家蠶脂肪體細(xì)胞核蛋白的提取

山西 朱虹

細(xì)胞核蛋白是指在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成,然后運(yùn)輸?shù)胶藘?nèi)起作用的一類蛋白質(zhì)。核蛋白的研究在動(dòng)、植物病害的防治及臨床醫(yī)學(xué)上有十分重要意義。在核蛋白提取的過程中，為了防止蛋白質(zhì)降解和損耗，提取的步驟越少越好。我們使用各種不同的方法來摸索細(xì)胞核抽提實(shí)驗(yàn)的最佳方法和條件。最后我們根據(jù)2004年清華大學(xué)出版社出版，由劉進(jìn)元翻譯的《轉(zhuǎn)錄因子實(shí)用技術(shù)》一書，優(yōu)化HeLa細(xì)胞核提取物的制備的方法，制備家蠶細(xì)胞核提取物。由于家蠶在5齡3天時(shí)期體內(nèi)蛋白量表達(dá)最高，所以我們選擇這個(gè)時(shí)期的家蠶幼蟲作為材料提取細(xì)胞核蛋白。

一、家蠶脂肪體細(xì)胞核蛋白抽提方法的建立

1.實(shí)驗(yàn)材料

家蠶基因庫5齡3天大造蠶品種雄性脂肪體。

2.所用試劑

3.所用儀器

（1）20mLDounce帶較松研缽的玻璃勻漿器

（2）截留分子質(zhì)量為12000～14000Da的透析袋

（3）透析夾

4.實(shí)驗(yàn)方法

（1）取家蠶5齡3天脂肪體，加入5倍體積的緩沖液A，用勻漿器勻漿30-40下，5000 rpm離心10min。

（2）冰育10min,5000 rpm離心10min。

（3）棄去上清，用3倍體積的緩沖液A重懸浮，用勻漿器勻漿20下左右。5000 rpm離心10min以沉降細(xì)胞核。

（4）取出上清（細(xì)胞質(zhì)蛋白），重懸沉降細(xì)胞核于1mL緩沖液C中，測量總體積，加NaCl至終濃度300mmol/L，采用上下顛倒方式充分混合。

（5）冰浴30min，在4℃下以15000 rpm離心20min。

（6）用500mL緩沖液C透析，第一次透析過夜，第二次透析4 h。冷凍干燥后稀釋，把溶液分裝，取一管用Bradford方法測定蛋白濃度,其他于-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

二、家蠶脂肪體細(xì)胞核蛋白的檢測

（一）Brad ford方法測定蛋白濃度

1.所用試劑：

試劑A：考馬斯亮藍(lán)G-250原液（稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50mL 95%的乙醇，加入100mL 85%（W/V）磷酸。

試劑B：0.01%考馬斯亮藍(lán)G-250測定工作液（將考馬斯亮藍(lán)G-250原液與雙蒸水按15：85比例混勻，過濾，4℃，棕色瓶保存）

0.1 N鹽酸和雙蒸水（新鮮制備）

蛋白標(biāo)準(zhǔn)液：5mg/mL卵清蛋白溶液（將5mg卵清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶于1 mL待測樣品的溶劑體系，室溫穩(wěn)定2 h或者2-4℃過夜，12000g離心10 min后小量分裝，-20℃保存6-8月，-80℃保存1年）

稀釋液：待測樣品的溶劑，小量分裝，-20℃保存。

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

（1）準(zhǔn)備：將蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，稀釋液取出溶解；考馬斯亮藍(lán)G-250測定工作液取出恢復(fù)室溫；根據(jù)測定用量新鮮準(zhǔn)備0.1N鹽酸和雙蒸水。

（2）將9支干燥潔凈的試管編號，按表1加入試劑，搖勻，室溫放置半分鐘后各管加入3.5mL考馬斯亮藍(lán)G-250測定工作液，搖勻，室溫放置5 min后，以0號試管為空白調(diào)零測定其余各管595 nm處相對吸光度。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定體系Table1 standard curve testing system

3.樣品的測定

（1）在一干燥潔凈試管內(nèi)，先加入80μl雙蒸水，再加入用稀釋液調(diào)整蛋白濃度到測范圍的樣品10μl，加入0.1N鹽酸10μl混勻半分鐘后，加入3.5mL考馬斯亮藍(lán)G-250測定工作液，搖勻，室溫放置5min后測定其在595 nm處相對吸光度。

