貝萊斯芽孢桿菌生防次級(jí)代謝產(chǎn)物研究進(jìn)展

許沛冬 易劍鋒 陳迪 潘磊 謝丙炎 趙文軍

（1.三亞中國(guó)檢科院生物安全中心，三亞 572024；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100000；3.海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，?？?570228）

芽孢桿菌類（Bacillus spp.）微生物分布廣泛，對(duì)環(huán)境無污染，是重要的有益微生物。許多芽孢桿菌菌株已經(jīng)作為生物殺菌劑、殺蟲劑、殺線蟲劑以及植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑進(jìn)行商業(yè)化開發(fā)利用［1-2］。貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）是芽孢桿菌中最重要的代表性生防菌，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)中［3-5］。B.velezensis 的命名經(jīng)歷了長(zhǎng)時(shí)間的修正與更迭，隨著分子生物學(xué)技術(shù)和組學(xué)手段的應(yīng)用，近5 年來，芽孢桿菌的分類更加清晰和明朗，許多商業(yè)化的菌株被重新分類為B.velezensis［6-7］；并且這些菌株已經(jīng)制備成生物防治劑廣泛用于控制各種病原微生物，如RhizoVital?（B.amyloliquefaciens subsp.plantarum FZB42）、Serenade?（B.subtilis QST713）、Kodiak?（B.subtilis GB03）、Taegro?（B.subtilis var.amyloliquefaciens FZB24） 等［8］。B.velezensis 模 式菌株FZB42，曾分類為B.amyloliquefaciens subsp.plantarum，已配制成商業(yè)化生物防治劑RhizoVital?，用于控制植物土傳病害；同時(shí)該菌株能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)，并且產(chǎn)生不同類型具有生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，從而抑制植物病原菌群［9］。盡管B.velezensis和B.subtilis 的基因組高度相似，但B.subtilis 物種基因組中僅有4%-5%與抑菌物質(zhì)的合成有關(guān)，而B.velezensis 基因組中有10%用于抑菌物質(zhì)的合成［10］。得益于B.velezensis 具有能夠產(chǎn)生豐富次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力，作為益生菌在動(dòng)物飼料工業(yè)中也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值［11］。然而基于次級(jí)代謝產(chǎn)物的芽孢桿菌生物防治劑依舊存在知識(shí)空白和瓶頸，主要包括在細(xì)胞和分子水平上，次級(jí)代謝產(chǎn)物活性物質(zhì)的表征和生物防治劑組合物協(xié)同增效作用尚不清晰，生物防治劑的作用機(jī)制并不明確；此外，由于田間的各種環(huán)境因素，如土壤化學(xué)、生物和非生物脅迫等，導(dǎo)致生物防治劑的田間應(yīng)用效果很難預(yù)測(cè)［12］。因此，對(duì)貝萊斯芽孢桿菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究，有利于解析芽孢桿菌的生防機(jī)制，以及菌株作為生物防治劑的商業(yè)化進(jìn)程，故而本文對(duì)貝萊斯芽孢桿菌的命名、次級(jí)代謝產(chǎn)物類型、合成和調(diào)控基因、靶標(biāo)病原等進(jìn)行綜述，以期為后續(xù)生防菌劑的改良和生物農(nóng)藥的研發(fā)提供理論參考。

