增加革蘭陰性菌外膜囊泡產量的研究進展

劉燦 閆曉陽 曾焱 歐祥龍 廖永洪，2

（1.西南大學動物醫(yī)學院，重慶 402460；2.國家生豬技術創(chuàng)新中心，重慶 402460）

細菌外膜囊泡（outer membrane vesicles, OMVs）是大多數革蘭陰性菌在正常生理活動下分泌的一種納米級雙層膜囊泡狀結構，其直徑約為20-250 nm［1］，主要由細胞外膜的成分組成，包括豐富的外膜蛋白、脂多糖、肽聚糖以及一系列與宿主組織黏附和侵襲有關的毒力因子，同時也含有一些細胞內成分，例如DNA、RNA 和酶等，其組成成分決定它會影響細菌多種生物過程，包括生物膜的形成、DNA 轉移、營養(yǎng)攝取、抗菌防御和細胞物質與毒力因子的運輸等［2-3］。

OMVs 由于其結構穩(wěn)定、含有大量免疫原性良好的物質以及不具有復制能力等特點，使OMVs 成為疫苗研發(fā)環(huán)節(jié)中優(yōu)質的候選抗原［3］。目前，已有以OMVs 作為主要抗原成分的疫苗上市，其中最著名的是針對B 群腦膜炎奈瑟球菌開發(fā)的外膜囊泡疫苗［4-5］。此外，OMVs 還可以作為疫苗佐劑和載體平臺用于遞送抗原或藥物［6］。

OMVs 具有廣闊應用前景，但天然OMVs 產量低，因此增加其產量是產業(yè)化過程中必須解決的關鍵技術問題。本文主要從細菌基因改造、生長培養(yǎng)條件優(yōu)化和生產純化工藝優(yōu)化3 個方面對增加OMVs 產量研究的進展進行綜述，以期為OMVs 疫苗的相關研究提供參考。

1 外膜囊泡的生物發(fā)生機制

目前關于OMVs 的生物發(fā)生機制研究主要集中于3 個學說（圖1）［7］。

圖1 革蘭陰性菌外膜囊泡生物發(fā)生過程Fig.1 Biogenesis of outer membrane vesicles in gram-negative bacteria

1.1 壓力聚集學說

革蘭陰性菌的細胞膜由外膜（outer membrane,OM）和內膜（inner membrane, IM）組成，在OM 與IM 之間有一層肽聚糖（peptidoglycan, PG）連接OM和IM。Mcbroom 等［8］發(fā)現革蘭陰性菌OMVs 的產生是一種包膜應激反應，當細胞周質中存在錯誤折疊的有毒產物、高度過表達的蛋白質、肽聚糖片段以及脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）片段時，異常組分在局部聚集引起了包膜應激（圖1?a），最終外膜會包裹異常組分向外突出形成OMVs 并將其釋放。

1.2 膜交聯(lián)學說

膜交聯(lián)學說是最早提出的OMVs 生物發(fā)生機制，該學說將OMVs 的生物發(fā)生與囊泡形成部位的外膜-肽聚糖-內膜交聯(lián)的減少聯(lián)系起來（圖1?b），外膜和肽聚糖層通過交聯(lián)蛋白共價連接，并通過此連接與內膜共價連接。當去除連接外膜層與肽聚糖層的蛋白質、參與肽聚糖平衡代謝進而影響外膜層與肽聚糖層交聯(lián)的蛋白質以及連接外膜層與內膜層的蛋白質時，外膜的一部分會從肽聚糖層解離并向胞外凸起，夾斷后就形成了囊泡［9-11］。

1.3 脂類富集學說

在外膜中加入修飾過的曲率誘導分子，如LPS或磷脂等脂類，這些曲率誘導分子會改變外膜局部的膜磷脂組成成分、電荷或空間構型等，進而使外膜的曲率發(fā)生改變，導致OM 發(fā)生局部彎曲（圖1?c），OM?PG 連接被破壞，從而誘導OMVs 的形成和釋放［8,12-13］。

