CRISPR-Cas系統(tǒng)在病原核酸檢測(cè)中的研究進(jìn)展

杜瑤，高宏丹，劉家坤，劉孝榮，邢志浩，張濤，馬東禮

（1 蚌埠醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 233030； 2 深圳市兒童醫(yī)院兒科研究所，廣東 深圳 518034； 3 中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究所深圳合成生物研究所，廣東 深圳 518055； 4 深圳市海微生物科技有限公司，廣東 深圳 518057； 5 蚌埠醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，安徽 蚌埠 233030）

病原體（pathogens）指可以侵犯人體，引起感染甚至傳染病的微生物，包括病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)等，以細(xì)菌和病毒的危害性最大［1］。目前，實(shí)驗(yàn)室診斷病原體的方法［2］主要有病原體培養(yǎng)、抗原抗體檢測(cè)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative realtime PCR， qPCR）和下一代測(cè)序［3］（next-generation sequencing， NGS）等，但這些檢測(cè)技術(shù)都存在一定局限性：病原體培養(yǎng)周期長(zhǎng)；抗原抗體檢測(cè)的應(yīng)用范圍有限且靈敏度不高。qPCR和NGS是目前核酸檢測(cè)最常用和相對(duì)理想的方法，但是qPCR對(duì)儀器、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和操作人員的專業(yè)技能等的高要求，限制了其在醫(yī)療保健環(huán)境中的應(yīng)用， NGS的操作復(fù)雜，也使其應(yīng)用受限。

2019年新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）肆虐全球［4］，造成了全球公共衛(wèi)生危機(jī)，RT-qPCR（quantitative reverse transcription PCR）成為世界衛(wèi)生組織、中國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)等單位推薦的新冠肺炎確診的標(biāo)準(zhǔn)之一。但是，從大規(guī)模的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，RT-qPCR具有“假陽(yáng)性”問(wèn)題，對(duì)于病毒載量較低的樣本（如康復(fù)期患者），其檢出率并不能令人滿意［5］，因此迫切需要開(kāi)發(fā)靈敏度更高的方法。作為斬獲2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的CRISPR-Cas系統(tǒng)，不僅可用于基因編輯，還可用于核酸檢測(cè)，而且基于CRISPR-Cas系統(tǒng)開(kāi)發(fā)的新一代診斷技術(shù)，展現(xiàn)出快速、高通量、靈敏度高、特異性好等優(yōu)勢(shì)［6-7］，而且在資源匱乏地區(qū)等特定場(chǎng)景的適用性中，CRISPR-Cas系統(tǒng)具有難以替代的地位。本文主要介紹了CRISPR-Cas系統(tǒng)的生物學(xué)機(jī)制和分類，側(cè)重總結(jié)基于Cas蛋白的反式切割活性建立的不同形式、不同讀數(shù)的病原核酸檢測(cè)技術(shù)。

1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的生物學(xué)機(jī)制

1987年，CRISPR位點(diǎn)在細(xì)菌基因組中被發(fā)現(xiàn)［8］，2002年CRISPR相關(guān)蛋白被發(fā)現(xiàn)［9］，隨后證實(shí)CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種RNA引導(dǎo)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，可以抵御病毒、質(zhì)粒等入侵遺傳元素［10-11］，其免疫過(guò)程大致可以分為三個(gè)階段：適應(yīng)、表達(dá)和干擾［12-13］。

（1）適應(yīng)階段 Cas蛋白識(shí)別并捕獲外來(lái)核酸片段，獲取新間隔序列，并整合插入自身CRISPR陣列，形成免疫記憶。

（2）表達(dá)階段 當(dāng)外來(lái)核酸再次入侵時(shí)，從CRISPR陣列中相對(duì)應(yīng)的間隔序列，轉(zhuǎn)錄出CRISPR RNA（crRNA）前體并加工獲得小的、成熟的crRNA，其中包含一個(gè)保守的重復(fù)序列和一個(gè)間隔序列，crRNA進(jìn)一步與一個(gè)或多個(gè)Cas蛋白相互作用，形成RNP（ribonucleoprotein）復(fù)合體［14］。

（3）干擾階段 Cas-crRNA復(fù)合體識(shí)別外來(lái)核酸，通過(guò)crRNA靶向目標(biāo)核酸區(qū)域，介導(dǎo)Cas蛋白特異性地破壞入侵核酸［15］。

在不同的CRISPR-Cas系統(tǒng)中，參與適應(yīng)階段的Cas1和Cas2蛋白，在很大程度上是高度保守的。相比之下，參與表達(dá)和干擾階段的蛋白質(zhì)，差異很大［16］。

2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的分類

CRISPR-Cas系統(tǒng)被劃分為2個(gè)類別、6個(gè)類型、48個(gè)亞型［17］。第一個(gè)類別可分為3種類型：Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型，利用由多個(gè)Cas蛋白和crRNA組成的復(fù)合體，切割靶核酸序列［18］。第二個(gè)類別也包括三種類型：Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ型，具有單一的多功能Cas蛋白和crRNA用于干擾［19］，該類系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于病原體的基因組編輯和核酸檢測(cè)，特別是CRISPR-Cas9、Cas12和Cas13［20］。

