牛樟樹(shù)水提物中促進(jìn)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢的效應(yīng)物鑒定及其添加量?jī)?yōu)化

李華祥，戴嘉寧，王娟娟，劉泊伶，吉 丹，羅志珊，陸震鳴，楊振泉,*

（1.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；3.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵與食品生物制造國(guó)家工程研究中心，江蘇 無(wú)錫 214122）

樟芝（Antrodia cinnamomea），又名牛樟芝或牛樟菇，是一種珍稀藥食兩用真菌，隸屬于擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycetes）、多孔菌科（Polyporaceae）、薄孔菌屬（Antrodia）[1-2]，具有保肝護(hù)肝[3]、抗癌、抗腫瘤[4]、降血糖、降血壓、抗病毒[5]、抑菌[6]、調(diào)節(jié)免疫及調(diào)節(jié)腸道菌群[7-8]等多種功效。目前，樟芝的人工培養(yǎng)方式主要有椴木栽培、平皿培養(yǎng)、固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵（又稱(chēng)深層發(fā)酵）[9]。其中，采用樟芝深層發(fā)酵所產(chǎn)生的無(wú)性孢子（即節(jié)孢子）接種取代傳統(tǒng)菌絲接種的樟芝深層發(fā)酵工藝由于具有接種量及種子質(zhì)量可控、批次穩(wěn)定性好、發(fā)酵周期短、活性物質(zhì)產(chǎn)量高及易于規(guī)?；葍?yōu)點(diǎn)，已成為目前最高效、最受歡迎的樟芝人工培養(yǎng)方式[9-11]。但是，該發(fā)酵工藝仍然存在不足，尤其是作為接種物的樟芝無(wú)性孢子產(chǎn)量較低，進(jìn)而導(dǎo)致種子制備過(guò)程繁瑣耗時(shí)，并大幅增加了生產(chǎn)成本[12-13]。因此，提高樟芝深層發(fā)酵產(chǎn)孢量對(duì)提高樟芝深層發(fā)酵生產(chǎn)效益及促進(jìn)樟芝大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展至關(guān)重要。基于此，本團(tuán)隊(duì)前期也對(duì)促進(jìn)樟芝深層發(fā)酵無(wú)性產(chǎn)孢效應(yīng)因子篩選及其作用機(jī)制進(jìn)行了大量研究[12-16]。

牛樟樹(shù)（Cinnamomum kanehiraeHay）是樟屬植物的一種，也是野生牛樟芝唯一的天然寄主，通常生長(zhǎng)在氣候溫暖濕潤(rùn)及土壤肥沃的高海拔地區(qū)[17-18]。牛樟樹(shù)本身具有抑菌、防腐、抗癌等功效[18-20]。此外，Zhang Zhang等[21]發(fā)現(xiàn)，在平皿培養(yǎng)樟芝時(shí)添加牛樟樹(shù)枝勻漿，可提高樟芝菌絲體中的三萜含量。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，牛樟樹(shù)勻漿通過(guò)調(diào)節(jié)參與三萜生物合成的關(guān)鍵基因HMGR和SQS的表達(dá)來(lái)促進(jìn)三萜合成；Zeng Wenwen等[22]發(fā)現(xiàn)，在固態(tài)發(fā)酵樟芝時(shí)添加牛樟樹(shù)葉乙醇提取物可有效促進(jìn)樟芝菌絲體的生長(zhǎng)及酚類(lèi)化合物的合成；同時(shí)，Hsu等[23]發(fā)現(xiàn)，香樟樹(shù)枝水提物中的多糖類(lèi)物質(zhì)顯著促進(jìn)樟芝菌絲體生長(zhǎng)；Lu Zhenming等[24]發(fā)現(xiàn)，低質(zhì)量濃度（0.05 g/L）的香樟樹(shù)枝石油醚提取物顯著促進(jìn)樟芝深層發(fā)酵菌絲生長(zhǎng)及三萜類(lèi)物質(zhì)的合成。以上研究證明，牛樟樹(shù)或其他樟屬植物中存在一些促進(jìn)樟芝生長(zhǎng)、繁殖或活性產(chǎn)物合成的物質(zhì)。目前已從牛樟樹(shù)的樹(shù)干或樹(shù)葉中分離到香豆素、類(lèi)固醇、木脂素、芝麻素、芫花素、苯甲酸-2-甲基丙酯等物質(zhì)[20,25-26]。

