馬鈴薯StDof5 的克隆及表達(dá)分析

梅顯軍 宋慧洋 李京昊 梅超，3 宋倩娜，3 馮瑞云，3陳喜明

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所，忻州 034000；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，太谷 030800；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，太原 030031）

馬鈴薯是中國重要的糧菜兼用作物，折糧后產(chǎn)量居第四位，僅次于小麥、玉米與水稻，具有生長周期短、適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高，塊莖生長無限制等生產(chǎn)優(yōu)勢，具有很大的增產(chǎn)潛力，在保障國家糧食安全中起重要作用。馬鈴薯是鹽中度敏感型作物，作為全球重要的糧食作物，目前推廣應(yīng)用的馬鈴薯品種大多耐鹽性較差，馬鈴薯葉片在堿脅迫下發(fā)生萎蔫、植株枯萎，不能正常生長，因此，提高馬鈴薯品種耐鹽堿能力是有必要的。

Dof 基因家族是植物中特有的一類單鋅指蛋白超家族（single zinc finger protein superfamily）［1］，它們在植株生長調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)、種子萌發(fā)、光周期響應(yīng)、非生物脅迫［2］和開花調(diào)控中發(fā)揮重要作用［3］。其家族成員一般包括4 個(gè)部分，分別是N?末端寡聚化位點(diǎn)、Dof 結(jié)構(gòu)域、核定位信號(hào)區(qū)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域［4-5］，Dof 保守結(jié)構(gòu)域是由52 個(gè)相對(duì)保守氨基酸殘基構(gòu)成的C2?C2 型單鋅指結(jié)構(gòu)域［6］，包含著4 個(gè)絕對(duì)保守的Cys 殘基［7］，但C?末端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域不具備保守性［8］。Dof 轉(zhuǎn)錄因子最早在玉米中發(fā)現(xiàn)［9］，一般具有200-400 個(gè)堿基，僅包含1 個(gè)Dof 保守區(qū)和2 個(gè)轉(zhuǎn)錄區(qū)［10］。Dof 轉(zhuǎn)錄因子的研究對(duì)象多為模式植物以及多年生植物（如擬南芥、水稻［11］、番茄［12］、核桃［13］和玉米［14］等），由于家族成員C 末端轉(zhuǎn)錄調(diào)控域具有不同的氨基酸序列，推測其具備多種功能作用［15］。DOF 家族轉(zhuǎn)錄因子Cycling Dof Factor 1（CDF1）在馬鈴薯中與植物抗逆和塊莖發(fā)育有著直接聯(lián)系，且參與調(diào)控鹽脅迫響應(yīng)。近年研究發(fā)現(xiàn)，低溫、干旱及NaCl 等3 種脅迫處理均提升了ABF4 的表達(dá)［16］；擬南芥中SnRK2s 亞家族與ABI5 相互作用，經(jīng)NaCl 和山梨醇處理后，SnRK2s 亞家族mRNA 的表達(dá)水平總體表現(xiàn)為先上升后下降，SnRK2.2、SnRK2.4、SnRK2.5、SnRK2.8 及SnRK2.10 對(duì)干旱脅迫具有強(qiáng)烈響應(yīng)［17］；AtMYB2 的mRNA 在鹽脅迫和脫落酸（ABA）處理情況下會(huì)開始積累。此外，過表達(dá)MYC2 和/或AtMYB2 轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出一定程度的ABA 敏感性增強(qiáng)［18］。AtMYC2 和AtMYB2 過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株中ABA 誘導(dǎo)的一些基因表達(dá)上調(diào)。在干旱和鹽脅迫下，AtMYC2 和AtMYB2 蛋白都在ABA 表達(dá)調(diào)控中起重要作用；DREB1A 和DREB2A 能夠調(diào)控玉米生長和提升非生物脅迫抗性［19］；ABI3 和ABI5 在擬南芥不同組織和脅迫處理表現(xiàn)特定差異，以此在響應(yīng)植物逆境脅迫中發(fā)揮重要功能［20-22］。