1 貝萊斯芽孢桿菌的命名與更迭

B.velezensis 的分類經(jīng)歷了很長(zhǎng)時(shí)間的混淆，一方面，傳統(tǒng)的表型方法很難準(zhǔn)確區(qū)分芽孢桿菌屬各個(gè)種；另一方面，由于基因的高度保守性，16S rRNA 系統(tǒng)發(fā)育分析也無法區(qū)分類群中的部分種［6］。2004 年，B.subtilis、B.amyloliquefaciens、B.licheni?formis、B.pumilus 由于具有相似的表型和系統(tǒng)發(fā)育特征，被統(tǒng)一為“枯草芽孢桿菌復(fù)合體（B.subtilis species complex）”［13］。2005 年，B.velezensis（菌 株CR?502T和CR?14b）從西班牙馬拉加省托雷德爾馬爾的Vélez 河河口采集的環(huán)境樣本中被分離出來［14］。表型分析和系統(tǒng)發(fā)育表明，這些菌株與B.subtilis和B.amyloliquefaciens 具有親緣性，但是進(jìn)一步的DNA?DNA 雜交實(shí)驗(yàn)表明，新菌株與芽孢桿菌其他物種的相似性不到20%，代表了一類新的芽孢桿菌［14］。2011 年，基于全基因組分析，B.amyloliquefaciens 被分為兩個(gè)亞種：B.amyloliquefaciens subsp.amyloliq?uefaciens（模式菌株為DSM7）和B.amyloliquefaciens subsp.plantarum（模 式 菌 株 為FZB42）［15］。2015-2016 年，基于比較基因組分析，B.amyloliquefaciens subsp.plantarum 與B.velezensis、B.methylotrophicus表型和基因型高度一致，被界定為同物異名［3,16］。2017 年，通過rpoB 基因序列和核心基因組比較分析，B.amyloliquefaciens subsp.plantarum 和B.methy?lotrophicus 統(tǒng) 一 為B.velezensis，B.amyloliquefaciens類群整合劃分為3 個(gè)種，即B.amyloliquefaciens、B.siamensis、B.velezensis［4］。隨著基因組時(shí)代的到來，基于基因組序列的多種方法被用于包括B.subtilis 類群在內(nèi)的芽孢桿菌的鑒定與分類，包括平均核酸均一性（average nucleotide identity, ANI）、平均氨基酸均 一 性（average amino acid identity, AAI）、DNA 雜交（DNA?DNA hybridization, DDH），同時(shí)它們作為種間判定的依據(jù)，界定閾值分別設(shè)定為DDH=70%、ANI=95%、AAI=95%［17］；截至2023 年9 月，NCBI（National Center for Biotechnology Information）已公布的B.velezensis 全基因組序列共有665 個(gè)，其中裝配注釋完整的共有303 個(gè)，B.velezensis 的分類地位得到進(jìn)一步的明確和穩(wěn)固（圖1）。

圖1 貝萊斯芽孢桿菌分類學(xué)地位的變遷Fig.1 Changes in the taxonomic status of B.velezensis

2 貝萊斯芽孢桿菌的生防作用機(jī)制

貝萊斯芽孢桿菌的生防機(jī)制通常包括以下3 個(gè)方面：（1）產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)抗病原體和害蟲；（2）改善宿主植物微生物群落，促進(jìn)宿主營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)；（3）刺激植物宿主防御，產(chǎn)生系統(tǒng)抗性（induced systemic resistance, ISR）［1,10,18-19］。國(guó) 內(nèi) 外 許 多 研究報(bào)道了貝萊斯芽孢桿菌可以產(chǎn)生抑制植物病原菌和線蟲生長(zhǎng)的活性物質(zhì)［2,20-21］。這類物質(zhì)包括抗生素（antibiotics）、鐵載體（siderophores）、揮發(fā)性有機(jī)化合物（volatile organic compounds, VOCs）、裂解酶（lytic enzymes）和解毒酶（detoxification enzymes）等［21-22］。其中，抗生素阻止細(xì)菌定植；鐵載體從土壤中螯合鐵；氰化氫等揮發(fā)物可以抑制真菌病原體的生長(zhǎng)；裂解酶可以降解包括幾丁質(zhì)（真菌細(xì)胞壁）在內(nèi)的許多有機(jī)化合物；解毒酶可防止致病毒素造成的損害［22-23］。B.velezensis GB03 產(chǎn)生的VOCs 會(huì)觸發(fā)ET/JA 響應(yīng)性植物防御基因PDF1.2 的合成［24］；B.velezensis FZB42 鑒定出可以產(chǎn)生13 種VOCs，其中benzaldehyde、1,2?benzisothiazol?3（2 H）?one和1,3?butadiene 可以抑制植物細(xì)菌性青枯病病原體茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）［25］。B.velezensis FZB42 產(chǎn)生的表面活性素（surfactin）可以有效抑制由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的多年生黑麥草（Lolium perenne）灰葉斑病；產(chǎn)生的桿菌霉素（bacillomycin D）可以有效抑制小麥、玉米（Zea mays）上的病原菌禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）；此外FZB42 還可以產(chǎn)生聚酮化合物macrolactin 和difficidin［26-27］。B.velezensis SQR9產(chǎn)生的脂肽類化合物fengycin 和bacillomycin D，聚酮化合物macrolactin、difficidin 和bacillaene，二肽bacilysin，胞外多糖（exopolysaccharides）和VOCs可以抑制植物病原菌丁香假單胞菌番茄致病變種（Pseudomonas syringae pv.tomato）和灰霉菌（Botrytis cinerea）［28］。由此可知，芽孢桿菌主要通過產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物來直接對(duì)抗植物病原細(xì)菌和真菌，這是它最直接的生防機(jī)制。