本團(tuán)隊(duì)前期研究了牛樟樹(shù)木屑的4 種溶劑（水、甲醇、乙酸乙酯及石油醚）提取物對(duì)樟芝深層發(fā)酵無(wú)性產(chǎn)孢的影響，結(jié)果表明，只有牛樟樹(shù)水提物（aqueous extract ofC.kanehiraeHay，CWE）顯著促進(jìn)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢，且在最佳質(zhì)量濃度（60 μg/mL）下使樟芝產(chǎn)孢量較對(duì)照組（不添加CWE）提高58%左右[27]。但前期研究未對(duì)CWE中促進(jìn)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢效應(yīng)物進(jìn)行分離及鑒定等深入研究。因此，為了進(jìn)一步完善上述研究，本研究采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）分析法對(duì)CWE的不同有機(jī)溶劑萃取物進(jìn)行成分分析，并對(duì)相關(guān)化合物促進(jìn)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢的效果進(jìn)行驗(yàn)證，最終明確CWE中促進(jìn)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢的物質(zhì)并優(yōu)化其最佳添加量，為進(jìn)一步提高樟芝深層發(fā)酵無(wú)性孢子產(chǎn)量及促進(jìn)樟芝深層發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樟芝菌株購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心，編號(hào)為ATCC200183。

野生牛樟樹(shù)枯木 福建皓天生物科技有限公司；赤蘚糖醇（純度98%）、甜菜堿（純度98%）北京索萊寶科技有限公司；正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、葡萄糖、酵母粉、硫酸鎂及磷酸二氫鉀等常規(guī)試劑（均為分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA124S電子天平 蘇州江東精密儀器有限公司；YXQ-50SII高壓蒸汽滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；XSP-18A顯微鏡 上海彼愛(ài)姆光學(xué)儀器制造有限公司；QT-3多功能搖床 上海琪特分析儀器有限公司；TG-16WS高速離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海雅蓉生物儀器設(shè)備有限公司；DGX-9053B-2烘箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Dionex Ultimate 3000 LC-MS儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 CWE的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取20 g牛樟樹(shù)木屑，加入400 mL去離子水，90 ℃水浴提取3 h后，用4 層紗布過(guò)濾并收集濾液。重復(fù)提取3 次，合并濾液并離心（6 000 r/min、10 min、4 ℃）收集上清，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將上清濃縮至黏稠狀后，75 ℃烘干并稱(chēng)質(zhì)量，即得CWE。用去離子水復(fù)溶CWE并使其最終質(zhì)量濃度為10 mg/mL，即得CWE母液，分裝成10 mL每管后保存于-20 ℃冰箱中備用[27]。

1.3.2 CWE醇沉及萃取

1.3.2.1 CWE醇沉

取10 mL CWE母液，加入30 mL無(wú)水乙醇，混勻后于4 ℃冰箱靜置過(guò)夜，8 000 r/min離心10 min（4 ℃），分別收集上清和沉淀部分。其中，上清液部分置于75 ℃烘箱中濃縮至10 mL（若體積不足則用去離子水定容），即得CWE醇沉上清液；沉淀部分置于75 ℃烘箱中干燥后用去離子水復(fù)溶并定容至10 mL，即得CWE醇沉沉淀溶液。將CWE醇沉上清液和沉淀溶液保存于4 ℃冰箱中備用。

1.3.2.2 上清液分級(jí)萃取

將10 mL上清液與10 mL正丁醇振蕩（200 r/min）混合30 min后，加入分液漏斗中靜置分層，收集上層正丁醇萃取相，75 ℃烘干后即得上清液正丁醇萃取物DCE；再將下層水相與乙酸乙酯等體積振蕩（200 r/min）混合30 min后，加入分液漏斗中靜置分層，收集上層乙酸乙酯萃取相，75 ℃烘干后即得上清液乙酸乙酯萃取物YZE；下層水相繼續(xù)與氯仿等體積振蕩（200 r/min）混合30 min，分液漏斗分層后，收集下層氯仿萃取相，75 ℃烘干后即得上清液氯仿萃取物L(fēng)FE；上層水相濃縮烘干后，即為上清液萃取剩余物WTE。