2.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)類別Ⅰ

CRISPR-Cas第一類系統(tǒng)的三種類型，具有多種Cas蛋白組成的效應(yīng)復(fù)合物。

CRISPR-CasⅠ型的共享效應(yīng)模塊Cascade（CRISPR-associated complex for antiviral defense），是Cas蛋白與crRNA組成的復(fù)合物［21］。Cascade識(shí)別Protospacer相鄰基序（protospacer adjacent motif，PAM）序列，通過(guò)crRNA靶向DNA目標(biāo)位點(diǎn)，利用Cas3蛋白實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)切割［22］。目前，在已確定的7個(gè)亞型（Ⅰ-A到Ⅰ-F和Ⅰ-U）中［23］，Ⅰ-E型CRISPR-Cas3也具有反式切割活性［24］。

CRISPR-Cas Ⅲ型的功能基于由crRNA與Ⅲ-A亞型系統(tǒng)中的Csm復(fù)合物或Ⅲ-B亞型系統(tǒng)中的Cmr復(fù)合物組成的多亞單位復(fù)合物，標(biāo)志性蛋白為Cas10。Ⅲ型整體組成和結(jié)構(gòu)與Ⅰ型效應(yīng)復(fù)合物具有高度相似性［25-26］。Ⅲ型系統(tǒng)的靶位點(diǎn)識(shí)別可激活Cas10蛋白的聚合酶活性，然后由Cas10介導(dǎo)產(chǎn)生環(huán)狀寡核苷酸（cOA），Csm6與cOA的結(jié)合可激活Csm6的RNase結(jié)構(gòu)域活性，從而切割靶RNA和其他相鄰RNA分子［27］。

CRISPR-Cas Ⅳ型系統(tǒng)被分為Ⅳ-A、Ⅳ-B、Ⅳ-D等亞型，主要存在于質(zhì)粒中。研究發(fā)現(xiàn)Ⅳ型系統(tǒng)對(duì)質(zhì)粒有很強(qiáng)的靶向性，某些質(zhì)?？梢岳芒粜虲RISPR-Cas系統(tǒng)對(duì)抗其他質(zhì)粒對(duì)同一宿主菌的競(jìng)爭(zhēng)，Ⅳ型CRISPR-Cas系統(tǒng)的這一特性可能具有應(yīng)用于臨床耐藥基因治療的潛力［28］。

2.2 CRISPR-Cas系統(tǒng)類別Ⅱ

第二類CRISPR-Cas系統(tǒng)的三種類型，都具有獨(dú)特的效應(yīng)蛋白［29］。與第一類系統(tǒng)相比，第二類系統(tǒng)的效應(yīng)模塊僅為一個(gè)單一的多結(jié)構(gòu)域、多功能的蛋白。

CRISPR-CasⅡ型Cas9蛋白是一種雙RNA引導(dǎo)的DNA內(nèi)切酶，通過(guò)crRNA和反式激活crRNA（tracrRNA）組成的復(fù)合物，介導(dǎo)Cas9識(shí)別目標(biāo)DNA上的PAM序列（5′-NGG-3′），然后利用Cas9的HNH和RuvC結(jié)構(gòu)域，切割目標(biāo)雙鏈DNA，產(chǎn)生平末端雙鏈斷裂［19］。最近，Jinek等［30-31］構(gòu)建的單向?qū)NA（single-guide RNA， sgRNA），通過(guò)將三組分系統(tǒng)（Cas9、crRNA、tracrRNA）減少到兩組分（Cas9和sgRNA），簡(jiǎn)化了CRISPR-Cas基因組編輯［30-31］。

CRISPR-CasⅤ型系統(tǒng)分為Ⅴ-A、Ⅴ-B、Ⅴ-C等亞型，其效應(yīng)蛋白分別為Cas12a（Cpf1）、Cas12b（C2c1）、Cas12c（C2c3）等［17］。CRISPR-CasⅤ型系統(tǒng)只需要Cas蛋白和crRNA來(lái)編輯目標(biāo)位點(diǎn)，在crRNA識(shí)別PAM位點(diǎn)（5′-TTTN-3′）并與目標(biāo)DNA充分堿基配對(duì)后，Cas12a利用RuvC結(jié)構(gòu)域，順式切割目標(biāo)序列，產(chǎn)生5′黏性末端的同時(shí)，利用反式切割活性，切割任何相鄰的單鏈DNA（singlestranded DNA， ssDNA）［32］。該特性使CRISPRCas12系統(tǒng)成為核酸檢測(cè)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。最近該系統(tǒng)也被應(yīng)用于分子標(biāo)志物檢測(cè)，如微RNA（microRNA）［33］、心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cardiac troponinⅠ，cTnⅠ）［34］等，針對(duì)該領(lǐng)域的研究對(duì)實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的體外診斷具有重要意義。此外，Cas12也經(jīng)常被應(yīng)用于基因工程［35-36］。Cas14蛋白是CRISPR-CasⅤ型系統(tǒng)中一類結(jié)構(gòu)緊湊的RNA引導(dǎo)的核酸酶（400～700 aa），幾乎只出現(xiàn)在DPANN（一種以極小基因組為特征的超門古菌）中［37］。與一些Cas12蛋白相似，Cas14也具有反式切割活性，而且可以在不依賴PAM序列的情況下，靶向切割目標(biāo)DNA，再反式切割任意相鄰單鏈DNA［38］。與Cas12相比，Cas14對(duì)crRNA與靶標(biāo)模板之間的核苷酸錯(cuò)配的容忍性更低，可實(shí)現(xiàn)高保真的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism， SNP）基因分型［39］。