目前，只有StDof2 轉(zhuǎn)錄因子在彩色馬鈴薯中的相關(guān)研究，StDof2 蛋白與棉花GhDof1 的親緣關(guān)系最近，過量表達(dá)GhDof1 能提高棉花抗鹽性和抗凍能力，但關(guān)于馬鈴薯StDof5 在抗鹽脅迫方面的研究還較為罕見。

本研究以馬鈴薯底西芮為轉(zhuǎn)化材料，通過克隆StDof5，分析其氨基酸序列，構(gòu)建StDof5 的過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至底西芮愈傷組織篩選出陽性植株并確定其基因功能，研究過表達(dá)StDof5 在馬鈴薯中轉(zhuǎn)錄情況，同時(shí)檢測相關(guān)脅迫響應(yīng)基因ABF4、SnRK2s、MYB2、DREB2A、ABI3 和ABI5 等的表達(dá)，為獲得抗鹽逆境脅迫新品種提供一定的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

無菌組培苗馬鈴薯品種底西芮（DES）由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物基因編輯實(shí)驗(yàn)室保存。

過表達(dá)陽性植株與野生型繼代在固體MS 培養(yǎng)基（MS 粉含蔗糖和瓊脂粉）生長，25 d 后選取長勢一致的過表達(dá)陽性植株與野生型進(jìn)行生長表型試驗(yàn)。繼代在0、50、100 和150 mmol/L 濃度的氯化鈉MS培養(yǎng)基生長，進(jìn)行過表達(dá)陽性植株與野生型繼代，并觀察生長表型。

過表達(dá)陽性植株與野生型在固體MS 培養(yǎng)基中生長25 d 后收集材料，?80℃保存?zhèn)溆?。采?/2 Hoagland 培養(yǎng)液作為無土栽培營養(yǎng)液，配有0、50、100 和150 mmol/L 氯化鈉濃度的1/2 Hoagland 營養(yǎng)液，每個(gè)處理8 個(gè)重復(fù)，過表達(dá)陽性植株與野生型清洗后移入不同鹽濃度下培養(yǎng)，12 h 后剪去葉片?80℃保存，后續(xù)測定相關(guān)生理指標(biāo)。

馬鈴薯組培苗在固體MS 培養(yǎng)基中生長25 d 后，用1/2 Hoagland 培養(yǎng)液作為無土栽培營養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)15 d 緩苗后進(jìn)行鹽脅迫試驗(yàn)，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選取100 mmol/L 脅迫濃度對(duì)過表達(dá)陽性植株和野生型進(jìn)行處理0 和12 h，采集植株的根、莖、葉部分用于RNA 提取，每組3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。所有采集的樣品均迅速冷凍于液氮中，于?80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 農(nóng)藝性狀的測定 根長、株高的測定：用刻度鋼尺直接測量每株苗。鮮重的稱量：蒸餾水沖洗組培苗根上殘留的固體MS 培養(yǎng)基，濾紙吸干水分后用電子天平稱量每株鮮重。根數(shù)、葉片數(shù)：觀察計(jì)算每株苗的根數(shù)、葉片數(shù)。

1.2.2 SOD、POD 和CAT 酶活性的測定 采用生工生物工程（上海）股份有限公司活性檢測試劑盒測定過氧化物酶（peroxidase, POD）活性、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性和過氧化氫酶（catakase micrococcus lysodeikticus, CAT）活性。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

（1）馬鈴薯StDof5 表達(dá)及蛋白理化性質(zhì)分析。采用ExPASy（https://web.expasy.org/protscale/）分析StDof5 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，運(yùn)用在線網(wǎng)站Prot param（http://www.expasy.org/tools/protparam.html） 統(tǒng)計(jì)StDof5 蛋白質(zhì)的氨基酸組成，使用TMHMM2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，運(yùn)用在線工具Prot Scale（http://ca.expasy.org/tools/protscale.html）分析其親疏水性，使用 在 線 工 具SOPMA（https://npsa?prabi.ibcp.fr/cgi?bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預(yù)測二級(jí)結(jié)構(gòu)，使用穿線法I?TASSER（http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/）預(yù)測蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。