2 基于基因改造增加OMVs 產量的研究

通過基因改造的方法增加OMVs 產量的研究已在國內外有諸多報道，研究大多基于細菌自身OMVs 的生物發(fā)生機制進行設計，從而選擇相應的基因進行改造，以確認通過某些基因的改造是否能達到增加OMVs 產量的效果。

2.1 基于壓力聚集學說的基因改造

革蘭陰性菌OMVs 的產生是一種包膜應激反應，當革蘭陰性菌的周質中存在錯誤折疊的蛋白質廢物、PG 片段和LPS 片段時，這些廢物會被包裹在OMVs中并釋放［8］。因此在革蘭陰性菌中缺失參與修復和/或消除錯誤折疊的周質蛋白基因，基因缺失突變株都會表現出OMVs 產量增加。

人工誘導蛋白質廢物在周質中積累主要是通過缺失蛋白酶基因或缺失參與σE包膜應激反應途徑的蛋白質來實現。通常認為DegP 蛋白在高溫下主要作為蛋白酶發(fā)揮水解蛋白質的作用，以消除未折疊的外膜蛋白［13］。研究發(fā)現，在大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌和銅綠假單胞菌中缺失DegP 蛋白后均表現出囊泡增加［8］。值得注意的是，這種情況下增加的囊泡并不依賴于OM?PG 交聯(lián)水平減少［14］；degQ 基因編碼絲氨酸蛋白酶，其作用是斷裂大分子蛋白質中的肽鍵，使之成為小分子蛋白質，對Shewanella oneidensis degQ 突變株進行OMVs 定量評估表明，與野生型菌株相比，degQ 突變株的OMVs產量增加了5 倍［15-16］。在多數革蘭陰性菌中，σE包膜應激反應途徑由錯誤折疊的外膜蛋白激活，導致σE轉錄因子的釋放以及消除錯誤折疊的外膜蛋白的基因的轉錄活化［17］。degS 基因編碼屬于HtrA 家族的內膜錨定的周質內肽酶，在存在未折疊蛋白（例如外膜蛋白）的情況下，DegS 參與釋放σE并激活參與修復和/或消除錯誤折疊的周質蛋白的基因的轉錄［17］。目前僅有鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌中有degS 缺失的研究報道，其結果表明degS 缺失后，囊泡的產量明顯增加［18］；此外，還有一種同樣參與σE包膜應激反應途徑的RseA 蛋白，目前僅在鼠疫桿菌中進行了基因缺失，其突變株也表現出高囊泡性［19］。

人工誘導PG 片段在周質中積累主要通過抑制細菌的肽聚糖回收循環(huán)和β-內酰胺酶誘導過程［20］。Schwechheimer 等［20］的研究發(fā)現在大腸桿菌ΔampGΔamiD 雙基因突變株（AmpG：IM 滲透酶，負責將多肽從周質轉運到細胞質以進行肽聚糖循環(huán)；AmiD：β-內酰胺酶）中，存在PG 片段過大無法通過孔蛋白而在周質中聚集的現象，與野生株相比，突變株OMVs 產量增加了約14 倍。此外，牙齦卟啉單胞菌自身溶血素的突變株（ami 突變）也表現出OMVs 產量增加。因為缺乏自身溶血素活性阻止了牙齦卟啉單胞菌降解周質肽聚糖片段，周質中不能被降解的肽聚糖則發(fā)生聚集并通過OMVs 排出［21］。

最近研究結果表明，大腸桿菌ΔrfaC，ΔrfaG 和ΔrfaP 突變株改變了LPS 核心多糖結構，包膜中LPS合成過程被破壞從而導致細菌周質出現LPS 積累，對上述3 株突變株OMVs 產量分析發(fā)現OMVs 產量均增加［20］。