CRISPR-CasⅥ型系統(tǒng)可分為Ⅵ-A、Ⅵ-B、Ⅵ-C和Ⅵ-D亞型，標(biāo)志性蛋白是Cas13，具有兩個(gè)HEPN結(jié)構(gòu)域［40］，此系統(tǒng)的獨(dú)特性在于該蛋白能夠識(shí)別單鏈RNA分子靶標(biāo)。在crRNA的靶向作用下，Cas13-crRNA復(fù)合物識(shí)別靶標(biāo)核酸上的Protospacer側(cè)翼位點(diǎn)（Protospacer flanking site，PFS）序列，在切割目標(biāo)RNA的同時(shí)，反式切割單鏈RNA［41-42］。

綜上，CRISPR-Cas系統(tǒng)是多樣性的，其關(guān)鍵要素的組成、結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制各不相同［43］。對(duì)CRISPR-Cas系統(tǒng)的深入探索，可能會(huì)為開(kāi)發(fā)新的診斷平臺(tái)提供方向。

3 基于反式切割活性的病原核酸檢測(cè)

CRISPR-Cas最初作為基因編輯系統(tǒng)［44］，在合成生物學(xué)領(lǐng)域被廣泛研究與應(yīng)用，根據(jù)不同蛋白的生物學(xué)功能和特性，開(kāi)發(fā)和設(shè)計(jì)了大量新的基因編輯元件、工具等［45］。2016年，CRISPR-Cas系統(tǒng)首次被應(yīng)用于核酸檢測(cè)［46］，在隨后的研究與開(kāi)發(fā)中展現(xiàn)出高效、精準(zhǔn)的病原核酸檢測(cè)。而合成生物學(xué)作為一門新興交叉學(xué)科，專注于設(shè)計(jì)生物分子或生物系統(tǒng)［47］，這也為分子診斷提供了新思路和新機(jī)會(huì)［48-49］。

早期基于CRISPR開(kāi)發(fā)的核酸檢測(cè)技術(shù)，主要依賴于Ⅱ型的Cas9蛋白，但部分技術(shù)沒(méi)有明顯的優(yōu)勢(shì)［50-51］。隨著對(duì)CRISPR-Cas系統(tǒng)的不斷探索，特別是Cas12、Cas13和Cas14蛋白的反式切割活性的發(fā)現(xiàn)，極大擴(kuò)展了CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用范圍，也進(jìn)一步革新了核酸檢測(cè)領(lǐng)域。最近新發(fā)現(xiàn)Cas3蛋白也具有反式切割活性［24］，其可能會(huì)為CRISPR系統(tǒng)的研究打開(kāi)另一扇門（表1）。

表1 基于CRISPR-Cas系統(tǒng)開(kāi)發(fā)的部分診斷技術(shù)Table 1 Technologies for detecting pathogens based on the CRISPR-Cas system

3.1 基于CRISPR-Cas12系統(tǒng)的診斷

Cas12是一種RNA引導(dǎo)的內(nèi)切酶［44］，包含RuvC和NuC結(jié)構(gòu)域。除了常見(jiàn)的Cas12a和Cas12b蛋白外，Ⅴ型CRISPR-Cas系統(tǒng)的其他Cas12蛋白，如Cas12d、Cas12h、Cas12i和CasF（Cas12j）也具有反式切割活性［74］，但活性較弱，在核酸檢測(cè)領(lǐng)域沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)力［75］。

在廣泛應(yīng)用于核酸檢測(cè)的三種Cas12a蛋白LbCas12a、AsCas12a和FnCas12a中，LbCas12a的反式切割活性最強(qiáng)［76］。2017年Jennifer Doudna團(tuán)隊(duì)［77］開(kāi)發(fā)的DETECTR（DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter ）檢測(cè)技術(shù)，利用LbCas12a（Lachnospiraceae bacteriumND2006）與crRNA復(fù)合物，并在crRNA引導(dǎo)下利用RuvC結(jié)構(gòu)域切割PAM（TTTN）序列下游18～25 nt的靶DNA，在識(shí)別并切割靶標(biāo)dsDNA的同時(shí)，激發(fā)Cas12a的反式切割活性，切割反應(yīng)體系中的ssDNA報(bào)告分子。ssDNA報(bào)告分子標(biāo)記有熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)，一旦切割，熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)被分離，就會(huì)產(chǎn)生穩(wěn)定而強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，熒光信號(hào)的強(qiáng)度可以指示檢測(cè)樣本中靶標(biāo)的量。此外，DETECTR還與重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)結(jié)合（recombinase polymerase amplification， RPA），不僅提高了檢測(cè)分析的靈敏度（amol/L水平），而且避免了對(duì)復(fù)雜、昂貴設(shè)備的需求。該技術(shù)現(xiàn)已成功應(yīng)用于人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus， HPV）［77］和SARS-CoV-2［78］的檢測(cè)（圖1）。