1.3.3 上清液萃取物L(fēng)C-MS檢測(cè)分析

將上述DCE、YZE、LFE及WTE分別用去離子水配制成質(zhì)量濃度為20 mg/L的溶液，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后，取適量濾液加入檢測(cè)瓶進(jìn)行LC-MS檢測(cè)分析，檢測(cè)條件[28]為：色譜條件：色譜柱：

ACQUITY UPLC?HSS T3（2.1×150 mm，1.8 μm）；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度8 ℃；流速0.25 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL；流動(dòng)相：正離子0.1%甲酸溶液（C）-0.1%甲酸-乙腈（D），負(fù)離子5 mmol/L甲酸銨溶 液（A ）-乙腈（B ）；梯度洗脫程序：0～1 min，2% B/D；1～9 min，2%～50% B/D；9～12 min，50%～98% B/D；12～13.5 min，98% B/D；13.5～14 min，9 8%～2% B/D；14～20 min，2% D（正模式）（14～17 min，2% B（負(fù)模式））。質(zhì)譜條件：儀器使用電噴霧離子源，正負(fù)離子電離模式，正離子噴霧電壓為3.50 kV，負(fù)離子噴霧電壓為2.50 kV，鞘氣壓力30 arb，輔助氣壓力10 arb。毛細(xì)管溫度325 ℃，以分辨率60 000進(jìn)行全掃描，掃描范圍m/z81～1 000，并采用高能碰撞解離進(jìn)行二級(jí)裂解，碰撞能為30 eV，同時(shí)采用動(dòng)態(tài)排除去除無(wú)必要的MS/MS信息。

1.3.4 樟芝深層發(fā)酵培養(yǎng)

將樟芝無(wú)性孢子按1.0×106個(gè)/mL接種到裝有100 mL液體培養(yǎng)基（含葡萄糖20 g/L、酵母粉2 g/L、MgSO4?7H2O 3 g/L、KH2PO43 g/L，pH 4.5）的500 mL錐形瓶中，于搖床中26 ℃、150 r/min培養(yǎng)11 d[29]。

1.3.5 CWE不同組分對(duì)樟芝深層發(fā)酵產(chǎn)孢量的影響

1.3.5.1 不同醇沉組分對(duì)產(chǎn)孢量的影響

將1.3.1節(jié)制備的CWE母液及1.3.2.1節(jié)CWE醇沉上清液和沉淀溶液用0.45 μm無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾除菌后，分別吸取600 μL加入100 mL滅菌冷卻后的液體培養(yǎng)基中（各組分終質(zhì)量濃度均為60 μg/mL），再按1.3.4節(jié)方法進(jìn)行接種和發(fā)酵培養(yǎng)，從第6天開(kāi)始每日定時(shí)取樣檢測(cè)產(chǎn)孢量，以添加等體積（600 μL）去離子水作為空白對(duì)照。

1.3.5.2 不同上清液萃取組分對(duì)產(chǎn)孢量的影響

將1.3.2.2節(jié)CWE分級(jí)萃取后的4 個(gè)組分（DCE、YZE、LFE及WTE）分別用去離子水配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的母液，用0.45 μm無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾除菌后，分別吸取100、300、500 μL加入100 mL滅菌冷卻后的液體培養(yǎng)基中（各組分終質(zhì)量濃度分別為10、30、50 μg/mL），再按1.3.4節(jié)方法進(jìn)行接種和發(fā)酵培養(yǎng)，從第6天開(kāi)始每日定時(shí)取樣檢測(cè)產(chǎn)孢量，以添加500 μL去離子水作為空白對(duì)照。

1.3.6 甜菜堿和赤蘚糖醇對(duì)樟芝深層發(fā)酵產(chǎn)孢量的影響

1.3.6.1 不同質(zhì)量濃度的甜菜堿對(duì)樟芝產(chǎn)孢量的影響

將甜菜堿用去離子水配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的原液，再用去離子水分別稀釋至原液質(zhì)量濃度的1/5及1/25，將原液和所有稀釋液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌后，分別吸取100 μL加入100 mL滅菌冷卻后的液體培養(yǎng)基中（甜菜堿終質(zhì)量濃度分別為0.2、1.0、5.0 μg/mL），再按1.3.4節(jié)方法進(jìn)行接種和發(fā)酵培養(yǎng)，從第6天開(kāi)始每日定時(shí)取樣檢測(cè)產(chǎn)孢量，以添加等體積（100 μL）去離子水作為空白對(duì)照。