2.2 基于膜交聯(lián)學說的基因改造

膜交聯(lián)學說涉及到的蛋白質可以分為1.2 中所述的三類蛋白，在大多數革蘭陰性菌中缺失相關的蛋白基因后，基因缺失突變株表現出OMVs 的產量增加。

連接外膜層與肽聚糖層的蛋白有Pal、Lpp、NlpI 和OmpA 蛋白等脂蛋白或外膜蛋白［1］。Pal 定位于外膜的內層，與肽聚糖層相互作用，促進膜的穩(wěn)定性，Pal 蛋白的破壞會導致沙門氏桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、霍亂弧菌等多種革蘭陰性菌的OMVs 釋放增加［12,22］；Lpp 是革蘭陰性菌中的主要外膜脂蛋白，是唯一與肽聚糖層相連并在包膜結構中起獨特作用的共價脂蛋白，Lpp 的N 端結構域被?；⒉迦氲酵饽ぶ?，而C 端結構域與肽聚糖層共價連接［22］。Lpp 的失活會導致銅綠假單胞菌、大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏桿菌的OMVs 產量增加［18,23］；OmpA 蛋白是革蘭陰性菌的主要外膜蛋白之一，它在外膜和底層肽聚糖層之間提供物理聯(lián)系，即連接作用［11］。缺失ompA 會導致大腸桿菌、沙門氏菌和霍亂弧菌的外膜囊泡增加［20］。

NlpI 是一種脂蛋白，不僅部分決定（約40%）Lpp?PG 交聯(lián)的形成，還可以通過參與肽聚糖分解和合成的平衡，影響肽聚糖層結構，進而影響外膜與肽聚糖層交聯(lián)。在沙門氏菌、銅綠假單胞菌、幽門螺旋桿菌和副豬嗜血桿菌中nlpI 基因缺失均導致OMVs 產量增加［13］。除nlpI 外，能影響肽聚糖的合成與重塑的基因還有mrcB 和yipP［18］。據報道，在大腸桿菌和傷寒沙門氏菌中缺失mrcB 會影響包膜穩(wěn)定性，促進囊泡分泌［20］。yibP 基因（也稱為envC）編碼一種與細胞分裂和肽聚糖水解相關的酶，缺失yibP 會導致細菌分裂缺陷，在大腸桿菌和沙門氏菌中會產生絲狀細菌，但是突變株的OMVs 產量會增加［18］。

連接外膜層與內膜層的蛋白質主要包括TolA、TolB、TolQ 和TolR 等 蛋 白， 其 中TolA、TolQ 和TolR 在內膜形成一個復合體，而TolB 是一個外膜蛋白，與Lpp、OmpA 和Pal 相互作用，這4 種蛋白與Pal 蛋白組成Tol?Pal 系統(tǒng)，這些蛋白中任何一個發(fā)生突變都會導致外膜完整性出現缺陷（周質內容物泄漏、洗滌劑不耐受），但是也會出現OMVs 產量增加［1,18］。研究還發(fā)現，Tol 蛋白或與Tol?Pal 系統(tǒng)相互作用的蛋白質（例如絲狀噬菌體的次要外殼g3p 蛋白和大腸桿菌素的易位結構域）過量表達導致特異性地破壞細胞包膜的穩(wěn)定性從而誘導囊泡大量產生［3］。上述蛋白基因中最令人感興趣的是tolR，該基因已被證明可使不同革蘭陰性菌（包括大腸桿菌、志賀氏菌和沙門氏菌）的囊泡增產至足以支持疫苗試驗。盡管膜完整性受損，但缺失tolR 的細菌已成為OMVs 應用的寶貴工具，因為缺失株能產生由外膜相關蛋白和周質蛋白組成的均勻OMVs，同時OMVs 內還不含有由于基因編輯而“泄漏”的內膜相關蛋白和細胞質蛋白［24］。此外，還可以進一步進行基因工程改造加工OMVs，例如設計抗原呈遞。迄今為止已測序的所有革蘭陰性菌的基因組中均發(fā)現有Tol?Pal 系統(tǒng)蛋白的同系物，因此Tol?Pal 編輯很可能是囊泡大量生產的通用策略。事實上，Tol?Pal 途徑的修飾已被證明可以增加非致病性大腸桿菌、腸外致病性大腸桿菌、福氏志賀氏菌、沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的OMVs 產量［1,12,20,25］。