圖1 基于CRISPR-Cas12a的DETECTR檢測(cè)方法原理圖（部分繪圖素材來(lái)自Figdraw）Fig. 1 Schematics of the CRISPR-Cas12a-based CRISPR-diagnostic method DETECTR(Some drawing elements are from Figdraw)

2018年王金、趙國(guó)屏團(tuán)隊(duì)［54］聯(lián)合LbCas12a與PCR擴(kuò)增技術(shù)，建立的HOLMES（one-hour lowcost multipurpose highly efficient system）檢測(cè)技術(shù)，可以在1 h內(nèi)完成對(duì)偽狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）和日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus， JEV）的檢測(cè)，靈敏度可以達(dá)到1～10 amol/L，此外還可以準(zhǔn)確區(qū)分病毒基因型以及人類的單核苷酸多態(tài)性［54］。但是，該技術(shù)聯(lián)合PCR擴(kuò)增提高穩(wěn)定性的同時(shí)也增加了檢測(cè)時(shí)間和設(shè)備依賴性。

隨著對(duì)Cas蛋白的深入研究，Cas12b蛋白被發(fā)現(xiàn)。來(lái)源于嗜熱菌的Cas12b含有單個(gè)RuvC結(jié)構(gòu)域［79］，脫靶效應(yīng)低且同樣具有反式切割活性。根據(jù)這些特性，該團(tuán)隊(duì)將AacCas12b（Alicyclobacillus acidoterrestris）蛋白與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loopmediated isothermal amplification， LAMP）結(jié)合，建立了升級(jí)版的HOLMESv2［55］，只有含有5′-TTC-3′的dsDNA或切割后具有的5′-TAC-3′的DNA序列才能激活A(yù)acCas12b反式切割活性［74］。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了DNA、RNA特異性檢測(cè)以及區(qū)分SNP和定量DNA甲基化，展現(xiàn)出在分子診斷和表觀遺傳學(xué)方面應(yīng)用的潛力。

而同樣聯(lián)合AacCas12b蛋白和LAMP建立的“TB-QUICK”，可以在2 h內(nèi)完成低至1.3 copies/μL的結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)（mycobacterium tuberculosis）［62］。該方法比常規(guī)檢測(cè)方法抗酸桿菌涂片具有更高的靈敏度和特異性。目前，CRISPR-Cas12系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌快速、靈敏的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，如副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus， VP）［80］、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［81］、創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）［82］等。

隨著對(duì)Cas蛋白的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，李偉團(tuán)隊(duì)［83］發(fā)現(xiàn)，AaCas12b（Alicyclobacillus acidiphilus）可以在很寬的溫度（31～59 ℃）和pH范圍（1.0～8.0）內(nèi)保持核酸酶活性，而且Ⅴ-B型CRISPRCas12b是雙RNA引導(dǎo)的DNA核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)，可以識(shí)別和切割靶向dsDNA或ssDNA，也可以非特異性切割ssDNA。當(dāng)靶向dsDNA時(shí)，Cas12b依靠PAM序列（TTC或TAC）完成順式切割。當(dāng)靶向ssDNA時(shí)，Cas12b可不依賴PAM序列實(shí)現(xiàn)切割，而且切割活性高于dsDNA［56］?；诖颂匦蚤_(kāi)發(fā)的CDetection（Cas12b-mediated DNA detection）結(jié)合優(yōu)化的tgRNA（tuned guide RNA）（在間隔區(qū)序列中引入單核苷酸錯(cuò)配），實(shí)現(xiàn)了6種ABO血型等位基因以及乳腺癌相關(guān)基因BRCA1的SNP分型［56］。另一個(gè)利用優(yōu)化的crRNA設(shè)計(jì)的CRISPR-ENHANCE（enhanced analysis of nucleic acids with crRNA extensions），通過(guò)將具有5′-TATTATT-3′序列的7-mer DNA添加到crRNA的3′末端，在明顯提高了SARS-CoV-2核酸檢測(cè)的靈敏度的同時(shí)，保持了特異性［59］。

