L－1AM-CHS處理組抑制作用最強(qiáng)，抑制率達(dá)到33.26%(P＜0.01)。當(dāng)d 4加入AM-CHS后對3T3-L1細(xì)胞分化作用影響甚微，差異未見顯著性。提示海地瓜AM-CHS能明顯抑制3T3-L1細(xì)胞的分化，減少脂質(zhì)聚集，以早期抑制作用最強(qiáng)。

2.3AM-CHS對PPARγ mRNA表達(dá)水平的影響

過氧化物酶體增殖體激活受體(PPARγ)是脂肪細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子，能轉(zhuǎn)錄、激活脂肪酸結(jié)合蛋白、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶等脂質(zhì)合成基因的表達(dá)而促進(jìn)脂滴聚集，在脂肪細(xì)胞分化和脂肪生成中起關(guān)鍵作用。

Fig 1 Effects of AM-CHS on the proliferation activities of 3T3-L1 cells at different time(n=6)

由Fig 3可見，分化d 0和d 2的3T3-L1細(xì)胞經(jīng)AM-CHS干預(yù)后，其PPARγ mRNA表達(dá)量明顯降低(P＜0.01)，較正常對照組平均降低了58.14%(P＜0.01)和40.78%(P＜0.01)。分化d 4干預(yù)后，PPARγ mRNA表達(dá)量較正常對照組降低了13.49%，但差異無顯著性。提示AM-CHS可以通過降低分化關(guān)鍵基因PPARγ mRNA的表達(dá)，抑制3T3-L1細(xì)胞的分化，且干預(yù)的最佳時期是分化早期。

2.4 AM-CHS對C/EBPα mRNA表達(dá)水平的影響 CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)在脂肪細(xì)胞分化中具有促進(jìn)PPARγ的高表達(dá)，保持分化細(xì)胞表型的作用［8］。Fig 4顯示，在3T3-L1細(xì)胞分化的d 0、2、4分別加入 AM-CHS后，其 C/EBPα mRNA 表達(dá)量均明顯降低，分別較正常對照組平均降低了67.95%(P＜0.01)、42.78%(P＜0.01)和 37.87%(P＜0.01)。其中，AM-CHS對3T3-L1細(xì)胞分化早期的干預(yù)作用最為明顯。

2.5AM-CHS對SREBP-1c mRNA表達(dá)水平的影響 固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)能夠激活關(guān)鍵生脂基因而增加脂肪酸和脂肪的合成，在脂肪細(xì)胞分化中起重要的正調(diào)控作用。Fig 5顯示，在3T3-L1細(xì)胞分化的d 0、2、4加入AM-CHS干預(yù)后，其SREBP-1c mRNA表達(dá)量均明顯降低，分別較正常對照組平均降低了58.47%(P＜0.01)、45.12%(P＜0.01)和28.56%(P＜0.01)。提示 AM-CHS可以通過抑制SREBP-1c mRNA的表達(dá)從而抑制3T3-L1細(xì)胞的分化，且早期干預(yù)抑制作用最強(qiáng)。

3 討論

脂肪細(xì)胞的分化過程伴隨著細(xì)胞數(shù)量增加、體

積增大及TG聚積［9］。當(dāng)前脂肪細(xì)胞數(shù)目過度增多和分化失常時可引起脂肪組織堆積，繼而導(dǎo)致肥胖的發(fā)生［10］。因此抑制前脂肪細(xì)胞的增殖和分化是抗肥胖的一個重要思路。近年來脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控及其與肥胖發(fā)病機(jī)制的關(guān)系一直是國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗以體外培養(yǎng)的3T3-L1前脂肪細(xì)胞為研究對象，研究AM-CHS對3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響以及作用機(jī)制的初探。結(jié)果表明，AM-CHS能明顯地抑制3T3-L1細(xì)胞的增殖和分化，減少脂肪細(xì)胞分化過程中脂質(zhì)的堆積。提示AMCHS可能具有潛在的減肥降脂效應(yīng)。

Fig 2 Effects of AM-CHS on the degree of differentiation of 3T3-L1 cells at different time(n=6)

Fig 3 Effects of AM-CHS on the PPARγ mRNA expression level of 3T3-L1 adipocytes at different time(n=6)

Fig 4 Effects of AM-CHS on the C/EBPα mRNA expression level of 3T3-L1 adipocytes at different time(n=6)

脂肪細(xì)胞分化是一個高度精細(xì)的調(diào)控過程，受到激素、基因和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控。目前研究認(rèn)為，PPARγ、C/EBPα和 SREBP-1c 3者是調(diào)節(jié)脂肪形成最主要的轉(zhuǎn)錄因子。

PPARγ是特異性表達(dá)于脂肪組織中的核轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)節(jié)與脂肪酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)，最終促進(jìn)脂肪的合成。Kadowaki等［11］研究表明，雜合的PPARγ基因缺失小鼠在高脂飲食情況下不會發(fā)生肥胖，說明降低PPARγ表達(dá)能防止高脂飲食引起的脂肪細(xì)胞過度肥大。本研究結(jié)果顯示，AM-CHS能明顯抑制PPARγ mRNA的表達(dá)，說明抑制PPARγ的表達(dá)是AM-CHS抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的有效途徑之一。

Fig 5 Effects of AM-CHS on the SREBP-1c mRNA expression level of 3T3-L1 adipocytes at different time(n=6)

C/EBPα屬于亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族，可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞中的脂肪形成?；罨腃/EBPα不僅能促進(jìn)自身的表達(dá)增加，而且還能夠與PPARγ起協(xié)同作用，共同誘導(dǎo)細(xì)胞分化。Wu等［12］研究表明C/EBPα的異位表達(dá)可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞中的脂肪形成，而反義表達(dá)則抑制前體脂肪細(xì)胞分化，說明C/EBPα在調(diào)控脂肪合成方面起正調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示，AM-CHS能通過抑制脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因C/EBPα mRNA的表達(dá)而抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的分化。

SREBP是一種能和固醇調(diào)節(jié)元件特異性結(jié)合的核轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控膽固醇、脂肪酸和甘油三酯合成方面起重要作用。Kim等［13］已證明SREBP-1c能夠通過PPARγ啟動子中的E盒基序促進(jìn)內(nèi)源性PPARγ的產(chǎn)生，并與 PPARγ和 C/EBPα共同調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化。Shimano等［14］研究表明，SREBP-1c缺失的小鼠中促進(jìn)脂質(zhì)合成的基因表達(dá)量下降，脂肪含量明顯降低。本研究結(jié)果顯示，AM-CHS能明顯抑制 SREBP-1c mRNA的表達(dá)，繼而抑制PPARγ和 C/EBPα的表達(dá)，具有直接抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的作用。

綜上所述，AM-CHS可明顯抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞的增殖，抑制前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化，其機(jī)制與下調(diào)分化關(guān)鍵基因PPARγ、C/EBPα和SREBP-1c mRNA的表達(dá)有關(guān)，其中干預(yù)早期抑制作用最強(qiáng)。但其如何作用于PPARγ、C/EBPα 和 SREBP-1c，作用后其下游相關(guān)基因如何表達(dá)變化以及信號通路還有待于進(jìn)一步研究。

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