2.3 基于脂類富集學說的基因改造

在外膜層中加入修飾過的磷脂或LPS 等曲率誘導分子，使OM 的曲率發(fā)生變化，OM?PG 連接被破壞，從而促進產生OMVs［2,9,26-27］。

通過膜磷脂的修飾改變細菌OM 曲率進而增加OMVs 產量的方法主要涉及兩方面。第一方面是通過基因修飾改變膜磷脂的組成成分，膜磷脂成分的改變會導致外膜曲率發(fā)生改變，進而會引起包膜應激［3］。嗜冷的南極細菌Shewanella livingstonensis Ac10 的orf5 和plsC1 基因在其合成二十碳五烯酸（EPA）的過程中起著至關重要的作用，二十碳五烯酸是其膜磷脂的組成成分，作為磷脂的酰基存在于細胞膜中；另外該細菌的plsC1 和plsC4 基因編碼參與膜磷脂合成的?；D移酶。Yokoyama 等［15］分別構建該細菌的orf5、plsC1 或plsC4 基因缺失突變株，發(fā)現突變株的膜磷脂的組成成分發(fā)生了改變，并對缺失株進行囊泡產量進行定量分析。結果表明，基因缺失株的OMVs 產量增加了約5 倍；第二方面是通過基因修飾影響磷脂由外膜向內膜的逆行轉移過程，導致磷脂在外膜中積累，影響外膜的曲率。在革蘭陰性菌中，OmpC?Mla 系統(tǒng)負責將外膜外層中錯位磷脂運送到內膜。MlaA 脂蛋白與嵌入外膜的OmpC 蛋白相互作用，并將外膜外層中的磷脂轉移到該系統(tǒng)的另一個組成成分MlaC 蛋白。隨后MlaC將這些磷脂送到位于內膜的MlaFEDB 復合物，該復合物可以將磷脂重新整合到內膜上。Sutterlin 等［28］構建了大腸桿菌mlaA 缺失突變株，發(fā)現突變株囊泡產量增加，但是突變株會因為囊泡的過度產生而降低外膜中的脂質水平，降低的脂質水平會被來自內膜的脂質所補充，而內膜脂質的降低會導致細胞裂解。Roier 等［10］突變了流感嗜血桿菌的vacJ 和yrbE基因，它們分別與大腸桿菌的mlaA 和mlaE 基因同源，vacJ 和yrbE 突變株的囊泡產量分別增加了1.6倍和2.2 倍，同時在霍亂弧菌和空腸彎曲桿菌中構建了vacJ 和yrbE 的突變株，也發(fā)現突變株外膜囊泡產量增加。

通過LPS 的修飾改變細菌OM 曲率進而增加OMVs 產量的方法主要分為兩方面。第一方面是改變LPS 攜帶的電荷。有研究指出，LPS 可以在OMVs 中富集，直接或間接影響OMVs 組成和外膜曲率，進而影響OMVs 產量［29］。例如，銅綠假單胞菌產生兩種含有不同O 側鏈抗原的LPS：帶中性電荷的LPS 和帶負電荷的LPS，對OMVs 進行檢測發(fā)現囊泡內僅有帶負電荷的LPS，對這個現象的假設是OMVs 是在帶負電荷的LPS 更豐富的區(qū)域產生的，并且電荷排斥會導致外膜曲率發(fā)生改變進而促進外膜彎曲釋放OMVs，在僅產生帶負電荷的LPS 的菌株中發(fā)現OMVs 產量增加也證實了這種假設［30］；鼠腸道病原體嚙齒枸櫞酸桿菌中的pmrC 和cptA 均負責LPS 修飾，PmrC 和CptA 起連接磷酸乙醇胺和核心多糖的作用。但是成功連接后細菌內帶負電荷的LPS 的合成減少，所以在嚙齒枸櫞酸桿菌的ΔcptA 和ΔpmrC 突變株中，OMVs 的分泌量都高于野生株［31］。第二方面是改變LPS 的空間構型。PagL 是一種通過去除?；渷硇揎椫|A 的酶，在鼠傷寒沙門氏菌中，表達PagL 的菌株外膜顯示六?；|A 占主導地位，而在OMVs 主要含有五?；|A。上述差異現象是由于完全?；兔擋；闹|A 其疏水部分橫截面的變化而具有不同的空間構型導致的，六?；|A 呈圓錐形，而脫?；|A 呈圓柱形或倒錐形，具有圓柱形或倒錐形的脂質會增大膜曲率，導致外膜突出并形成OMVs。所以當PagL 在鼠傷寒沙門氏菌中過表達時，產生的OMVs 幾乎是野生株的4 倍［20,30］。