為了優(yōu)化檢測(cè)技術(shù)，拓展信號(hào)閱讀方式。基于電化學(xué)的生物傳感平臺(tái)因其快速的信號(hào)閱讀、經(jīng)濟(jì)的傳導(dǎo)元件和簡(jiǎn)單的傳感平臺(tái)而得到廣泛的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，但這種傳感平臺(tái)的準(zhǔn)確度不高。而CRISPR-Cas系統(tǒng)在靶向核酸方面具有高準(zhǔn)確性，兩者的聯(lián)合成為開(kāi)發(fā)精準(zhǔn)、低成本的快速檢測(cè)技術(shù)的強(qiáng)大推力。2019年，Dai等［57］將電化學(xué)生物傳感平臺(tái)和CRISPR結(jié)合開(kāi)發(fā)的E-CRISPR檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)CRISPR-Cas系統(tǒng)來(lái)影響電信號(hào)輸出，利用Cas12a的反式切割活性獲得高傳導(dǎo)信號(hào)。該檢測(cè)技術(shù)將修飾有3′-亞甲基藍(lán)（3′-MB）標(biāo)簽的ssDNA報(bào)告分子固定于金電極上，在靶標(biāo)DNA存在的情況下，Cas12a-crRNA反式切割MB-ssDNA分子，亞甲基藍(lán)標(biāo)簽的分離，會(huì)使電化學(xué)信號(hào)降低。在沒(méi)有靶標(biāo)DNA存在時(shí)，Cas12a的反式切割活性保持沉默，ssDNA分子保留在電極表面，從而導(dǎo)致亞甲基藍(lán)的高電化學(xué)電流［57］。該技術(shù)率先在HPV-16和細(xì)小病毒（PB-19）的檢測(cè)中證明了可行性［57］。而同樣利用電化學(xué)CRISPR傳感建立的MoECS（methodology of electrochemical CRISPR sensing），在SARS-CoV-2 Delta變異株檢測(cè)中，展現(xiàn)出高特異性和穩(wěn)定性，為診斷其他新出現(xiàn)的SARS-CoV-2變體提供了借鑒［58］。目前，電化學(xué)傳感聯(lián)合CRISPR-Cas系統(tǒng)逐漸成為醫(yī)學(xué)診斷中強(qiáng)大的分析工具，其還成功應(yīng)用于鼠傷寒沙門氏菌［84］、單核李斯特氏菌［85］、心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cardiac troponinⅠ，cTnⅠ）［34］等的檢測(cè)（圖2）。

圖2 基于CRISPR-Cas12a的E-CRISPR檢測(cè)方法原理圖（圖片繪制來(lái)自BioRender）Fig. 2 Schematics of the CRISPR-Cas12a-based diagnostic method E-CRISPR(The picture was created in BioRender)

而Nouri等［86］開(kāi)發(fā)的SCAN（solid-state CRISPRCas12a-assisted nanopores）檢測(cè)技術(shù)，將Cas12a與固態(tài)納米孔傳感器結(jié)合，利用固態(tài)納米孔傳感器獨(dú)特的單分子靈敏度和無(wú)標(biāo)記電子傳感，定量分析被Cas12a切割的環(huán)狀ssDNA報(bào)告分子［86］。其已成功應(yīng)用于HIV-1和SARS-CoV-2的檢測(cè)［61］。該檢測(cè)平臺(tái)還可以擴(kuò)展到其他類型納米孔和靶標(biāo)核酸檢測(cè)中，為POCT（point-of-care testing）提供一種快速、低成本的方法。

為了優(yōu)化檢測(cè)流程，Ding等［60］開(kāi)發(fā)AIODCRISPR（all-in-one dual CRISPR-Cas12a）檢測(cè)技術(shù)，將RPA擴(kuò)增和CRISPR檢測(cè)的所有反應(yīng)組分混合，在引入兩個(gè)crRNA的同時(shí)，添加高濃度ssDNA報(bào)告分子［60］，一步即可完成對(duì)SARS-CoV-2［87］和HIV-1［88］的檢測(cè)。最近新發(fā)布的sPAMC（suboptimal protospacer adjacent motifs of Cas12a-based）一步法，利用次優(yōu)PAM基序（非傳統(tǒng)PAM），可將反應(yīng)速度加快2～3倍，20 min即可完成SARS-CoV-2檢測(cè)。而且在針對(duì)新冠病毒載量很低（Ct值＞35）的感染初期患者，檢出率也較高［88］。相較于一步反應(yīng)STOPCovid［63］（SHER-LOCK Testing in One Pot COVID-19 version 1）和STOPCovid.v2［64］，具有良好的優(yōu)勢(shì)，但是該技術(shù)對(duì)反應(yīng)溫度要求比較高，需要37 ℃左右的恒溫，無(wú)法室溫進(jìn)行。

3.2 基于CRISPR-Cas13系統(tǒng)的診斷

Cas13是RNA引導(dǎo)和RNA靶向的核酸酶，具有兩個(gè)HEPN結(jié)構(gòu)域［89］，特異性作用于RNA靶標(biāo)，發(fā)揮特異性識(shí)別和非特異性切割的功能［90］。這一特性使其很快在核酸檢測(cè)和疾病診斷中顯示出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，成為開(kāi)發(fā)快速檢測(cè)工具的研究熱點(diǎn)之一。在一系列Cas13蛋白中，Cas13a是第一個(gè)被明確的亞型，也是第一個(gè)被應(yīng)用于核酸檢測(cè)的效應(yīng)蛋白。2017年，張峰團(tuán)隊(duì)［68］首次利用Cas13的非特異性切割活性，開(kāi)發(fā)了SHERLOCK（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking ）核酸檢測(cè)技術(shù)［68］。該技術(shù)與DETECTR原理相同，但依賴于LwaCas13a（Leptotirichia wadei）核酸酶的活性，識(shí)別和切割靶標(biāo)RNA的同時(shí)，反式切割ssDNA報(bào)告分子產(chǎn)生熒光信號(hào)［91］。目前，該技術(shù)已成功應(yīng)用于寨卡病毒（Zika virus， ZIKA）、登革病毒（Dengue virus， DENV）、SARS-CoV-2和惡性瘧原蟲(chóng)［92］等的診斷，可以在短時(shí)間內(nèi)完成高靈敏度的檢測(cè)。而且SHERLOCK反應(yīng)體系的所有組分可以凍干儲(chǔ)存，方便運(yùn)輸?shù)耐瑫r(shí)不會(huì)影響檢測(cè)的靈敏度和特異性［91］（圖3）。