1.3.6.2 不同質(zhì)量濃度的赤蘚糖醇對(duì)樟芝深層發(fā)酵的影響

將赤蘚糖醇用去離子水配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的原液，再用去離子水分別稀釋至原液質(zhì)量濃度的1/2、1/5、1/10及1/20，將原液和所有稀釋液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌后，分別吸取200 μL加入100 mL滅菌冷卻后的液體培養(yǎng)基中（赤蘚糖醇終質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL），再按1.3.4節(jié)方法進(jìn)行接種和發(fā)酵培養(yǎng)，以添加等體積（200 μL）去離子水作為空白對(duì)照。從第6天開(kāi)始每日定時(shí)取樣檢測(cè)產(chǎn)孢量。發(fā)酵結(jié)束（11 d）后，檢測(cè)對(duì)照組和赤蘚糖醇最佳添加質(zhì)量濃度組的生物量、胞內(nèi)多糖產(chǎn)量及總?cè)飘a(chǎn)量等指標(biāo)。

1.3.7 樟芝深層發(fā)酵相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

1.3.7.1 產(chǎn)孢量和生物量測(cè)定

發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液用4 層紗布過(guò)濾，取適量濾液用血球計(jì)數(shù)板于光學(xué)顯微鏡下對(duì)樟芝節(jié)孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)并計(jì)算產(chǎn)孢量，單位為個(gè)/mL；同時(shí)，濾渣（即樟芝菌絲體）用去離子水沖洗3 遍后，放入75 ℃烘箱中烘干并稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算生物量，單位為g/L[27]。

1.3.7.2 胞內(nèi)多糖和總?cè)飘a(chǎn)量測(cè)定

將測(cè)完生物量的樟芝菌絲體粉碎后，準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g加入10 mL蒸餾水，95 ℃水浴提取2 h，收集上清。重復(fù)提取3 次并合并上清，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至10 mL左右，再加入3 倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后放入4 ℃冰箱中靜置過(guò)夜，8 000 r/min離心10 min（4 ℃），收集沉淀并置于75 ℃烘箱中烘干，稱(chēng)質(zhì)量并計(jì)算胞內(nèi)多糖產(chǎn)量[27]。同時(shí)，采用香草醛-高氯酸法測(cè)定樟芝菌絲體中總?cè)坪?。總?cè)朴眉状继崛?，采用分光光度?jì)在550 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度，以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及生物量計(jì)算總?cè)飘a(chǎn)量[27]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 個(gè)生物重復(fù)，所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin Pro 8.5軟件進(jìn)行繪圖，采用SPSS 22.0軟件及單因素方差分析法進(jìn)行差異顯著性分析，差異顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛樟樹(shù)水提物醇沉上清和沉淀對(duì)樟芝產(chǎn)孢量的影響

前期研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加60 μg/mL的CWE可顯著促進(jìn)樟芝深層發(fā)酵無(wú)性產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量較對(duì)照組提高58%左右[27]。由圖1可知，CWE醇沉沉淀對(duì)樟芝產(chǎn)孢量無(wú)明顯影響，而CWE醇沉上清明顯促進(jìn)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢且促進(jìn)效果與CWE相當(dāng)?？梢?jiàn)，CWE中的效應(yīng)物主要存在于CWE醇沉上清中。

圖1 CWE不同醇沉組分對(duì)樟芝產(chǎn)孢量的影響Fig.1 Effects of different fractions obtained from CWE by alcohol precipitation on the sporulation of A.cinnamomea