3 貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物的類型

自青霉素（penicillin）這一類主要來源于微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)以來，科學(xué)家們?cè)噲D從微生物中分離出新的化合物，作為藥物或殺蟲劑的天然物質(zhì)。近年來，許多B.velezensis 菌株被鑒定為含有大量編碼用于生產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物的基因簇，其中包括編碼聚酮化合物合酶（polyketide synthases,PKS）和非核糖體肽合成酶（non?ribosomal peptide synthetases, NRPS）的基因簇，而這些具有生物活性的代謝產(chǎn)物成為了天然新藥和候選抗生素的儲(chǔ)存庫(kù)［8,29］。首個(gè)B.velezensis 基因組（FZB42 基因組）于2007 年注釋完成，并發(fā)現(xiàn)該基因組中存在9 個(gè)基 因 簇（ 即srf、bmy、fen、dhb、bac、min、bae、dfn 和nrs），其大小約占整個(gè)基因組的10%［30］。在這9 個(gè)基因簇中，有5 個(gè)編碼合成非核糖體脂肽類化合物（non?ribosomal lipopeptides, LPS），這一合成過程依靠于非核糖體肽合成酶，主要包括3 種化合物surfactins（srf）、bacillomycin?D（bmy）、fengycins（fen）或plipastatins（pps）［31］。另一大類，是在聚酮合成酶指導(dǎo)下合成聚酮類化合物（polyketides），例 如macrolactin（mln）、bacillaene（bae）、difficidin（dfn）［9,32］。 此 外，bac 基 因 簇 指 導(dǎo) 抗 菌 二 肽bacilysin 的合成和表達(dá)［33］；核糖體途徑的次級(jí)代謝產(chǎn)物amylocyclicin 和plantazolicin 也被鑒定出來［34-35］。另一類次級(jí)代謝產(chǎn)物并非直接作用于病原微生物，如鐵載體bacillibactin（dhb），它可以通過與病原微生物競(jìng)爭(zhēng)鐵等營(yíng)養(yǎng)素起到保護(hù)植物的作用［36-37］。不同貝萊斯芽孢桿菌菌株產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物并不相同，如B.velezensis HAB?2 菌株編碼13 個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇，其中包括8 個(gè)合成已知化合物的基因簇，分別參與mersacidin、bacilysin、bacillibactin、difficidin、fengycin、bacillaene、macrolactin、surfactin 的生物合成；其余5 個(gè)合成未知化合物的基因簇［17］。由此可知，隨著基因組測(cè)序技術(shù)的普及以及多組學(xué)的應(yīng)用，將有大量未知的次級(jí)代謝產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)，B.velezensis 潛在的抑菌機(jī)制值得我們深入挖掘。

4 核糖體途徑產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物

4.1 小菌素的合成基因簇及靶標(biāo)病原菌

2010 年， 小 菌 素（microcins）plantazolicin 在B.velezensis FZB42 突變體中被發(fā)現(xiàn)［34］；隨著近年來基因組數(shù)據(jù)的擴(kuò)充，其不斷在B.velezensis 基因組中被解析出來［38-39］。這種小分子化合物屬于噻唑/ 惡 唑 修 飾 的 小 菌 素（thiazole/oxazole?modified microcins, TOMM），它的結(jié)構(gòu)中包括一定數(shù)量的噻唑（thiazoles）和惡唑（oxazoles），由線性的14 聚前體肽（14?mer precursor peptide）形成，根據(jù)結(jié)構(gòu)不同分為plantazolicin A 和plantazolicin B［34,40］。調(diào)控合成plantazolicin 的基因簇pzn 包含12 個(gè)基因，大約10 kb，這些基因參與到這類天然產(chǎn)物的生產(chǎn)、修飾、輸出和自身免疫的過程中［34］。Liu 等［41］證實(shí)基因RBAM_007470（pznD）參與plantazolicin 的合成，轉(zhuǎn)座子TnYLB?1 插入基因RBAM_007470 會(huì)導(dǎo)致plantazolicin 合成的完全喪失。同時(shí)，甲硫氨酸依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶對(duì)plantazolicin 的合成起到至關(guān)重要的作用［42］。與小菌素B17（microcin B17）和鏈球菌溶血素S（streptolysin S）類似，plantazolicin可以刺激促進(jìn)植物生長(zhǎng)，抑制植物病原體的侵染［34,43-44］。但是plantazolicin 并非廣譜性抑菌化合物，如表1 所示，它主要作用于密切相關(guān)的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，如芽孢桿菌屬的部分菌株，尤其是炭疽芽孢桿菌（B.anthracis）［45］。此外它具有良好滅殺根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）的活性［41］。