圖3 基于CRISPR-Cas13a的SHERLOCK檢測(cè)方法原理圖（部分繪圖素材來(lái)自Figdraw）Fig. 3 Schematics of the CRISPR-Cas13-based diagnostic method SHERLOCK(Some drawing elements are from Figdraw)

上述的SHERLOCK檢測(cè)技術(shù)有一個(gè)缺點(diǎn)就是只能定性，不能定量。而升級(jí)的SHERLOCKv2，將4種類型的Cas蛋白（LwaCas13a 、PsmCas13b、CcaCas13b和AsCas12a）組合使用，切割用不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記的報(bào)告分子，在FAM、Cy5、HEX和TEX通道中進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了定量同時(shí)檢測(cè)4種核酸序列［73］，但是仍然無(wú)法實(shí)現(xiàn)單管多重檢測(cè)。此外，通過(guò)使用CRISPR相關(guān)酶Csm6（Csm6是一種來(lái)自Ⅲ型CRISPR-Cas系統(tǒng)的二聚體RNA核酸內(nèi)切酶，Cas13剪切后的序列是Csm6的靶向序列）進(jìn)一步放大檢測(cè)信號(hào)，提高了檢測(cè)靈敏度［70］。同時(shí)，SHERLOCKv2也被應(yīng)用于側(cè)向流動(dòng)分析。通過(guò)金納米顆粒標(biāo)記的抗FAM抗體，在試紙條上檢測(cè)被切割的報(bào)告分子，產(chǎn)生視覺(jué)比色信號(hào)［73］。該檢測(cè)平臺(tái)具有SNP檢測(cè)特異性，可快速、便攜和準(zhǔn)確進(jìn)行核酸檢測(cè)，為資源設(shè)備缺乏地區(qū)的流行病監(jiān)測(cè)和病原檢測(cè)提供了技術(shù)支持（圖4）。

圖4 基于CRISPR-Cas13的SHERLOCKv2檢測(cè)平臺(tái)Fig. 4 Schematics of the CRISPR-Cas13 diagnostic platform SHERLOCKv2

為了簡(jiǎn)化工作流程，張峰團(tuán)隊(duì)［93］又引入HUDSON（加熱未提取樣本以消除核酸酶）技術(shù)，成功簡(jiǎn)化了病原檢測(cè)過(guò)程中的核酸提取步驟。HUDSON可有效提取各種臨床樣本（包括尿液、全血、血漿、血清和唾液等）中的病毒核酸，且不影響檢測(cè)靈敏度。HUDSON-SHERLOCK已實(shí)現(xiàn)對(duì)DENV、ZIKA、埃博拉病毒等的快速檢測(cè)［93-94］。該技術(shù)在缺乏基礎(chǔ)設(shè)施的地區(qū)是必需的，非常適合應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

為提高基于CRISPR的檢測(cè)能力，聯(lián)合CRISPR診斷和微流控技術(shù)開(kāi)發(fā)了CARMEN（combinatorial arrayed reactions for multiplexed evaluation of nucleic acids）檢測(cè)平臺(tái)［71］。在微流控技術(shù)的眾多分類中，基于液滴的微流控系統(tǒng)由于其高比表面積、高通量等優(yōu)點(diǎn)，在合成生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出非凡的前景［95］。而且用于微流控檢測(cè)的微流控芯片具有簡(jiǎn)單、體積小、便攜等優(yōu)勢(shì)。在第一代檢測(cè)方法CARMEN v.1中，樣本和Cas13-crRNA復(fù)合物液滴分別編碼和乳化后配對(duì)組合，實(shí)現(xiàn)針對(duì)性的樣本檢測(cè)，該技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)8個(gè)樣本，169種人類相關(guān)病毒。CARMEN v.1證明了基于CRISPR多重檢測(cè)的可行性，但由于需要定制的成像芯片和讀出硬件，以及8～10 h的手工操作和低通量樣本評(píng)估，因此很難應(yīng)用于臨床（圖5）。

圖5 CARMEN-Cas13檢測(cè)方法原理圖（圖片繪制來(lái)自BioRender）Fig. 5 Schematics of the CARMEN-Cas13 detection method(The picture was created in BioRender)