此外，還有一種獨特的僅限于銅綠假單胞菌和產生喹諾酮信號（pseudomonas quinolone signal, PQS）的相關細菌的雙層耦合模型，銅綠假單胞菌分泌的PQS 會插入OM 中增大OM 曲率，使OM 迅速擴增，最終導致囊泡形成［32］。在其他革蘭陰性菌中添加外源性PQS 也會刺激OMVs 的形成，在銅綠假單胞菌中缺失oprF 基因會上調PQS 來誘導OMVs 的分泌［9,25］。

3 基于優(yōu)化生長條件增產OMVs

細菌OMVs 的產生是一種受環(huán)境控制的特定的分泌過程，在生產OMVs 的時候，對細菌進行特定的一些處理。物理刺激如溫度、溶解氧含量和超聲處理等；生化刺激如洗滌劑樣分子、抗生素、抗菌肽和提取劑等；以及限制生長所需的營養(yǎng)元素如鐵、氨基酸和硫酸鹽等，均會對OMVs 的生成產生一定影響［33-38］。

3.1 物理條件刺激增加OMVs產量

研究表明，生長溫度對絕大多數細菌的OMVs產生均有影響。37℃培養(yǎng)條件下大腸桿菌的囊泡產量約為30℃培養(yǎng)條件下的5 倍。這種現象在大腸桿菌degP 缺失突變株中顯著增強，OMVs 產量增加超過150 倍［37-38］。推測其原因可能是由于degP 缺失突變株周質中錯誤折疊的蛋白質水平升高，從而激活影響囊泡的應激反應途徑，且膜也變得更有流動性，使OM 能夠凸起并釋放OMVs。另外，較高的生長溫度也會增加細胞分裂的速度，同時增加細胞壁的生長和周轉率，進一步促進OMVs 的釋放。百日咳桿菌和支氣管敗血波氏桿菌在55℃下孵育1 h可顯著增強OMVs 釋放，且不會影響蛋白質的含量和構象。并且熱休克蛋白GroEL 的含量在溫度變化后沒有增加，這可能是因為在56℃時細菌體內蛋白質的合成完全受到抑制［39-41］。

在工業(yè)生產OMVs 的過程中，通過控制培養(yǎng)液中的溶解氧含量，可以在發(fā)酵罐中通過氧化應激反應刺激細菌產生更多的OMVs［42-43］。例如在腦膜炎奈瑟球菌中，將溶氧含量從30%增加到150%后，OMVs 的產量提高了4 倍［42-43］，其作用機制可能是OMVs 的釋放可以減輕細菌承受的氧含量高的環(huán)境壓力。這種以釋放OMVs 的形式減輕環(huán)境應激壓力的方式可能與細菌為消除錯誤或未折疊蛋白質而釋放OMVs 的形式相似。然而在銅綠假單胞菌中，將有氧培養(yǎng)改變?yōu)槿毖跖囵B(yǎng)，OMVs 產量提高了6 倍，該現象的調節(jié)機制尚未得到進一步研究［43］。

在副豬嗜血桿菌中，可以通過超聲處理來誘導OMVs 的分泌［11］。但是這種方法是通過對細菌沉淀進行超聲處理來制備，超聲使細菌的膜破碎并融合裂解形成OMVs，由于上述OMVs 不是從細菌上清液制備的，而細菌上清液是傳統(tǒng)天然OMVs 的聚集地，因此超聲誘導的OMVs 可能含有天然OMVs 中并不存在的物質。所以，盡管通過細菌超聲處理獲得了高OMVs 產量，但由此產生的囊泡并不一定含有天然OMVs 的蛋白組成。因此，若想要將超聲處理誘導的OMVs 作為疫苗開發(fā)還需要進一步研究。