（2）系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。利用DNAMAN 軟件對(duì)28 種植物的Dof 蛋白氨基酸多序列比對(duì)。利用MEGA11 對(duì)番茄、甜辣椒、煙草等28 種不同物種Dof5 氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 馬鈴薯StDof5 的克隆

（1）馬鈴薯的RNA 提取及cDNA 合成。使用植物總RNA 提取試劑盒提取馬鈴薯總RNA［23-25］，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板擴(kuò)增StDof5 的CDS 序列。

（2）馬鈴薯StDof5 的擴(kuò)增。從NCBI 下載馬鈴薯StDof5 的 序 列（Gene ID:37425596）， 用Primer Premier 6.0 設(shè)計(jì)克隆引物：F：5'?ATGGCTCAAGTT?CAAGAAAGTC?3'；R：5'?TCGGAGGTGCTCCTCCT?CCT?3'。以馬鈴薯葉片cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μL：1 μL 模板cDNA、1 μL 引物、25 μL 2×Mix 和22 μL ddH2O，PCR 反應(yīng)條件為95℃ 3 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測、回收、測序。

（3）馬鈴薯StDof5 農(nóng)桿菌載體的構(gòu)建。將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，農(nóng)桿菌培養(yǎng)后經(jīng)PCR 鑒定為陽性單克隆，將陽性單克隆進(jìn)行搖菌保菌，保存?80℃冰箱待用。

（4）馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化。試管薯的誘導(dǎo)：以四倍體馬鈴薯栽培品種底西芮（DES）為試驗(yàn)材料，在MS 培養(yǎng)基上，光照周期為16 h 光照/8 h 黑暗，溫度為25℃，培養(yǎng)時(shí)間4 周，用于遺傳轉(zhuǎn)化。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化［26-35］：莖段預(yù)培養(yǎng)：切一定數(shù)目的莖段在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)（48 h）；菌種活化：從?80℃取出保存的農(nóng)桿菌（含有重組質(zhì)粒）菌液，加入LB（含有50 mg/L Rif 和50 mg/L Kan+）液體培養(yǎng)基，28℃ 220 r/min，振蕩活化2 d后備用；侵染：將菌液離心（3 000 r/min，10 min），收集菌沉淀，吸取上清液剩菌沉淀，加入MS 液體培養(yǎng)基混勻，檢測OD600至0.5-0.6。將預(yù)培養(yǎng)莖段用鑷子放于重懸的菌液中，10 min 后，莖段吹干后進(jìn)行28℃暗培養(yǎng)48 h 后，移入愈傷組織培養(yǎng)基中在培養(yǎng)箱培養(yǎng)約3 周，產(chǎn)生愈傷球狀組織時(shí)移入生芽培養(yǎng)基，出芽后移生根瓶，生根則初步確定為過表達(dá)陽性植株。

（5）過表達(dá)植株的鑒定。重組質(zhì)粒中含有目的基因，該基因會(huì)隨重組質(zhì)粒整合到過表達(dá)陽性植株的DNA 上。提取預(yù)選過表達(dá)陽性植株與野生型的總DNA 為模板，利用植物表達(dá)載體攜帶的卡那霉素抗性對(duì)植株進(jìn)行陽性鑒定。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株StDof5 表達(dá)量的測定 提取過表達(dá)StDof5 植株與野生型的RNA，并反轉(zhuǎn)錄cDNA，稀釋反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物后作為模板進(jìn)行RT?qPCR 檢測。利用NCBI Primer?BLAST 設(shè)計(jì)qPCR 引物，引物序列見表1。以Actin 為內(nèi)參基因，反應(yīng)體系為 TB Green Premix Ex Taq I（Tli RNaseH Plus）（2×）10 μL、10 μmol/L 正反引物各0.8 μL、稀釋后的cDNA 2 μL、ROX Reference Dye or Dye I（50×）0.4 μL 和 滅 菌水6 μL。熒光定量反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s，40 個(gè)循環(huán)，DES 為對(duì)照組的表達(dá)量，利用2-ΔΔCt公式計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，利用SPSS 軟件中的方差齊性檢驗(yàn)（Levene test）、方差分析（aov 函數(shù)）及均值多重比較和進(jìn)行差異顯著性分析。