為優(yōu)化檢測(cè)性能，在CARMEN v.1的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了mCARMEN（microfluidic combinatorial arrayed reactions for multiplexed evaluation of nucleic acids），將CRISPR診斷、微陣列技術(shù)與簡(jiǎn)化的臨床工作流程相結(jié)合［96］，開(kāi)發(fā)的mCARMEN呼吸道病毒檢測(cè)面板，可同時(shí)檢測(cè)21種呼吸道病毒，包括SARS-CoV-2及其他冠狀病毒、流感病毒等［72］。mCARMEN是唯一一種將監(jiān)測(cè)功能結(jié)合到單一技術(shù)平臺(tái)中的診斷方法，能夠在一天內(nèi)檢測(cè)數(shù)百個(gè)樣本中的多種呼吸道病毒。

微流控技術(shù)為POCT的發(fā)展提供了強(qiáng)有力的工具。將CRISPR-Cas12a/Cas13a與微流控裝置相結(jié)合，具有快速、高靈敏度、低成本、自動(dòng)化和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。但還有許多需要解決的問(wèn)題，如擴(kuò)散過(guò)程中可能發(fā)生交叉反應(yīng)、芯片外的手動(dòng)步驟等（核酸提取、擴(kuò)增等）［97］。

為了更好地實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，Arizti-Sanz團(tuán)隊(duì)［98］將擴(kuò)增與CRISPR-Cas13系統(tǒng)檢測(cè)整合為一步診斷平臺(tái)SHINE（streamlined highlight of infection to navigate pandemic），通過(guò)添加RNase H提高核酸檢測(cè)靈敏度［98］，并采用管內(nèi)熒光和配套的智能手機(jī)應(yīng)用程序，實(shí)現(xiàn)了SARS-CoV-2有效的核酸檢測(cè)［69］。SHINE診斷平臺(tái)最大限度地減少了對(duì)設(shè)備的要求，也減少了結(jié)果讀數(shù)偏差。而另一個(gè)聯(lián)合微流控芯片和集成型熒光檢測(cè)器的檢測(cè)技術(shù)FIND-IT［70］（this fast integrated nuclease detection in Tandem）和采用物理隔離方法建立的檢測(cè)技術(shù)OR-SHERLOCK及OR-DETECTR［53］，也均在單管SARS-CoV-2的一步核酸檢測(cè)中證明了可行性。

3.3 基于CRISPR-Cas14系統(tǒng)的診斷

除了Cas12和Cas13系統(tǒng)外，結(jié)構(gòu)緊湊的Cas14蛋白也具有類似的反式切割活性。Cas14是一種靶向ssDNA的CRISPR內(nèi)切酶，與CRISPRCas12相比，Cas14識(shí)別和切割目標(biāo)核酸序列不受PAM序列的限制，而且對(duì)crRNA與靶標(biāo)模板之間的核苷酸錯(cuò)配的容忍性更低，內(nèi)部序列對(duì)核苷酸錯(cuò)配更敏感，這一特性使Cas14能夠?qū)崿F(xiàn)高保真的區(qū)分SNP［38］?；诖颂匦越⒌腃as14a-DETECTR檢測(cè)平臺(tái)，已應(yīng)用于人類HERC2基因（該基因決定眼睛顏色［99］）SNP分型。該檢測(cè)技術(shù)也可以與HUDSON結(jié)合，實(shí)現(xiàn)病原的快速檢測(cè)，其已成功應(yīng)用于人類博卡病毒（HBoV-1）的檢測(cè)［66］。最近，另一個(gè)基于Cas14a1蛋白的ACasB（aptamerbased Cas14a1 biosensor）新檢測(cè)平臺(tái)，可以在復(fù)雜樣本中實(shí)現(xiàn)100%檢出金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［67］。CRISPR-Cas14是病原突變篩查的一種高效且經(jīng)濟(jì)的方法，但由于Cas14僅結(jié)合和切割ssDNA，因此需要額外的步驟使dsDNA靶標(biāo)生成ssDNA，這一特殊性將增加應(yīng)用的復(fù)雜性。因此，到目前為止，Cas14蛋白在分子診斷應(yīng)用領(lǐng)域并沒(méi)有展現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)。

3.4 基于CRISPR-Cas 3系統(tǒng)的診斷

最近，有研究描述Ⅰ-E型CRISPR-Cas3也具有反式切割活性［24］，主要利用Cascade效應(yīng)模塊（由Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、和Cas11等多種蛋白組成）、Cas3蛋白和crRNA組成的復(fù)合物，在與靶標(biāo)結(jié)合后，完成ssDNA探針的切割［100］。而且有研究表明，Cas3-Cascade/crRNA效應(yīng)復(fù)合物必須與靶標(biāo)DNA形成完整的R-loop結(jié)構(gòu)，才能利用Cas3蛋白完成切割［101］，這一特性可以防止Cas3過(guò)早與DNA結(jié)合，引起非特異性切割?；诖诵麻_(kāi)發(fā)的CONAN（Cas3-operated nucleic acid detection）檢測(cè)技術(shù)對(duì)單堿基區(qū)分具有很高的特異性，不僅成功檢測(cè)出臨床樣本中SARS-CoV-2，還可以特異性檢測(cè)甲型流感病毒（influenza A virus）變體中的單堿基對(duì)突變。Cas3的反式切割活性被發(fā)現(xiàn)不久，未來(lái)一定會(huì)開(kāi)發(fā)更多檢測(cè)方法，拓展CRISPR技術(shù)研究的方向。