3.2 生化條件刺激增加OMVs產量

洗滌劑提取OMVs 是傳統(tǒng)工業(yè)生產中使用最廣泛的方法，第一代腦膜炎奈瑟菌B 群OMVs 疫苗即是基于洗滌劑提取制備的［7］。洗滌劑樣分子例如脫氧膽酸鹽或十二烷基硫酸鈉處理細菌后，洗滌劑與細菌膜相互作用以增加外膜囊泡的形成，同時去除外膜中的LPS，由此產生的OMVs 缺乏LPS，缺乏LPS 的OMVs 減少了動物機體對LPS 的炎癥反應［44］。然而LPS 丟失的同時會導致許多抗原的丟失。此外，OMVs 的內在佐劑活性在LPS 去除時同樣會喪失。所以這種制備方法的使用在現代生產中越來越少，科學家們一直致力于尋找新的方法來誘導OMVs 釋放并減少LPS 的毒性。

現代生產中常用的誘導OMVs 的另一種方法是使用提取分子，如EDTA。這些提取分子旨在破壞細菌膜的穩(wěn)定性，從而達到增產OMVs 的目的［4,44］。其具體作用原理為EDTA 作為一種螯合劑，可以去除環(huán)境中的鈣離子，而細菌體內鈣離子通過中和LPS 和其他陰離子脂質的負電荷來穩(wěn)定細胞壁。鈣離子的去除會導致LPS 的負電荷相互排斥，從而破壞膜的穩(wěn)定性。但EDTA 的作用相對來說比較溫和，因此會在OMVs 中保留LPS 和天然成分［4］。因此，使用EDTA 可以提高OMVs 的產量，并且這些OMVs 更適合用于疫苗開發(fā)，但由于LPS 仍然存在，且缺乏鈣離子，因此這些OMVs 可能尚不穩(wěn)定。

目前增加OMVs 釋放的另一種方法是通過補充外部分子來誘導膜應激，例如天然存在的抗菌肽（antimicrobial Peptides, AMPs）［37,43］。AMPs 是 先 天免疫系統(tǒng)的一部分，可由不同的細胞類型表達。其通常對細菌膜具有高親和力，能破壞膜的完整性，使細胞內外屏障喪失，從而殺死細菌，因此AMPs增加OMVs 的產生可能是細菌免受誘導應激的一種手段［45］。此外還有多肽類抗生素，如多黏菌素B 和多黏菌素E 等，這些分子也被證明可以誘導OMVs釋放。它們誘導OMVs 的機制可能與AMPs 機制相似，即基于膜的破壞導致細菌應激并釋放OMVs［37,43］。

靶向細菌胞內發(fā)揮作用的抗生素也被證明可以誘導OMVs 釋放，例如環(huán)丙沙星、慶大霉素、氨芐西林和亞胺培南等。Maredia 等［46］證實，與未處理的細菌相比，用環(huán)丙沙星處理的銅綠假單胞菌OMVs 的產量增加了100 倍；同樣是在銅綠假單胞菌中，有研究表明抗生素會誘導PQS 分泌，而PQS 又被證明誘導OMVs 形成，因此在這個過程中OMVs 的形成可能與細菌對抗生素的反應有關［47-48］；有學者對通過慶大霉素誘導腸外致病性大腸桿菌產生的OMVs 進行表征和質譜法分析，發(fā)現誘導得到的OMVs 直徑沒有改變。相對于天然OMVs，抗生素誘導得到的大多數OMVs 內存在大量細胞質和周質蛋白，這些蛋白可能是慶大霉素干擾核糖體機制后形成的錯誤折疊蛋白質［49］；另外由氨芐西林誘導的大腸桿菌OMVs 也被證明含有過量的Pal 蛋白，進一步證明抗生素可以改變OMVs 內物質［33,49］；在另一項研究中，將鮑曼不動桿菌用四環(huán)素和亞胺培南刺激，并且對所得的OMVs 進行了定量分析。四環(huán)素沒有誘導OMVs 釋放，但與未經處理的對照組相比，OMVs 產量在暴露于亞胺培南后增加了2.2 倍，并且外膜蛋白和蛋白酶含量均相對增加。此外埃伐環(huán)素誘導鮑曼不動桿菌產生的OMVs 同樣不僅含有相對更多的外膜蛋白，還含有抗性相關蛋白，如ATP 結合盒式蛋白（ABC 轉運蛋白）和其他轉運蛋白［34,50］。結果表明這種誘導方法的可能風險，即亞致死濃度的抗生素可能導致細菌對抗生素耐藥性的產生。