表1 熒光定量引物序列Table 1 Primer sequences for fluorescence quantification

2 結(jié)果

2.1 StDof5的生物信息學(xué)分析

2.1.1 StDof5 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu) StDof5蛋白由165 個(gè)氨基酸組成，蛋白質(zhì)分子式為C800H1236N242O246S9， 原 子 個(gè) 數(shù) 為2 533 個(gè)。 組 成StDof5 蛋白共有20 種氨基酸，其中，天冬氨酸（Asp）所占比例最高為8.5%，色氨酸（Trp）所占比例最低為1.2%。帶負(fù)電荷（Asp+Glu）和正電荷（Arg+Lys）的氨基酸殘基總數(shù)分別為19 和21。StDof5 位于第2染色體上，其蛋白相對(duì)分子量為18 468.63 kD，等電點(diǎn)是8.47。脂肪族指數(shù)為51.45，不穩(wěn)定系數(shù)為45.16，預(yù)測該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。

2.1.2 StDof5 蛋白質(zhì)預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域及親水性 通過TMHMM 分析StDof5 蛋白預(yù)測跨膜螺旋區(qū)域（圖1?A），預(yù)測得到的跨膜螺旋個(gè)數(shù)為0，預(yù)測得到1-165個(gè)氨基酸均在細(xì)胞外側(cè)，StDof5 不屬于跨膜蛋白。Prot Scale 分析StDof5 蛋白親水性平均值為?0.876，預(yù)測該蛋白屬于親水性蛋白（圖1?B）。

圖1 StDof5 蛋白生物信息學(xué)分析Fig.1 Bioinformatics analysis of StDof5 protein

2.1.3 馬鈴薯StDof5 蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測 StDof5蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示（圖1?C），其中的33個(gè)氨基酸參與形成的α 螺旋占20%，β 轉(zhuǎn)角占0，16個(gè)氨基酸參與形成延長鏈占9.7%，109 個(gè)氨基酸參與形成無規(guī)卷曲占66.06%。利用I?TASSER 穿線法預(yù)測蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖1?D），模型質(zhì)量評(píng)估系數(shù)P?score 為0.46，具有一定的可信度。

2.1.4 StDof5 蛋白生物信息學(xué)分析 通過NCBI 數(shù)據(jù)庫對(duì)馬鈴薯與其他物種StDof5 氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，馬鈴薯與番茄（Solanum lycopersicum）、曼陀羅（Datura stramonium）、巴克特姆辣椒（Capzi?cum baccatum）、甜辣椒（Capsicum annuum）、煙草（Nicotiana tabacum）的序列一致性分別為93.98%、83.24%、80.46%、79.89% 和79.41%。 采 用DNA?MAN 進(jìn)行多序列比對(duì)，28 種植物的Dof 蛋白具有一定的相似性，在100-105、158-165、168-182、188-192 處氨基酸序列（鋅指結(jié)構(gòu)）高度相似（圖2）。利用MEGA 11 對(duì)不同物種Dof5 氨基酸序列 進(jìn) 行 系 統(tǒng) 發(fā) 育 分 析（ 圖3），StDof5 與 蘆 薈（XP_049370321.1）的鋅指蛋白處于同一分支，具有很高的同源性。

圖3 不同植物中Dof5 蛋白進(jìn)化樹Fig.3 Evolutionary tree of Dof5 proteins in different plants

2.2 馬鈴薯StDof5的擴(kuò)增檢測

以馬鈴薯品種底西芮為試驗(yàn)材料，以cDNA 為模板，用特異性引物對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果（圖4）表明，獲得單一明亮條帶，大小為498 bp。

圖4 馬鈴薯StDof5 的PCR 擴(kuò)增Fig.4 PCR amplification of the potato StDof5 gene

2.3 馬鈴薯StDof5載體的構(gòu)建

2.3.1 馬鈴薯StDof5 農(nóng)桿菌載體構(gòu)建 將PCR 鑒定為陽性單克?。▓D5?A）進(jìn)行測序，選擇正確的菌株進(jìn)行后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