（2）同（1）操作，測定兩個(gè)平行樣，取其平均值。

（二）SDS-PAGE電泳檢測

1.待測蛋白質(zhì)樣品的制備

(1)向蛋白樣品中加入適量的PBS，渦旋振蕩重懸樣品，加入1/2體積的3×上樣緩沖液,混勻。

(2)100℃加熱煮沸15min

(3)12000 rpm室溫離心5min，取上清液進(jìn)行電泳，剩余樣品-20℃保存。

2.電泳槽準(zhǔn)備

取潔凈的玻璃板和凹形橡膠框等，按說明書裝好電泳槽，長玻璃板下端與橡膠框底之間有一縫隙，用融化的1%的瓊脂糖 (配制在電極緩沖液中)封底，待瓊脂糖完全凝固后，準(zhǔn)備灌膠。

3.垂直平板電泳膠的制備

表2 SDS-PAGE凝膠組分Table2 Componentsof SDS-PAGE gel

按表2配制分離膠與壓縮膠，先灌入2/3的分離膠，然后立即用水飽和的異丁醇或異戊醇封膠，封膠后保持不動(dòng)。待膠凝后將封膠液倒掉，并用ddH2O沖洗干凈，然后加少量0.1%的SDS，目的是通過降低張力清除殘留水滴。片刻后倒掉SDS，將玻璃板倒立放置片刻。

灌好濃縮膠后1h拔除梳子，撥出梳子后用ddH2O沖洗膠孔兩遍以去除殘膠，隨后用0.1%的SDS封膠。若上樣孔有變形，可用適當(dāng)粗細(xì)的針頭撥正；30min后即可上樣，長時(shí)間有利于膠結(jié)構(gòu)的形成，因?yàn)槿庋塾^的膠凝時(shí)其內(nèi)部分子的排列尚未完成。

4.電泳

(1)用垂直電泳槽進(jìn)行電泳，上樣前將膠板下的氣泡趕走。

(2)用微量進(jìn)樣器每孔加入處理好的蛋白樣品10μl，所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣。

(3)上槽加入200 mL 1×loading buffer，下槽加入 200 mL 0.5×loading buffer。以初始電流15mA的電流強(qiáng)度進(jìn)行穩(wěn)流電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)帶泳動(dòng)至壓縮膠與分離膠的界線處時(shí)，將電流升為25mA。

(4)在溴酚藍(lán)帶泳動(dòng)至距膠下緣1.5 cm時(shí)結(jié)束電泳，取下凝膠進(jìn)行AgNO3染色。整個(gè)電泳時(shí)間約4～5 h。

5.銀染

（1）電泳后凝膠在固定液中固定1 h以上（一般過夜），不可搖動(dòng)。

（2）用清洗液浸泡3次，5min～20min～5min

（3）在定影液中反應(yīng)2min后，用dd H2O洗滌3次，每次5min。

（4）在染色液中反應(yīng)30min，用dd H2O洗滌2次，每次20 s。

（5）在顯影液中浸泡數(shù)分鐘，直到顯現(xiàn)蛋白條帶。

（6）加入終止液，使反應(yīng)停止。

（7）用dd H2O洗滌，凝膠在10%醋酸中保存。

（三）EMSA實(shí)驗(yàn)檢測核蛋白活性

1.材料準(zhǔn)備：

（1）核蛋白的準(zhǔn)備：按標(biāo)準(zhǔn)方法提取家蠶雄性脂肪體核蛋白，并進(jìn)行過夜透析，冷凍干燥，使?jié)舛冗_(dá)到1μg/μl以上。

（2）探針的準(zhǔn)備：由上海生工合成25 nt的polyURNA序列，進(jìn)行5’末端標(biāo)記，標(biāo)記后進(jìn)行純化，并測定標(biāo)記效率。

EMSA探針序列：5’UUAAUAAUAUAAGUG3’

2.EMSA結(jié)合反應(yīng):

(1)設(shè)置EMSA結(jié)合反應(yīng)（如表3所示）

(2)按照反應(yīng)體系加入各種試劑，在加入標(biāo)記好的探針前先混勻，室溫(20-25℃)放置10min，消除可能發(fā)生的探針和蛋白的非特異性結(jié)合，或者讓冷探針優(yōu)先反應(yīng)。然后加入標(biāo)記好的探針，混勻，室溫(20-25℃)放置20min。

(3)電泳分析：先用200V預(yù)電泳1 h，再用200V電泳約3 h。

表3 EMSA反應(yīng)體系Table3 Reaction system of EMSA

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

用大造5齡3天的脂肪體提取的細(xì)胞核蛋白抽提物經(jīng)過透析、冷凍干燥后，用下列三種方法檢測。首先用Bradford方法測定蛋白濃度測定，若達(dá)到1μg/μl以上再用SDS-PAGE電泳檢測其純度，提取過程中得到的細(xì)胞質(zhì)蛋白做對照，得到比較純的細(xì)胞核蛋白。最后使用EMSA方法檢測其活性,得到體外剪接可用的細(xì)胞核蛋白。

