連作對植煙土壤微生物群落與環(huán)境因子的影響及相關性分析

朱德倫 賈孟 朱宣全 徐照麗 王戈 王 娜 鄧小鵬 杜宇 周鵬 白羽祥

摘要：為探究連作對植煙土壤微生物群落和土壤環(huán)境因子的影響及其相互作用，對連作和輪作植煙土壤進行１６Ｓ ｒＲＮＡ 高通量測序，并對土壤理化性質、酶活性、酚酸類物質等環(huán)境因子進行測定。 結果表明，連作植煙土壤中鞘氨醇單胞菌屬（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、水恒桿菌屬（Ｍｉｚｕｇａｋｉｉｂａｃｔｅｒ）、橙色出芽單胞菌屬（Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｓ）、人參土黃菌屬（Ｆｌａｖｉｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ）相對豐度增加，細菌生態(tài)網(wǎng)絡復雜度降低；速效鉀、有效磷含量增加，水解性氮、硝態(tài)氮含量降低，轉化酶活性降低，酚酸物質積累。 Ｐｅａｒｓｏｎ 相關性分析表明，土壤速效鉀、有效磷、水解性氮、硝態(tài)氮和轉化酶以及酚酸等環(huán)境因子與鞘氨醇單胞菌屬、水恒桿菌屬、橙色出芽單胞菌屬、人參土黃菌屬呈顯著相關。 可見，連作導致植煙土壤養(yǎng)分失衡，影響土壤微生物群落結構，此結論可為烤煙連作障礙研究提供理論依據(jù)。

關鍵詞：植煙土壤；連作；微生物；環(huán)境因子；相關性分析

中圖分類號：Ｓ３４４.４＋Ｓ１５４.３文獻標識號：Ａ文章編號：１００１－４９４２（２０２４）０１－０１１３－０６

我國烤煙連作面積占煙草總種植面積的３０％～６０％，連作障礙累計造成經(jīng)濟損失高達數(shù)十億元[１] 。 烤煙連作障礙主要歸因于植煙土壤理化性質的變化、酶活性的降低、化感物質的積累以及不同微生態(tài)環(huán)境中微生物多樣性的變化[２－４] 。其中，土壤微生物群落是關鍵性因素，其對環(huán)境變化響應速度快，對維持土壤生態(tài)系統(tǒng)和可持續(xù)生產(chǎn)力具有重要意義[５－７] 。

近年來，隨著１６Ｓ ｒＲＮＡ 基因測序等分子生物技術的快速發(fā)展，越來越多的學者開始關注土壤環(huán)境因子與土壤微生物群落的關系。 土壤理化性質對土壤微生物群落結構具有重要影響[８] 。研究表明，氮元素作為營養(yǎng)物質和能量來源對微生物生長代謝至關重要，磷元素和ｐＨ 值可以直接或間接影響土壤微生物群落的空間結構[９－１０] 。土壤酶作為微生物功能基因的表達產(chǎn)物[１１] ，其活性受相關微生物影響，也是響應土壤微生物的關鍵微生態(tài)因素。 煙草根系分泌的酚酸類物質通過選擇性抑制或促進植煙土壤微生物生長[１２] ，影響微生物群落結構， 導致土壤微生物生態(tài)位改變[１３] 。 前人對土壤微生物群落結構和其他微生態(tài)環(huán)境因子變化特征的研究已相對較為深入，但有關烤煙連作對土壤微生物群落結構的影響，特別是連作條件下土壤微生物群落與環(huán)境因子相作關系的研究尚為不足。 因此，本試驗以烤煙輪作土壤為對照，研究連作土壤中微生物群落和環(huán)境因子的變化特征及其互作關系，以期為研究烤煙連作障礙成因提供一定的理論依據(jù)。