圖5 馬鈴薯StDof5 載體的構(gòu)建Fig.5 Construction of the potato StDof5 vector

2.3.2 馬鈴薯StDof5 的遺傳轉(zhuǎn)化 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化法，經(jīng)預(yù)培養(yǎng)、暗培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)、生芽培養(yǎng)后移入生根瓶，如圖5?C 所示表明植株已生根，初步確定為過表達(dá)陽性植株。

2.3.3 過表達(dá)植株鑒定 預(yù)擴(kuò)增片段大小1 123 bp，過表達(dá)陽性植株與野生型結(jié)果如圖5?B 所示，野生型馬鈴薯植株未能擴(kuò)增出條帶，表明成功獲得8 株含有目的基因StDof5 過表達(dá)馬鈴薯植株。

2.4 馬鈴薯StDof5的表達(dá)量分析

運(yùn)用100 mmol/L 進(jìn)行鹽脅迫，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析。結(jié)果表明，模擬鹽脅迫12 h 后，該基因在馬鈴薯根、莖、葉等部位均有表達(dá)，但在根中的表達(dá)量最高且根中表達(dá)量顯著（圖6）。

圖6 不同組織中馬鈴薯Dof5 的表達(dá)量分析Fig.6 Analysis of Dof5 gene expression in different tissues of potato

為了研究Dof5 在馬鈴薯中的功能，在過表達(dá)馬鈴薯中選取4 個(gè)株系的根作為后續(xù)研究的材料。如圖7 所示，過表達(dá)陽性植株中StDof5 的表達(dá)量都高于野生型，OP?9、OP?10、OP?16、OP?24 分別增長了39.1%、26.5%、31%、41.2%，而株系之間的表達(dá)量也不相同。

圖7 StDof5 的表達(dá)量Fig.7 StDof5 gene expression

利 用RT?qPCR 分 析 過 表 達(dá)Dof5 在 馬 鈴 薯 中脅迫響應(yīng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄情況，結(jié)果（圖8）顯示，馬鈴薯鹽脅迫響應(yīng)基因ABF4、SnRK2s、MYB2、DREB2A、ABI3 的轉(zhuǎn)錄水平在過表達(dá)陽性植株中顯著高于野生型，ABI5 表達(dá)低于野生型。綜上所述，StDof5 在馬鈴薯中能夠調(diào)控脅迫響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)。

圖8 過表達(dá)Dof5 陽性植株中脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)量分析Fig.8 Expression analysis of stress-responsive genes in overexpressing Dof5-positive plants

2.5 鹽脅迫下StDof5的表型分析

過表達(dá)陽性植株與野生型在不同鹽濃度下的MS培養(yǎng)基中生長，25 d 后對(duì)不同材料生長情況進(jìn)行測量，150 mmol/L 鹽濃度下均未生根未記錄。結(jié)果顯示，不同濃度下所有植株均生根，100 mmol/L 濃度下OP?7、OP?9 中有部分未生根現(xiàn)象；0、50 和100 mmol/L 鹽濃度處理各無菌苗生長25 d 的數(shù)據(jù)如表2所示。