3.3 限制生長所需的營養(yǎng)元素增加OMVs產量

在試驗或者生產中，通過補充鐵螯合物質如去鐵氧胺、乙二胺二羥基苯乙酸和雙嘧啶來實現對培養(yǎng)基進行鐵限制。幽門螺桿菌中在鐵限制培養(yǎng)條件下會導致OMVs 產量顯著增加，但OMVs 中相關毒力因子VacA 的表達降低，鐵鹽環(huán)境能夠恢復其表達水平［43］。同樣，對流感嗜血桿菌、大腸桿菌和霍亂弧菌產生的OMVs 的研究發(fā)現，鐵限制條件有利于OMVs 產量的增加［35,39］。對腦膜炎奈瑟菌的研究表明，半胱氨酸的耗竭可以引發(fā)細菌生長停滯，并釋放出足夠數量的OMVs 以用于疫苗生產，這些囊泡是自發(fā)釋放的，且與人類疫苗生產系統(tǒng)所需的囊泡高度相似。通過轉錄組分析表明，在該研究中半胱氨酸消耗會損害鐵硫蛋白組裝引起氧化應激作為囊泡增加的細胞內信號［51］。

由于半胱氨酸消耗時增強的OMVs 釋放與氧化應激和氧化還原反應有關，因此該團隊進一步研究了更多氧化硫源對OMVs 釋放的影響。結果表明，腦膜炎奈瑟菌在硫酸鹽（氧化硫源）上的生長過程相似，OMVs 釋放通常由硫消耗引發(fā)。硫酸鹽耗竭導致OMVs 釋放增加超過半胱氨酸耗竭。蛋白質組學表明，硫消耗還會導致氧化應激反應并上調磷脂和LPS 生物合成。此外，硫消耗產生的OMVs 中磷脂富集［51］。因此對該現象推測為硫消耗引起磷脂過度產生，進而導致外膜膨脹增加并隨后釋放OMVs。

4 基于優(yōu)化生產工藝提升OMVs 產量

實驗室及工業(yè)生產中，OMVs 典型的工藝流程包括以下步驟：（1）在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；（2）去除完整的細菌：低速離心法去除大部分細菌，其余細菌通過無菌過濾進一步消除；（3）濃縮培養(yǎng)物濾液：可以直接對培養(yǎng)物濾液進行超速離心，由于通常取得的OMVs 濃度較低，在離心之前，可以使用沉淀或超濾來預濃縮濾液；（4）純化：根據生產的OMVs 制劑所需的純度，選擇一種合適的純化方法以除去其他細胞外物質如鞭毛、纖毛、毛狀體和大蛋白質復合物或聚集體等，常用的純化方法有密度梯度離心和凝膠過濾［39,52］。