１ 材料與方法

１.１ 試驗地概況及材料

試驗在云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院農(nóng)業(yè)研究基地（２４°２０′１１″ Ｎ，１０２°３１′３８″ Ｅ）進行。 該地海拔１ ６８０ ｍ，年平均氣溫１５.９ ℃，年降水量９１８ｍｍ，雨季（４—９ 月）降水量占年降水量的７９.５％，年日照時數(shù)為２ ０７２ ｈ。 試驗土為砂質紅壤。 設連作（Ｔ）和輪作（ＣＫ）２ 個處理地塊，兩地塊相鄰，面積均為６６６.６７ ｍ２，均種植１０ 年，所用烤煙品種均為‘Ｋ３２６。 輪作處理采用烤煙－油菜－玉米（Ｔ－Ｒ－Ｃ）輪作模式，所用油菜品種為‘玉油５ 號，玉米品種為‘曲辰９ 號，其他農(nóng)藝措施一致。 烤煙施用常規(guī)煙草專用復合肥（Ｎ ∶ Ｐ２ Ｏ５ ∶ Ｋ２ Ｏ ＝１６ ∶６ ∶２４），其種植和管理按照當?shù)馗哔|量煙草生產(chǎn)技術進行。

１.２ 樣品采集與處理

通過五點采樣法采集土樣，每個樣點采集０～２０ｃｍ 土層土壤樣品并混合為一個生物重復，每樣點３個重復。 各樣品過２ ｍｍ 篩后分為三部分：一部分風干后用于土壤酶活性測定；一部分４ ℃冰箱保存，用于理化性質測定；一部分液氮速凍后－８０ ℃保存，用于土壤細菌和酚酸類物質含量測定。

１.３ 測定指標及方法

１.３.１ １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因擴增、文庫構建及測序 采用ＣＴＡＢ 法提取土壤樣本總ＤＮＡ，１％瓊脂糖凝膠電泳檢測ＤＮＡ 質量，用無菌水稀釋至１ ｎｇ/ μＬ。以稀釋后的總ＤＮＡ 為模板，使用帶標簽序列（Ｂａｒｃｏｄｅ）的特異引物和高效、高精度聚合酶進行反應。 引物對應區(qū)域為１６ＳＶ４１８８１ 區(qū)，引物為５１５Ｆ－８０６Ｒ。 ＰＣＲ 產(chǎn)物經(jīng)２％瓊脂糖凝膠電泳檢測后用熱凝膠回收試劑盒（ＬＭＡｌ Ｂｉｏ）回收。 利用Ｉｌｌｕｍｉｎａ 公司的Ｍｉｓｅｑ ＰＥ２５０ 平臺進行測序（廣州基迪奧生物技術有限公司）。 將原始數(shù)據(jù)進行拼接與過濾，基于可操作分類單元（ｏｐｅｒａ￣ｔｉｏｎａｌ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｕｎｉｔｓ，ＯＴＵｓ）進行聚類和物種分類分析，結合原始數(shù)據(jù)，得到基本分析結果。

１.３.２ 土壤理化性質和酶活性測定 土壤ｐＨ 值通過電位法測定，水土比為２.５ ∶１；有機質、水解性氮、有效磷、速效鉀含量分別通過重鉻酸鉀容量法－外加熱法、半微量滴定法、０.５ ｍｏ１/ Ｌ ＮａＨＣＯ３ 浸提－鉬銻抗比色法、１ ｍｏｌ/ Ｌ ＮＨ４ ＯＡＣ 浸提－火焰光度法測定；土壤過氧化氫酶、脲酶、轉化酶活性分別通過高錳酸鉀滴定法、靛酚藍比色法、３，５－二硝基水楊酸比色法測定。

１.３.３ 土壤酚酸測定 稱取土壤樣品１００.００ ｇ置于離心管中，加入１ ｍｏｌ/ Ｌ 的ＮａＯＨ １００ ｍＬ，靜置２４ ｈ 后振蕩１ ｈ；６ ０００ ｒ/ ｍｉｎ 離心２０ ｍｉｎ，濾液用１２ ｍｏｌ/ Ｌ ＨＣｌ 酸化至ｐＨ 值為２.５；２ ｈ 后６ ０００ｒ/ ｍｉｎ 離心２０ ｍｉｎ 除去腐植酸，０.２２ μｍ 纖維膜過濾上清液，濾液利用高效液相色譜（ＨＰＬＣ）分析，結果根據(jù)土壤干重進行轉換。 使用Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ 高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司，美國）測定土壤酚酸化合物，色譜柱為ＳｕｎＦｉｒｅ ＴＭＣ１８（４.６ ｍｍ×２５０ ｍｍ，５ μｍ）（沃特斯科技有限公司，美國），流速為１ ｍＬ/ ｍｉｎ，柱溫為２５ ℃，檢測波長為２８０ｎｍ。 流動相Ａ（甲醇）和流動相Ｂ（ｐＨ＝ ２.５，乙酸水溶液）的特定梯度設定如下：０ ｍｉｎ，流動相Ａ３０％、Ｂ ７０％；１５ ｍｉｎ，流動相Ａ ５０％、Ｂ ５０％；１６ｍｉｎ，流動相Ａ ７０％、Ｂ ３０％；３０ ｍｉｎ，流動相Ａ、Ｂ１００％。 標準樣品為對羥基苯甲酸、間苯三酚、香草酸、香蘭素、阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸，進樣量１０ μＬ。 每個分析周期后設１０ ｍｉｎ 等待期，以消除干擾組分的影響，確保分析結果穩(wěn)定、可重復。