表1 B.velezensis 核糖體途徑產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物靶標(biāo)病原菌Table 1 Target pathogens controlled by ribosomal secondary metabolites of B.velezensis

4.2 細(xì)菌素的合成基因簇及靶標(biāo)病原菌

環(huán)狀疏水細(xì)菌素amylocyclicin 是一種高度疏水的環(huán)狀肽，分子量為6 381 Da，于2014 年在B.ve?lezensis FZB42 中被發(fā)現(xiàn)［35］。調(diào)控合成amylocyclicin的基因簇acn 包含6 個(gè)基因（acnA、acnB、acnC、acnD、acnE、acnF），共計(jì)大小約4 490 bp；acnA、acnB、acnC 直接參與amylocyclicin 的合成，其中acnA 編碼112 個(gè)氨基酸組成的線性前體肽，翻譯后去除N 端48 個(gè)氨基酸前導(dǎo)肽（leader peptide）后，成熟肽（mature peptide）由64 個(gè)氨基酸組成［35,46］。Amylocyclicin 表現(xiàn)出對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphyloc?occus aureus）等革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制作用［35,46-47］。

4.3 羊毛硫抗生素的合成基因簇及靶標(biāo)病原菌

Mersacidin 是一種含有β- 甲基羊毛硫氨酸的新型多肽抗生素，它被歸類為羊毛硫抗生素（lantibiotic）［48-49］。Mersacidin 含有20 個(gè)氨基酸，分子量為1 825 Da。Mersacidin 由基因簇mrs 合成調(diào)控，基因簇包含10 個(gè)基因（mrsA、mrsR1、mrsR2、mrsK2、mrsF、mrsG、mrsE、mrsM、mrsD、mrsT）；其中mrsR2 和mrsK2 編碼雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)，mrsR1編碼響應(yīng)調(diào)控因子，mrsM 和mrsD 編碼參與前肽翻譯后修飾的酶，mrsT 編碼具有相關(guān)蛋白酶結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；此外，mrsF、mrsG、mrsE 操縱子編碼3種蛋白質(zhì)形成B 型ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP 結(jié)合盒），mrsR2 和mrsK2 調(diào)節(jié)mrsF、mrsG、mrsE 的轉(zhuǎn)錄，但不影響mersacidin 的生物合成［50-51］。在早期的報(bào)道中僅有部分芽孢桿菌可以產(chǎn)生mersacidin；Herzner等［52］將mersacidin 基因簇轉(zhuǎn)移到B.velezensis 中，菌株具備了產(chǎn)生mersacidin 的能力；Viel 等［53］成功將mersacidin 在大腸桿菌中的異源表達(dá)。近年來，許多學(xué)者在B.velezensis 部分菌株中發(fā)現(xiàn)了完整mersacidin 的基因簇，證實(shí)了B.velezensis 具有產(chǎn)生mersacidin 的能力［17,54］。Mersacidin 通過與前體分子脂質(zhì)II（precursor molecule lipid II）結(jié)合來抑制病原細(xì)菌細(xì)胞壁的生物合成［51,55］。如表1 所示，mersacidin 對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有抑菌活性，包括金黃色葡萄球菌（S.aureus），但對(duì)革蘭氏陰性菌或真菌沒有抑菌活性［48,56］。