在生產中對這套工藝流程進行優(yōu)化，使用新的技術代替原有步驟是一個很好的切入點。例如OMVs 傳統(tǒng)上是通過超速離心、梯度離心、超濾或尺寸排阻色譜法分離［53］，但這些技術或者具有相對較高的操作成本，或者缺乏大規(guī)模生產所需的可靠性、產量和可重復性。相反有一種新的靜水過濾透析（HFD）分離方法，作為通過選擇性富集尿液樣本快速識別細菌性尿路感染的一種方法［54］?，F已有實驗成功地將其用于從革蘭陰性病原體肺炎放線芽孢桿菌和厭食桿菌中大規(guī)模分離OMVs［52］。HFD已被證明是一種經濟高效且簡單可靠的OMVs 分離方法，特別是在需要大量OMVs 的情況下，例如體內免疫試驗。HFD 的另一個優(yōu)點是，它提供了相當一致的批次再現性，這一特征對于疫苗開發(fā)至關重要［52］。由于HFD 最近才被開發(fā)為OMVs 分離技術，因此目前使用HFD 進行OMVs 分離的研究較少，無法與其他OMVs 分離方法進行適當的比較。盡管如此，HFD 仍然是大規(guī)模生產OMVs 疫苗最有前途的技術之一。

此外，目前的OMVs 生產工藝大多是批量工藝，批量工藝生產OMVs 的特點是產量相對較低，成本較高。而將OMVs 生產過程從批量處理過渡到連續(xù)處理可以提高體積生產率，提高設備利用率，縮短周期時間和減少設施占地面積，從而降低生產和投資成本，并產生更高質量的產品［55］。批量處理即原材料在工藝開始時被裝入系統(tǒng)，產品被一次性排出，并且在原料充填和產品排出之間，沒有任何成分會排出系統(tǒng)；而連續(xù)處理則是在整個工藝過程中，原料和產品分別不斷地被注入和排出系統(tǒng)。Gerritzen 等［56］研究了腦膜炎奈瑟菌OMVs 的持續(xù)生產工藝，當連續(xù)培養(yǎng)腦膜炎奈瑟菌達到穩(wěn)定狀態(tài)時，其OMVs 濃度與周質在批量工藝中達到的濃度相似，并且連續(xù)培養(yǎng)時穩(wěn)態(tài)是可重復的，可以保持至少600 d。當稀釋速率達到L/d 時，連續(xù)培養(yǎng)的體積生產率可達到4.0×1014OMVs/（L·d）（稀釋速率等于培養(yǎng)液在發(fā)酵罐中平均停留時間的倒數），通過提高稀釋率來優(yōu)化體積生產率，可以進一步強化該過程。當以3.6/d 的稀釋速率連續(xù)生產OMVs 時，與批量OMVs 生產相比，OMVs 產量增加了9 倍。在實驗過程中，OMVs 的測試特性沒有變化，表明連續(xù)生產工藝對于任何應用的OMVs 生產都是可行的。

5 展望

革蘭陰性菌OMVs 的納米尺寸、脂質膜結構以及遠距離遞送活性分子等特點，使其成為具有廣泛應用前景的疫苗開發(fā)平臺［6,57］。但天然OMVs 的產量較低，因此在實驗室和工業(yè)生產中提高OMVs 產量是未來OMVs 疫苗研究和開發(fā)的關鍵環(huán)節(jié)，本文綜述了通過遺傳基因改造、物理條件刺激、生化條件刺激、限制生長所需的營養(yǎng)元素和優(yōu)化生產工藝等方式增加OMVs 產量的研究進展。目前已有的絕大部分增產方法僅在實驗室里應用，具體應用到實際生產中還有待進一步研究。此外還需要不斷的尋找新的低成本、簡易的增產方法以滿足生產所需。在研究增產的同時還應該考慮到，這些干預措施中的任何一種方法都可能會引起OMVs 成分的變化，這在疫苗開發(fā)中可能是有利的，因為OMVs 本身可以被認為是免疫調節(jié)蛋白的“載體”，通過結合遺傳操作、培養(yǎng)條件以及分離和純化方案，可以設計囊泡內容物以滿足疫苗開發(fā)的需求。此外，由于人工干預的囊泡與細菌生理釋放的天然囊泡大不相同，因此在研究OMVs 的生理和環(huán)境作用時，應避免對囊泡釋放過程的影響。最后，基于OMVs 的疫苗開發(fā)還有一個挑戰(zhàn)，就是由于LPS 的存在而導致的體內毒性效應，雖然現在已經研究了許多方案，例如通過遺傳修飾和洗滌劑處理等以降低毒性，但要在增產和減毒之間達到理想平衡，還有很長的路要走。