表2 鹽脅迫生長指標(biāo)的測定Table 2 Determination of the growth indicators of salt stress

從表2 和圖9 均可以看出，25 d 鹽脅迫后，0、50和100 mmol/L鹽濃度處理下各個(gè)組培苗均能生長，但過表達(dá)陽性植株與野生型在不同鹽濃度下對(duì)鹽的耐受性和敏感性均有差別。當(dāng)鹽濃度達(dá)到50 和100 mmol/L 時(shí)，鹽處理對(duì)過表達(dá)陽性植株與野生型的株高、鮮重、根長、根數(shù)影響顯著，7 個(gè)品種間差異均達(dá)顯著水平（P＜0.05）。不同鹽濃度下馬鈴薯株高、鮮重、根長、根數(shù)由高到低順序均為：0 mmol/L＞50 mmol/L＞100 mmol/L，表現(xiàn)其株高、鮮重、根長、根數(shù)與鹽濃度呈負(fù)相關(guān)；不同鹽濃度對(duì)馬鈴薯葉片數(shù)的影響：過表達(dá)陽性植株與野生型葉片數(shù)隨著鹽濃度的增加變化不明顯，當(dāng)鹽濃度為0、50 和100 mmol/L 時(shí)，過表達(dá)陽性植株較野生型葉片數(shù)變化不大且差異均不顯著，由此推斷葉片數(shù)與鹽濃度高低影響不大。生長指標(biāo)測定結(jié)果表明，過表達(dá)陽性植株與野生型株高、鮮重、根長、根數(shù)隨鹽濃度的增加而下降，但過表達(dá)陽性植株下降趨勢較野生型緩慢，說明過表達(dá)陽性植株比野生型在鹽脅迫下生長狀態(tài)更好，表明過表達(dá)陽性植株能提高抵御非生物脅迫抗性。

圖9 鹽脅迫25 d 后組培苗生長狀態(tài)Fig.9 Growth status of tissue culture seedlings after 25 d of salt stress

2.6 SOD、CAT和POD活性測定結(jié)果

如圖10 所示，隨著鹽濃度增加過表達(dá)陽性植株與野生型中SOD、CAT 和POD 的活性都不同程度增強(qiáng)。在50 mmol/L 脅 迫 下，OP?9 和OP?10 中POD、SOD、CAT 的活性與DES 相比，分別增強(qiáng)了40.8%和50.7%、8.9%和35.3%、48.92%和41.72%。隨著鹽濃度的增加，SOD、POD、CAT 活性增強(qiáng)幅度逐漸減小；不同鹽脅迫下過表達(dá)陽性植株與野生型相比，過表達(dá)陽性植株的SOD、POD、CAT 三種酶活性均有不同程度升高，說明過表達(dá)陽性植株在鹽脅迫下通過不斷增強(qiáng)酶活性來抵御植株損傷程度。

圖10 SOD、POD 和CAT 的酶活性Fig.10 Enzymatic activities of SOD, POD, and CAT

3 討論

Dof 轉(zhuǎn)錄因子在植物調(diào)節(jié)生長發(fā)育與響應(yīng)非生物脅迫中起重要作用［36-37］，許多轉(zhuǎn)錄因子（DREB、ABF、bZIP、MYB、NAC 和WRKY 等）均已經(jīng)被證明參與調(diào)控鹽脅迫逆境響應(yīng)［38］。擬南芥CDF3 通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子CBF/DREB2A，能夠誘導(dǎo)下游基因CRT/DRE 表達(dá)，從而參與調(diào)控植物干旱與低溫脅迫信號(hào)傳導(dǎo)途徑。過表達(dá)GhDof1 能夠上調(diào)脅迫相關(guān)基因GhSOD 和GhMYB 的表達(dá)量，從而提高棉花的耐低溫及耐鹽脅迫的能力［39］。番茄SlDof22 可以與SlSOS1 的啟動(dòng)區(qū)序列結(jié)合，參與抗壞血酸積累和響應(yīng)鹽脅迫反應(yīng)［40］。Dof 家族轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物生長發(fā)育［41］、響應(yīng)逆境脅迫［42-43］、參與激素調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起重要作用，探究其作用機(jī)理與功能有利于研究人員了解馬鈴薯生長發(fā)育過程及馬鈴薯響應(yīng)逆境脅迫的功能機(jī)制。植物Dof 的功能主要集中在種子、器官的生長發(fā)育以及代謝通路的調(diào)控［44-46］，而且Dof 基因家族響應(yīng)非生物脅迫時(shí)基因表達(dá)會(huì)表現(xiàn)出上調(diào)趨勢［47］。