5 非核糖體途徑產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物

5.1 脂肽類化合物的類型

5.1.1 表面活性素的合成基因簇及靶標(biāo)病原菌 表面活性素surfactin 的歷史可追溯到1968 年，由Arima 等［57］從B.subtilis 中鑒定并表征；迄今為止，已經(jīng)報(bào)道了來自不同芽孢桿菌屬的菌株可以產(chǎn)生surfactin，包括B.velezensis、B.amyloliquefaciens、B.licheniformis、B.methylotrophicus、B.thuringiensis［58］。Surfactin 是一種環(huán)狀脂肽，由一種鏈長(zhǎng)可變的β-羥基脂肪酸和7 種氨基酸組成的肽環(huán)通過內(nèi)酯橋連接在一起，形成肽鏈的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，包含親水性七肽環(huán)結(jié)構(gòu)，氨基酸序列為Glu?leu?lew?val?asp?leu?leu?leu，連接β-羥基脂肪酸，通常在C?13 和C?16 之間［59-60］。根據(jù)氨基酸的差異，將surfactin 分為3 類，即L?亮氨酸、L?纈氨酸和I?異亮氨酸分別存在于surfactinA、surfactinB 和surfactinC 中［61］。Surfactin通過srfA 操縱子編碼的NRPS 合成，包含srfAA、srfAB、srfAC 和srfAD 四個(gè)基因［62］。有關(guān)研究表明，胞外信號(hào)因子（extracellular signaling factor）Comx，傳感器激酶（sensor kinase）KinC，產(chǎn)孢刺激因子（sporulation?stimulating factor, CSF）和天冬氨酸磷酸酶（aspartate phosphatase, Rap）會(huì)影 響surfactin 的生物合成［62-65］。如表2 所示，surfactin 是一種強(qiáng)大而有效的生物表面活性分子，對(duì)多種病原微生物具有抑菌活性，包括茄科雷爾氏菌（R.solanacearum）、丁香假單胞菌番茄致病變種（P.syringae pv.tomato）、擬輪枝鐮孢菌（F.verticillioides）、串珠鐮刀菌（F.moniliforme）、葡萄軸霜霉菌（Plasmopara viticola）等［66-70］。Surfactin 在膜水平上影響靶細(xì)胞，對(duì)植物病原菌、真菌和病毒具有廣譜的拮抗活性［71］，最新報(bào)道surfactin 對(duì)南方根結(jié)線蟲（M.incognita）也具有滅殺趨避能力［72］。

表2 B.velezensis 非核糖體途徑產(chǎn)生脂肽類次級(jí)代謝產(chǎn)物靶標(biāo)病原菌Table2 Target pathogens controlled by non-ribosomal secondary lipopeptides metabolites of B.velezensis

5.1.2 豐原素的合成基因簇及靶標(biāo)病原菌 豐原素fengycin，也稱plipastatin，1986 年從B.subtilis 中發(fā)現(xiàn)［73］。Fengycin 是八肽環(huán)結(jié)構(gòu)，連接N?末端β-羥基脂肪酸鏈，通常在C?12 和C?19 之間；根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同，即在第六位存在Ala 或Val，將fengycin 分為fengycin A 和fengycin B 兩種類型［74］。Fengycin 由NRPS 合成，包含fenA（ppsA）、fenB（ppsB）、fenC（ppsC）、fenD（ppsD）和fenE（ppsE）5 個(gè)基因［75］。fengycin 對(duì)廣譜絲狀真菌具有抑菌活性，例如大麥赤霉病（Fusarium graminearum）、稻瘟?。∕agnaporthe grisea）、灰 霉 ?。˙otrytis cinerea）、玉 米 穗 腐 病（Rhizomucor variabilis）、瓜類白粉?。≒odosphaera fusca）等［31,76-80］。不同菌株產(chǎn)生的fengycin 靶標(biāo)病原菌也有一定的差異性，B.velezensis SQR9 和B.amyloliquefaciens S76?3 產(chǎn)生的fengycin 表現(xiàn)出對(duì)侵染禾本科植物病原真菌的抑菌作用，如F.oxysporum、F.solani、F.graminearum、Phytophthora parasitica 和Verticillium dahliae Kleb［36,81］；B.amyloliquefaciens MEP218 產(chǎn)生的fengycin 對(duì)番茄瘡痂病病原菌野油菜黃單胞菌瘡痂致病變種（Xanthomonas axonopodis pv.vesicatoria）有良好的抑菌效果［82］；B.altitudinis 和B.velezensis 的菌株產(chǎn)生fengycin 可以直接拮抗觸發(fā)誘導(dǎo)系統(tǒng)抗病性，抑制P.oryzae 孢子萌發(fā)，從而保護(hù)水稻免受稻瘟病的侵染［83］。