2.2 牛樟樹(shù)水提物醇沉上清萃取物對(duì)樟芝產(chǎn)孢量的影響

由圖2可知，10～50 μg/mL WTE對(duì)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢均無(wú)任何促進(jìn)效果，說(shuō)明效應(yīng)物已被萃取到有機(jī)溶劑中，在萃取剩余物中已無(wú)殘留或殘留量甚微；添加10～50 μg/mL的DCE對(duì)樟芝產(chǎn)孢亦無(wú)任何促進(jìn)效果，相反，高質(zhì)量濃度（50 μg/mL）的DEC明顯抑制樟芝產(chǎn)孢，說(shuō)明DCE中幾乎不含效應(yīng)物，甚至含有抑制樟芝無(wú)性產(chǎn)孢的物質(zhì)；添加10～50 μg/mL的YZE和LFE均明顯促進(jìn)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢，且LFE的促進(jìn)效果優(yōu)于YZE。其中，YZE的最佳添加質(zhì)量濃度為50 μg/mL，此時(shí)樟芝最大產(chǎn)孢量（6.33×107個(gè)/mL）較對(duì)照組提高35.35%；LFE的最佳添加質(zhì)量濃度為30 μg/mL，此時(shí)樟芝最大產(chǎn)孢量（7.10×107個(gè)/mL）較對(duì)照組提高52.02%。上述結(jié)果表明，效應(yīng)物主要存在于YZE和LFE中，且在LFE中的含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）明顯高于YZE。

圖2 不同質(zhì)量濃度的DCE（A）、YZE（B）、LFE（C）及WTE（D）對(duì)樟芝產(chǎn)孢量的影響Fig.2 Effects of different concentrations of DCE (A),YZE (B),LFE (C)and WTE (D) on the sporulation of A.cinnamomea

2.3 上清液分級(jí)萃取組分LC-MS分析

為明確CWE中促進(jìn)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢的主要效應(yīng)物，對(duì)CWE醇沉上清的4 個(gè)萃取組分進(jìn)行LC-MS檢測(cè)分析，每個(gè)組分中質(zhì)量分?jǐn)?shù)排名前10的物質(zhì)信息見(jiàn)表1。

表1 CWE醇沉上清液分級(jí)萃取組分中含量排名前10的物質(zhì)Table 1 Top 10 most abundant compounds in different fractions obtained from the supernatant after alcohol precipitation of CWE

綜合表1和圖2的結(jié)果可知，LFE和YZE均明顯促進(jìn)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢，而LFE中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高（10%以上）的物質(zhì)分別為赤蘚糖醇和7-甲氧基香豆素，YZE中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高（6%以上）的物質(zhì)分別為甲吡唑、赤蘚糖醇和甜菜堿。因此，效應(yīng)物應(yīng)為赤蘚糖醇、7-甲氧基香豆素、甲吡唑和甜菜堿中的一種或幾種。DCE和WTE均無(wú)任何促樟芝無(wú)性產(chǎn)孢效果，而DCE和WTE中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（13%以上）的物質(zhì)均為甲吡唑，因此，可以確定甲吡唑并非效應(yīng)物。同時(shí)，高質(zhì)量濃度的DCE明顯抑制樟芝無(wú)性產(chǎn)孢（圖2），可見(jiàn)甲吡唑?qū)φ林o(wú)性產(chǎn)孢可能有抑制作用。此外，YZE中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的物質(zhì)也是甲吡唑，而LFE中甲吡唑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較低（排名第6），這解釋了LFE促進(jìn)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢的效果明顯優(yōu)于YZE的原因。YZE中質(zhì)量分?jǐn)?shù)排名前10的物質(zhì)并無(wú)7-甲氧基香豆素，LC-MS檢測(cè)7-甲氧基香豆素在YZE中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.37%。可見(jiàn)，7-甲氧基香豆素并非效應(yīng)物。在促進(jìn)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢效果最好的LFE中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的物質(zhì)為赤蘚糖醇，達(dá)12.78%。在促進(jìn)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢效果僅次于LFE的YZE中，赤蘚糖醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)排名第2，為6.78%。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道，以赤蘚糖醇為碳源可以顯著促進(jìn)哈茨木霉（Trichoderma harzianum）和棘孢木霉（Trichoderma asperellum）分生孢子的產(chǎn)生[30]。因此，赤蘚糖醇可能為CWE中促進(jìn)樟芝深層發(fā)酵無(wú)性產(chǎn)孢的主要效應(yīng)物；甜菜堿在YZE中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與赤蘚糖醇相當(dāng)，均為6%以上。在LFE中，甜菜堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也在3%以上。因此，甜菜堿亦可能為效應(yīng)物之一，但尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.4 不同質(zhì)量濃度赤蘚糖醇和甜菜堿對(duì)樟芝深層發(fā)酵的影響