4 總結(jié)與展望

CRISPR-Cas系統(tǒng)作為新穎而強(qiáng)大的核酸診斷工具，利用不同Cas蛋白的固有特性，開(kāi)發(fā)了許多檢測(cè)技術(shù)，而基于Cas12和Cas13蛋白開(kāi)發(fā)的檢測(cè)技術(shù)最具潛力。迄今為止，DETECTR［77］、SHERLOCKv2［73］、CARMEN［71］等很多檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于多種病原檢測(cè)，包括SARS-CoV-2［78，102］，這些檢測(cè)方法通?？梢赃_(dá)到fmol/L至amol/L級(jí)的靈敏度以及實(shí)現(xiàn)單堿基分辨。

為了簡(jiǎn)化和優(yōu)化檢測(cè)的流程，研究人員開(kāi)發(fā)了一些簡(jiǎn)單的樣本預(yù)處理，如HUSDON等，可以實(shí)現(xiàn)直接擴(kuò)增和檢測(cè)病原核酸；而一管式反應(yīng)技術(shù)的開(kāi)發(fā)，降低了樣本污染的風(fēng)險(xiǎn)，將靶標(biāo)核酸擴(kuò)增與Cas蛋白切割兩步反應(yīng)于閉管中進(jìn)行；開(kāi)發(fā)不同的結(jié)果讀數(shù)方法（熒光讀數(shù)、比色讀數(shù)、電化學(xué)讀數(shù)等）并結(jié)合便攜低成本的儀器（智能手機(jī)等），非常適合應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。此外，在一些檢測(cè)技術(shù)中，設(shè)計(jì)使用優(yōu)化的crRNA降低了脫靶效應(yīng)，而利用核苷酸錯(cuò)配耐受性更低的Cas蛋白也解決了潛在的假陽(yáng)性問(wèn)題。

雖然CRISPR-Cas系統(tǒng)具有很多優(yōu)勢(shì)，但在該技術(shù)轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用之前，仍有很多挑戰(zhàn)需要克服。例如，Cas12、Cas13等蛋白對(duì)靶標(biāo)核酸的識(shí)別與切割，依賴于PAM或PFS序列，其限制了目標(biāo)核酸區(qū)域的選擇，大大縮小了引物設(shè)計(jì)的選擇范圍；而且現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)都無(wú)法擺脫核酸預(yù)擴(kuò)增步驟以及實(shí)現(xiàn)單管多重檢測(cè)；同時(shí)基于CRISPRCas系統(tǒng)開(kāi)發(fā)的檢測(cè)技術(shù)與PCR技術(shù)一樣，都無(wú)法為未來(lái)可能新出現(xiàn)的病毒威脅或大流行做出監(jiān)測(cè)。

CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)與探索，為分子生物學(xué)開(kāi)辟了許多新的研究方向。目前，CRISPR-Cas系統(tǒng)已經(jīng)被應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，本文主要綜述CRISPR-Cas系統(tǒng)在病原核酸檢測(cè)方向的研究，討論了具有代表性的診斷平臺(tái)，而CRISPR的應(yīng)用范圍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止核酸檢測(cè)或臨床相關(guān)突變的鑒定。針對(duì)非核酸檢測(cè)的其他領(lǐng)域，如蛋白質(zhì)、氨基酸代謝物、脂質(zhì)、糖類、離子等，CRISPR-Cas系統(tǒng)也具有強(qiáng)大的潛力。目前，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾種基于CRISPR的新檢測(cè)平臺(tái)，不僅可以識(shí)別蛋白質(zhì)［57］，還可以檢測(cè)小分子物質(zhì)（有毒物質(zhì)、藥物等）［103］，但仍有許多具有重要功能的蛋白質(zhì)尚未得到全面研究［104］。因此，將CRISPR-Cas系統(tǒng)與蛋白組學(xué)聯(lián)合，可能會(huì)為蛋白質(zhì)功能的研究提供強(qiáng)大的工具。與此同時(shí)，基于CRISPR的診斷也可以聯(lián)合材料學(xué)，開(kāi)發(fā)可以檢測(cè)固體表面、穿戴物品、醫(yī)療設(shè)備上的核酸，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)病原體檢測(cè)。

隨著對(duì)CRISPR-Cas系統(tǒng)的優(yōu)化和進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，基于CRISPR-Cas系統(tǒng)開(kāi)發(fā)的檢測(cè)技術(shù)可能會(huì)成為病原核酸檢測(cè)的主流平臺(tái)之一。雖然很多檢測(cè)技術(shù)不能很快從實(shí)驗(yàn)室走向臨床應(yīng)用，發(fā)揮其作用，但在不久的將來(lái)，可以為大規(guī)模人口篩查、更好更快地控制病原體傳播、實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供良好平臺(tái)。