5.1.3 桿菌霉素D 的合成基因簇及靶標(biāo)病原菌 桿菌霉素D（bacillomycin?D）屬于脂肽類化合物iturin家族，這一家族成員包括iturin A、iturinC、iturinD、iturinE，bacillomycin?D、bacillomycin?F、bacillomy?cin?L，bacillopeptin，mycosubtilin［33］。Bacillomycin?D的結(jié)構(gòu)是環(huán)狀七肽與氨基脂肪酸鏈結(jié)合，C?15 到C?18 之間。Bacillomycin?D 由bmy 操縱子調(diào)控生物合成，包括bmyD、bmyA、bmyB 和bmyC 等4 個(gè)基因［84］。同時(shí)，它還受到3 個(gè)多效調(diào)節(jié)因子Degu、Degq、ComA 和2 個(gè)sigma 因子σB、σH 的調(diào)控［84］。如表2所示，bacillomycin?D 可以有效抑制多種病原微生物，包括X.campestris pv.cucurbitae、Aspergillus flavus、F.graminearum、F.oxysporum f.sp.cucumerinum 等［85-88］。B.velezensis FZB42 產(chǎn) 生 的bacillomycin?D 表 現(xiàn) 出 對(duì)絲狀病原真菌優(yōu)異的抑菌活性［88］。B.velezensis HN?2中分離的bacillomycin?D 對(duì)C.gloeosporioides（Penz.）具有強(qiáng)烈抑制作用，可損傷bacillomycin?D 菌絲和孢子的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器滲出并形成空洞，從而對(duì)炭疽病具有良好的抑制效果［89］（表2）。

5.2 聚酮類化合物的類型

5.2.1 Bacillaene 的合成基因簇及靶標(biāo)病原菌 Bacillaene 是由反式?；D(zhuǎn)移酶聚酮合成酶合成的一種線性聚酮/非核糖體肽，從B.subtilis 中發(fā)現(xiàn)的多烯類抗生素［90］。在B.velezensis 中存在3 個(gè)PKSs 基 因 簇（pks1、pks2、pks3），bacillaene 是 由pks1（bae）基因簇編碼合成［9］。Bacillaene 化學(xué)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、生物合成的特殊性、強(qiáng)大的生物活性和競(jìng)爭(zhēng)力，使其成為抵抗其他微生物和維持最佳根際環(huán)境的理想天然產(chǎn)物武器［91］。盡管bacillaene 對(duì)多重耐藥細(xì)菌（multi?drug resistance, MDR）具有抑菌活性，但多年來，由于bacillaene 的化學(xué)不穩(wěn)定性，很難使用傳統(tǒng)的分離方法獲得bacillaene 的純化物［92］。在光照或室溫條件下，bacillaene 會(huì)迅速分解，這阻礙了對(duì)bacillaene 生物合成的嘗試［69］。如表3所示，B.velezensis FZB42 產(chǎn)生的bacillaene 對(duì)梨火疫病病原菌（Erwinia amylovora）具有一定的抑菌效果［32］。Bacillus spp.產(chǎn)生的bacillaene?A 顯示出對(duì)真菌雞樅菌（Termitomyces albuminosus（Berk）Heim）的抑菌活性［93］。

表3 B.velezensis 非核糖體途徑產(chǎn)生聚酮類次級(jí)代謝產(chǎn)物靶標(biāo)病原菌Table 3 Target pathogens controlled by non-ribosomal secondary polyketides metabolites of B.velezensis

5.2.2 大環(huán)內(nèi)酯菌素的合成基因簇及靶標(biāo)病原菌 大環(huán)內(nèi)酯菌素macrolactin 最早是從深海細(xì)菌Bacillus spp.Sc026 菌株的乙酸乙酯提取物中分離出來［94］。在B.velezensis 中，pks2（mlnB、mlnC、mlnD、mlnE、mlnF、mlnG、mlnH）基因簇編碼合成macrolactin，macrolactin 是細(xì)菌肽去甲酰酶抑制劑［30,95］。目前已鑒定出17 種不同類型的macrolac?tin，其中在B.velezensis 中發(fā)現(xiàn)4 種形式，包括mac?rolactin?A、macrolactin?D、7?O?malonyl?macrolactin?A、7?O?succinyl?macrolactin。其中7?O?succinyl?macrolactin對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和多重耐藥細(xì)菌病原體有抑制效果，包括耐甲氧西林菌株金黃葡萄球菌（Staph?ylococcus aureus），耐萬古霉素菌株腸球菌（Escherichia coli），洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacian），根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）［96-98］。最近研究表明，macrolactin 影響草莓病原真菌灰葡萄孢（Botrytis cinerea）的膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致膜通透性變化，蛋白質(zhì)和核酸泄漏，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡；同時(shí)，mac?rolactin 對(duì)灰葡萄孢的孢子萌發(fā)、芽管伸長(zhǎng)和菌絲生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用［99］。