為驗(yàn)證赤蘚糖醇和甜菜堿對(duì)樟芝深層發(fā)酵無(wú)性產(chǎn)孢是否具有促進(jìn)作用，考察不同質(zhì)量濃度商用赤蘚糖醇和甜菜堿對(duì)樟芝深層發(fā)酵無(wú)性產(chǎn)孢量的影響。由圖3可知，添加1.0 μg/mL甜菜堿對(duì)樟芝深層發(fā)酵無(wú)性產(chǎn)孢有輕微促進(jìn)作用，最大產(chǎn)孢量較對(duì)照組提高7.36%，但二者之間并無(wú)顯著差異?？梢?jiàn)，甜菜堿對(duì)樟芝深層發(fā)酵無(wú)性產(chǎn)孢無(wú)顯著促進(jìn)作用。相反，高質(zhì)量濃度（5.0 μg/mL）的甜菜堿對(duì)樟芝深層發(fā)酵無(wú)性產(chǎn)孢有明顯抑制作用。此外，添加1.0、2.0 μg/mL的赤蘚糖醇均明顯提高樟芝深層發(fā)酵無(wú)性孢子產(chǎn)量。其中，添加1.0 μg/mL的赤蘚糖醇時(shí)，最大產(chǎn)孢量達(dá)6.78×107個(gè)/mL，較對(duì)照組提高55.17%，促進(jìn)效果較為明顯；添加2.0 μg/mL的赤蘚糖醇對(duì)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢的促進(jìn)效果略低于1.0 μg/mL；但當(dāng)赤蘚糖醇的添加質(zhì)量濃度高于5.0 μg/mL時(shí)，則對(duì)樟芝無(wú)性產(chǎn)孢表現(xiàn)出明顯的抑制效果，產(chǎn)孢量大幅下降。

圖3 不同質(zhì)量濃度的赤蘚糖醇（A）和甜菜堿（B）對(duì)樟芝產(chǎn)孢量的影響Fig.3 Effects of different concentrations of erythritol (A) and betaine (B)on the sporulation of A.cinnamomea

綜上所述，赤蘚糖醇確為CWE中促進(jìn)樟芝深層發(fā)酵無(wú)性產(chǎn)孢的主要效應(yīng)物，但促進(jìn)效果具有嚴(yán)重的濃度依賴(lài)性。最適添加質(zhì)量濃度范圍為1.0～2.0 μg/mL。當(dāng)添加質(zhì)量濃度過(guò)低（≤0.5 μg/mL）時(shí)，無(wú)明顯促進(jìn)效果；當(dāng)添加質(zhì)量濃度過(guò)高（≥5.0 μg/mL）時(shí)，則表現(xiàn)出明顯抑制效果。

最后，考察赤蘚糖醇在最佳添加質(zhì)量濃度（1.0 μg/mL）下對(duì)樟芝深層發(fā)酵生物量、胞內(nèi)多糖產(chǎn)量及總?cè)飘a(chǎn)量的影響。由表2可知，添加1.0 μg/mL的赤蘚糖醇對(duì)樟芝深層發(fā)酵過(guò)程中菌絲體的生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用（P＜0.05），使生物量較對(duì)照組提高18.65%。同時(shí)，赤蘚糖醇對(duì)樟芝胞內(nèi)多糖的合成具有較為顯著促進(jìn)作用（P＜0.05），使胞內(nèi)多糖產(chǎn)量較對(duì)照組提高260.13%，效果極其可觀。但是，赤蘚糖醇對(duì)樟芝深層發(fā)酵總?cè)频暮铣杉爱a(chǎn)量無(wú)顯著影響。

表2 赤蘚糖醇對(duì)樟芝深層發(fā)酵活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響Table 2 Effect of erythritol on the biomass and bioactive substance yield from A.cinnamomea in submerged fermentation

3 結(jié)論

CWE中促進(jìn)樟芝深層發(fā)酵無(wú)性產(chǎn)孢的主要效應(yīng)物為赤蘚糖醇，其最佳添加質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL，使樟芝產(chǎn)孢量較對(duì)照組提高55.17%。此外，1.0 μg/mL的赤蘚糖醇還顯著促進(jìn)樟芝深層發(fā)酵過(guò)程中菌絲體生長(zhǎng)及胞內(nèi)多糖的合成，使胞內(nèi)多糖產(chǎn)量較對(duì)照組提高260.13%，效果較為顯著。本研究成果可大幅提高樟芝深層發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中種子制備效率及胞內(nèi)多糖生產(chǎn)效率，對(duì)推動(dòng)樟芝深層發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)程具有重要意義。