１.４ 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用ＳＰＳＳ ２２.０ 軟件進行單因素方差分析、Ｐｅａｒｓｏｎ 相關性分析，采用Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ３６５ 作圖，利用Ｇｅｐｈｉ ０.９.２ 計算并繪制土壤細菌網(wǎng)絡圖。

２ 結果與分析

２.１ 連作對植煙土壤細菌群落結構的影響

圖１ 顯示，連作植煙土壤細菌群落組成與ＣＫ拈存在顯著差異，在相對豐度前１０ 的屬（相對豐度>０.０１％）中，鞘氨醇單胞菌屬（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、苔蘚桿菌屬（Ｂｒｙｏｂａｃｔｅｒ）、水恒桿菌屬（Ｍｉｚｕｇａｋｉｉ￣ｂａｃｔｅｒ）、芽孢桿菌屬（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、橙色出芽單胞菌屬（Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｓ）、人參土黃菌屬（Ｆｌａｖｉｓｏｌｉｂａｃｔ￣ｅｒ）相對豐度分別較ＣＫ 提高１２２.３６％、２９.４３％、２５０.１１％、３６.２７％、７４.６１％、７４.８１％，節(jié)桿菌屬（Ａｒ￣ｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）相對豐度降低２６.７０％。 偏最小二乘判別分析（ＯＰＬＳ－ＤＡ）結果（圖２）顯示，Ｔ 處理樣本均位于第一、四象限，ＣＫ 樣本均位于第二、三象限，表明兩處理土壤細菌物種差異性顯著；Ｒ２、Ｑ２均大于０.８，說明模型擬合度較好。 Ｐｅａｒｓｏｎ 相關性分析（ ｜ｒ ｜>０.６，Ｐ<０.０５）確定的土壤細菌共生網(wǎng)絡圖（圖３）表明，兩個處理網(wǎng)絡節(jié)點數(shù)基本一致，

但相比于輪作，連作處理共生網(wǎng)絡總連接數(shù)、平均度數(shù)、網(wǎng)絡直徑、圖密度和平均路徑長度較低，模塊化程度較高（表１），說明連作土壤細菌共生網(wǎng)絡拓撲結構復雜度較低。 以上結果表明，烤煙連作可改變土壤細菌群落的物種組成，簡化土壤細菌間的相互作用。

２.２ 連作對植煙土壤環(huán)境因子的影響

連作使植煙土壤理化性質失衡，與ＣＫ 相比，連作土壤中速效鉀和有效磷含量顯著提高，水解性氮和硝態(tài)氮含量顯著降低（表２）；土壤轉化酶活性降低２５.６０％，差異顯著（表３）；土壤酚酸類物質富集，所測７ 種酚酸總含量比ＣＫ 高１２３.５８％，差異顯著，其中，間苯三酚、對羥基苯甲酸、香草酸、香蘭素、阿魏酸和肉桂酸含量顯著提高，分別比ＣＫ 高８７５.５１％、４０.８０％、３５.４８％、２０.７２％、１１８.７５％、３５.２９％（表４）。