5.2.3 地非西丁的合成基因簇及靶標(biāo)病原菌 地非西丁difficidin，或稱達(dá)菲菌素，是在B.subtilis ATCC?39320 發(fā)酵液中被首次發(fā)現(xiàn)，歸類為不飽和大環(huán)多烯內(nèi)酯磷酸酯［100］。Difficidin 存在氧化形式oxydifficidin，它在difficidin 環(huán)狀結(jié)構(gòu)的第五位具有一個(gè)羥基，它們都是由pks3（dif）基因簇編碼合成的［9］。轉(zhuǎn)錄因子Spo0A 可調(diào)控difficidin 的合成［101-102］。Difficidin 和bacilysin 對(duì)水稻細(xì)菌性枯萎病病原菌（X.oryzae pv.oryzae）和水稻細(xì)菌性條斑病病原菌（X.oryzae pv.oryzicola）表現(xiàn)出抑菌活性，這兩種抑菌化合物可以聯(lián)合影響病原菌黃單胞菌的細(xì)胞壁，RT?qPCR 結(jié)果表明，difficidin 和bacilysin可以導(dǎo)致黃單胞菌的相關(guān)基因下調(diào)表達(dá)，包括毒力、細(xì)胞分裂、蛋白質(zhì)和細(xì)胞壁生物合成基因rpfF、gumD、glmS、ftsZ 和rrlA 等［103］。另一項(xiàng)研究中，B.velezensis DR?08 的 丁 醇 提 取 物 含 有difficidin 和oxydifficidin，對(duì)番茄青枯病病原菌青枯雷爾氏菌（R.solanacearum）有抗菌活性［104］。Difficidin 對(duì)耐萬古霉素的乳酸菌（Enterococcus faecalis）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和其他耐藥菌株具有良好的抑菌活性，表明了difficidin 類似物在藥物和生物技術(shù)應(yīng)用中對(duì)抗新出現(xiàn)的耐藥病原體的潛力［105］（表3）。

5.3 二肽的合成基因簇及靶標(biāo)病原菌

Bacilysin 是一種特洛伊木馬抗生素（Trojan horse antibiotic），由Bacillus spp.的bac 基因簇（bacA、bacB、bacC、bacD、bacE，也被稱 作ywfB、ywfC、ywfD、ywfE、ywfF）合 成［106］。Bacilysin 依 賴 肽 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入到病原菌靶細(xì)胞當(dāng)中，隨后bacilysin 會(huì)被細(xì)胞質(zhì)肽酶水解成非蛋白原性抗莢膜菌素（ant?icapsin, epoxy?cyclohexanonyl?Ala） 和N 端L? 丙 氨酸（N?terminal L?alanine），其 中anticapsin 起 到 抑菌 活 性 的 作 用［107］。Bacilysin 中 的anticapsin 可 以阻斷病原細(xì)菌肽聚糖或病原真菌甘露糖蛋白的生物合成途徑，RT?PCR 結(jié)果也表明bacilysin 會(huì)使銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）的多個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，包括glmS、psbA1、mcyB 和ftsZ，這些基因涉及肽聚糖的生物合成、細(xì)胞分裂和光合作用［108］。B.velezensis FZB42 產(chǎn)生的bacilysin 對(duì)金黃色葡萄球菌（S.aureus）和馬鈴薯環(huán)腐病病原菌（Corynebacterium michiganense subsp.sepedonicum）具有抑菌效果［103］。Bacilysin 還對(duì)銅綠微囊藻（M.aeruginosa）有很強(qiáng)的抗藍(lán)藻能力［108］；對(duì)水稻細(xì)菌性枯萎病病原菌（X.oryzae pv.oryzae）和水稻細(xì)菌性條斑病病原菌（X.oryzae pv.oryzicola）表現(xiàn)出抑菌活性［103］。Bacilysin通過抑制葡糖胺6?磷酸合成酶，作為一種多效性信號(hào)分子，影響不同的細(xì)胞活動(dòng)，由于其對(duì)各種細(xì)菌、真菌和藻類病原體的強(qiáng)大拮抗作用，在工業(yè)農(nóng)業(yè)和制藥行業(yè)中越來越受到關(guān)注［109-110］。