Dof 轉(zhuǎn)錄因子在馬鈴薯中響應(yīng)鹽脅迫有一定的功能作用，在表型和表達(dá)量兩個(gè)指標(biāo)上過表達(dá)陽性植株較野生型均表現(xiàn)上升趨勢，過表達(dá)陽性植株較野生型有較好的生長狀態(tài)，表明Dof 基因在馬鈴薯底西芮中過表達(dá)后能夠起到耐鹽功能。本研究表明，在0、50 和100 mmol/L 鹽濃度處理下，過表達(dá)陽性植株與野生型在不同鹽濃度下對(duì)鹽的耐受性和敏感性均有差別。隨著鹽濃度的增加，過表達(dá)陽性植株與野生型生長明顯受到抑制，其株高、鮮重、根長、根數(shù)隨鹽濃度的增加而下降，而葉片數(shù)變化受鹽濃度高低影響不大，但過表達(dá)陽性植株下降趨勢較野生型緩慢，說明過表達(dá)陽性植株比野生型在鹽脅迫下生長狀態(tài)更好，提高抵御鹽脅迫的能力。不同濃度鹽脅迫下過表達(dá)陽性植株與野生型相比，過表達(dá)陽性植株的SOD、POD、CAT 三種酶活性均有不同程度的升高，說明過表達(dá)陽性植株在鹽脅迫下通過不斷增強(qiáng)酶活性來抵御植株損傷程度。本研究證明StDof5 在馬鈴薯耐鹽性方面發(fā)揮重要作用，這為深入研究StDof5 功能作用奠定基礎(chǔ)，也為后續(xù)篩選馬鈴薯耐鹽新品種提供指導(dǎo)和依據(jù)。

Dof 基因在馬鈴薯底西芮中經(jīng)過表達(dá)轉(zhuǎn)化后進(jìn)行鹽脅迫處理，表明該基因能夠抵御鹽脅迫保持植株正常生長，為馬鈴薯在鹽堿地能夠更好地生長提供一些依據(jù)。研究表明玉米Dof 的轉(zhuǎn)錄水平在干旱和鹽脅迫下上調(diào)表達(dá)，轉(zhuǎn)基因玉米Dof3 參與應(yīng)答鹽脅迫信號(hào)途徑，表現(xiàn)出極強(qiáng)抵御干旱和鹽脅迫的能力。胡蘿卜品種‘黑田五寸’‘君川紅’在響應(yīng)干旱和鹽脅迫時(shí)，不同胡蘿卜材料中DcDofD1 基因表達(dá)量不同，表明DcDofD1 基因?qū)Σ煌巧锬婢车膽?yīng)答是有差異的［48］。在鹽脅迫下，與野生型煙草相比，轉(zhuǎn)基因Dof2.2 煙草株系萎蔫程度高于WT 煙草植株，鹽脅迫處理后轉(zhuǎn)基因煙草葉片的葉綠素含量、可溶性糖含量及脯氨酸含量均顯著低于WT 煙草，而丙二醛含量則高于WT 煙草。目前StDof2 轉(zhuǎn)錄因子在彩色馬鈴薯中通過體外酵母單雜實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子具備轉(zhuǎn)錄激活活性，且活性位點(diǎn)位于蛋白的 C 端。本實(shí)驗(yàn)在馬鈴薯中克隆StDof5 基因，并檢測過表達(dá)植株的生長狀況及表達(dá)量，qPCR 結(jié)果表明過表達(dá)陽性植株中StDof5 的表達(dá)量都高于野生型，且該基因在馬鈴薯根中的表達(dá)量最高，與前人的研究結(jié)果一致。對(duì)StDof5 過表達(dá)馬鈴薯鹽脅迫下的功能進(jìn)行分析與驗(yàn)證，為挖掘StDof5 基因功能和研究植物抗逆分子機(jī)制提供參考。關(guān)于馬鈴薯敲除載體的構(gòu)建以及遺傳轉(zhuǎn)化還在進(jìn)一步的研究之中。

4 結(jié)論

鹽脅迫下，過表達(dá)陽性植株生長狀態(tài)優(yōu)于野生型，且過表達(dá)StDof5 在馬鈴薯中能夠調(diào)控相關(guān)鹽脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，從而提高馬鈴薯抵御鹽脅迫逆境能力。