２.３ 連作植煙土壤微生物與土壤環(huán)境因子間的Ｐｅａｒｓｏｎ 相關性

土壤細菌與土壤理化性質、酚酸和酶活性三類土壤微生態(tài)環(huán)境因子的Ｐｅａｒｓｏｎ相關性熱圖（圖４） 表明，鞘氨醇單胞菌屬、水恒桿菌屬與間苯三酚、對羥基苯甲酸、香草酸、香蘭素、阿魏酸、肉桂酸、有效磷、速效鉀顯著或極顯著正相關，與硝態(tài)氮、轉化酶活性呈顯著或極顯著負相關，其中水恒桿菌屬與水解性氮顯著負相關；節(jié)桿菌屬與對羥基苯甲酸、香草酸、香蘭素、肉桂酸、ｐＨ 值、脲酶、過氧化氫酶顯著或極顯著負相關；橙色出芽單胞菌屬與間苯三酚、對羥基苯甲酸、香草酸、香蘭素、阿魏酸、肉桂酸、脲酶、過氧化氫酶顯著正相關；人參土黃菌屬與間苯三酚、對羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、肉桂酸、有效磷、速效鉀顯著正相關，與硝態(tài)氮顯著負相關。 以上結果表明，鞘氨醇單胞菌屬、節(jié)桿菌屬、水恒桿菌屬、橙色出芽單胞菌屬、人參土黃菌屬與土壤環(huán)境因子具有顯著相關性關系。

３ 討論

連作可不同程度改變植煙土壤細菌群落結構，簡化土壤細菌共生網(wǎng)絡復雜度，本研究與前人研究結果一致[１４－１５] 。 連作土壤中除節(jié)桿菌屬豐度顯著下降外，鞘氨醇單胞菌屬、水恒桿菌屬、橙色出芽單胞菌屬、人參土黃菌屬豐度顯著增加。其原因可能源于土壤招募、土壤微生物群落與其他土壤環(huán)境因子相互作用后會對某些優(yōu)勢物種提供良好的生長繁殖條件。 例如，擬南芥根分泌的三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物Ｌ－蘋果酸以劑量依賴性方式選擇性募集有益的枯草芽孢桿菌ＦＢ１７[１６] ，土壤酸化可招募潛在有益的根瘤菌以增加對枯萎病的抑制[１７] 。 優(yōu)勢菌屬可能對土壤具有重要作用，例如，鞘氨醇單胞菌屬具有生物降解功能[１８－２２] ，還可緩解土壤重金屬污染[２３－２５] ，關于其他三種菌屬對土壤的作用機制尚不明確，有待進一步研究。

Ｐｅａｒｓｏｎ 相關性分析結果表明，鞘氨醇單胞菌屬、水恒桿菌屬、橙色出芽單胞菌屬、人參土黃菌屬與土壤環(huán)境因子呈顯著相關關系。 連作植煙土壤速效鉀和有效磷含量顯著提升，水解性氮和硝態(tài)氮含量顯著下降。 烤煙為喜鉀作物，連作過程施用大量Ｋ２ＳＯ４等鉀肥導致大量速效鉀富集于土壤中。 另有研究表明長期連作增加土壤有效磷含量[２６] ，因此，過量的磷素、鉀素改變土壤細菌群落[２７－２８] ，與之呈正相關。 優(yōu)勢菌屬與水解性氮、硝態(tài)氮和轉化酶的負相關關系，可能是由于這些菌屬具有反硝化特性[２９] ，消耗作為主要氮源的水解性氮和硝態(tài)氮，土壤養(yǎng)分循環(huán)被打破，促使土壤轉化酶活性降低[３０－３２] 。 此外，酚酸類物質與優(yōu)勢菌屬呈正相關，可能是由于酚酸類物質也可用作特定微生物生長繁殖的碳源和氮源[３２] ，連作植煙土壤中酚酸類物質積累刺激了某些微生物的生長繁殖使其成為優(yōu)勢菌屬。

４ 結論

烤煙連作導致植煙土壤速效鉀、有效磷過量，水解性氮、硝態(tài)氮流失，間苯三酚、對羥基苯甲酸、香草酸、香蘭素、阿魏酸、肉桂酸的積累和轉化酶活性降低，改變細菌群落結構，降低細菌共生網(wǎng)絡復雜度，促進鞘氨醇單胞菌屬、水恒桿菌屬、橙色出芽單胞菌屬、人參土黃菌屬相對豐度提升。

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