5.4 鐵載體的合成基因簇及靶標(biāo)病原菌

鐵是所有生物體的必需元素，是執(zhí)行細(xì)胞過程的重要輔助因子，包括DNA 合成、呼吸和防御活性氧［111］。Bacillus spp.可以產(chǎn)生兒茶酚鐵載體嗜鐵素bacillibactin，當(dāng)菌株細(xì)胞被限制吸收鐵元素 時(shí)，bacillibactin 可 以 促 進(jìn)Fe3+的 吸 收［112］。在B.velezensis 中，基 因 簇dhb 指 導(dǎo)bacillibactin 的 生物合成［33］。Bacillibactin 通過剝奪病原微生物生長(zhǎng)必需的鐵來間接抑制其生長(zhǎng)，B.velezensis SQR9 產(chǎn)生的bacillibactin 與脂肽類抗生素 bacillomycin D、fengycin、surfactin 聯(lián)合對(duì)某些病原真菌起到拮抗作用，包括 F.oxysporum、F.solani、P.parasitica，在這個(gè)過程中bacillibactin 表達(dá)量顯著上調(diào)；但是當(dāng)突變菌株缺乏脂肽類抗生素時(shí)，bacillibactin 的抑菌效果大大降低［36］。在前期的研究中，一直沒有證據(jù)表明bacillibactin 純品直接具有抑菌活性［113］；直到2021 年，Dimopoulou 等［114］首次從生防芽孢桿菌中分離獲得bacillibactin 并發(fā)現(xiàn)，除了螯合鐵這一途徑之外，bacillibactin 對(duì)病原細(xì)菌和病原真菌具有顯著的生物防治活性；隨后，一系列研究證明嗜鐵素是潛在的天然抗菌劑［115-116］。此外，最新研究表明，bacillibactin 介導(dǎo)的相互作用具有螯合劑傳感這一新概念，利用這一機(jī)制，芽孢桿菌將依賴特定的外源鐵載體作為“竊聽”策略來準(zhǔn)確識(shí)別競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手，并通過重塑次生代謝組的表達(dá)來做出適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)［117］。

6 總結(jié)與展望

在過去的幾十年里，數(shù)百種抗菌藥物從微生物中開發(fā)出來，這些抑菌物質(zhì)可以安全地應(yīng)用于植物病害的防治中，與傳統(tǒng)的化學(xué)藥劑相比，不僅毒性降低，對(duì)環(huán)境更友好，而且還降低了病原微生物耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)［118-120］。芽孢桿菌菌株對(duì)N2的固定、P和K 的溶解、植物激素的產(chǎn)生、抗生素的合成、裂解酶的產(chǎn)生，以及ISR 成為其直接和間接的生防機(jī)制，這些作用機(jī)制都支持植物的生長(zhǎng)促進(jìn)、害蟲抗性和規(guī)避疾病［5］。尤其是B.velezensis，它產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物在農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)中表現(xiàn)出極大的抑菌活性和市場(chǎng)價(jià)值，受到了廣泛的關(guān)注和研究。盡管部分B.subtilis 也能夠產(chǎn)生具有抑菌活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，但是B.velezensis 的次級(jí)代謝產(chǎn)物顯然更加強(qiáng)大，更多樣化。近年來，隨著基因組數(shù)據(jù)的補(bǔ)充，B.velezensis 的進(jìn)化分類地位也更加明晰，B.velezensis已經(jīng)成為生物防治功能強(qiáng)大的生防菌株，其產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物抑菌活性物質(zhì)可以用作化學(xué)農(nóng)藥的有效替代品。然而貝萊斯芽孢桿菌在應(yīng)用過程中也存在一些問題有待進(jìn)一步研究和解決。第一，B.velezensis 作為生物防治劑在現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用時(shí)，在不同農(nóng)業(yè)氣候區(qū)的表現(xiàn)不一致［121］；第二，生物防治劑的植物根際有效定植能力的差異，尤其是在根際微生物群落的影響下，菌株的存活和增殖能力存在差異性［122］；第三，分子技術(shù)已被用于表征B.velezensis中次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的基因，但生物防治機(jī)制的遺傳基礎(chǔ)尚未確定［123-124］。因此，針對(duì)上述問題，未來對(duì)B.velezensis 的研究應(yīng)該根據(jù)特定的靶標(biāo)病原菌確定特定的次級(jí)代謝產(chǎn)物，重點(diǎn)放在菌株的穩(wěn)定性和定植能力方面，以幫助確定生物防治劑的最佳濃度、接種時(shí)間、接種位置以及土壤和作物管理策略，從而提高菌株的存活和增殖能力，以確保菌株在可持續(xù)農(nóng)業(yè)中的商業(yè)化應(yīng)用推廣。此外，也可以通過研究其生防機(jī)制對(duì)菌株進(jìn)行遺傳改良，形成高效菌株，或者利用B.velezensis 開發(fā)創(chuàng)新生物制劑，從而改善作物健康，促進(jìn)作物生長(zhǎng)，比如B.velezensis 可以在納米技術(shù)領(lǐng)域發(fā)揮關(guān)鍵作用，制備納米肥料和納米農(nóng)藥［21,125-126］。