（一）Brad ford方法測定蛋白濃度

按照Bradford方法測定細(xì)胞核蛋白濃度。一般情況下，最后一步加入3.5mL考馬斯亮藍(lán)G-250測定工作液時(shí)，藍(lán)色變化越明顯，濃度越高。每次測定三個(gè)值，取其均值。當(dāng)濃度達(dá)到1μg/μl以上，再用SDS-PAGE電泳檢測提取的純度。

（二）SDS-PAGE電泳檢測

按照細(xì)胞核蛋白提取的方法與步驟提取的蛋白，用實(shí)驗(yàn)方法步驟（4）中得到的細(xì)胞質(zhì)蛋白作為對照，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。檢測細(xì)胞核蛋白的純度，檢測結(jié)果顯示如圖1 A。

由圖可知，提取的核蛋白純度比較高，沒有太多細(xì)胞質(zhì)蛋白的混雜。

（三）EMSA檢測核蛋白活性

提取的細(xì)胞核蛋白用SDS-PAGE電泳檢測蛋白純度后，進(jìn)一步采用EMSA方法檢測其活性，如圖1B所示。

圖1 A:細(xì)胞核蛋白SDS-PAGE電泳圖 1,2:細(xì)胞核蛋白3:細(xì)胞質(zhì)蛋白B:EMSA電泳圖1:只加探針，無核抽提物 2:加標(biāo)記探針和未標(biāo)記探針，有核抽提物3:只加探針探針，有核抽提物Fig1 A:SDS-PAGE electropherogram of cellnucleoprotein 1,2.:cellnucleoprotein 3.:cytoplasm albumenB：EMSA electropherogram 1:added only probes,nonuclear extract 2:added labeled and non-labeled probe,with nuclearextract 3:added labeled probe,with nuclear extract

（四）細(xì)胞核蛋白抽提條件的優(yōu)化

在細(xì)胞核抽提實(shí)驗(yàn)中，我們改進(jìn)了劉進(jìn)元翻譯的《轉(zhuǎn)錄因子實(shí)用技術(shù)》中HeLa細(xì)胞核提取物的制備的方法。將前面幾步中的離心速度由500 g提高到5000 rpm。

在第一次使用勻漿器時(shí)，將重懸于緩沖液中的沉淀由勻漿10個(gè)沖程提高到40個(gè)沖程，而第二次勻漿時(shí)則由10個(gè)沖程提到到20個(gè)沖程左右。這樣可以充分的將細(xì)胞核裂解。勻漿的沖程次數(shù)不是絕對的，要根據(jù)自己的力度大小決定，需要在實(shí)驗(yàn)中慢慢摸索。

（五）細(xì)胞核蛋白提取中的關(guān)鍵因素

細(xì)胞核抽提物如果處理和儲(chǔ)存得當(dāng)，好的剪接提取物可保存多年。為保持最佳的活性，提取后的細(xì)胞核蛋白要分裝。在提取制備后一管剪接提取物只能經(jīng)歷兩個(gè)凍-融周期。否則會(huì)影響其剪接活性。為了從組織中制備未降解的核蛋白，起始材料最好采用新鮮的。并且整個(gè)抽提實(shí)驗(yàn)操作在4℃房間進(jìn)行，以防止蛋白降解。在細(xì)胞核抽提實(shí)驗(yàn)中使用的多種化學(xué)藥品是有害的，應(yīng)該采用防護(hù)措施如戴上手套，穿工作服。PMSF，丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺等上有毒，干燥，呈氣霧狀的粉末，在稱重時(shí)要注意防護(hù)。短半衰期的PMSF有劇毒，在水溶液里易于處理。故在處理容器或洗滌之前，那些接觸過PMSF或者丙烯酰胺的容器可用水徹底清晰。

四、結(jié)論

以家蠶脂肪體為材料提取核抽提物，SDS-PAGE電泳及遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)表明所抽提的核提取物質(zhì)量較好，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。制備的細(xì)胞核提取物可用于體外剪接，及遷移率變動(dòng)分析中。

[1]Ohbayashi F,SuzukiMG,Shimada T.sex determination in Bombyxmori.currentscience.2002,8,83(4):466～470.

[2]Zeltlln S,Etstrauads A.in vitro spilicing products of the Rabbit β-Globin pre-mRNA.Cell,1984,31:589.

[3]鄭曉飛.RNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊.第一版.北京:科學(xué)出版社,2004,258～259.

[4]劉進(jìn)元.轉(zhuǎn)錄因子實(shí)用技術(shù).清華大學(xué)出版社.2004.