新型冠狀病毒復(fù)制子人工合成和應(yīng)用研究進(jìn)展

萬(wàn)里川，王學(xué)軍，王升啟

（軍事醫(yī)學(xué)研究院生物信息中心，北京 100850）

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）自2019年底被發(fā)現(xiàn)以來(lái)［1］，已在全世界范圍內(nèi)造成了超級(jí)大傳播［2］。到2023年9月5日，新冠病毒在全球已導(dǎo)致7.7億人被感染，696萬(wàn)人死亡（https：//covid19.who.int/）。

與2002—2003年間爆發(fā)的嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）和2012年流行的中東呼吸綜合征（MERS）相似，新冠病毒感染者通常也會(huì)出現(xiàn)病毒性肺炎的癥狀，如咽喉疼痛、咳嗽、發(fā)熱、疲勞、肌肉和胸部疼痛和呼吸困難等癥狀［3-9］。大于65歲老年人、合并有基礎(chǔ)疾病者（如心腦血管疾病、糖尿病和腫瘤等）、免疫系統(tǒng)缺陷或受抑制人群、肥胖癥（體質(zhì)指數(shù)≥30）患者，其重癥率和死亡率更高。30%左右感染新型冠狀病毒的康復(fù)患者有COVID-19后遺癥［10-15］。

新型冠狀病毒一般通過(guò)呼吸道飛沫、密切接觸或氣溶膠等方式傳播［16-17］。為了遏制新冠病毒的危害和傳播，各國(guó)科學(xué)家研制出了不少新冠疫苗，包括傳統(tǒng)的滅活疫苗和最新的mRNA疫苗等，對(duì)阻斷新冠病毒的傳播和危害起了不可或缺的作用。然而，由于新冠病毒在刺突蛋白（spike，S）關(guān)鍵位點(diǎn)的不斷快速突變，使得疫苗的保護(hù)效率受到了影響［18-19］。同時(shí)，各大制藥公司開(kāi)發(fā)了一些針對(duì)S蛋白的雞尾酒中和抗體和針對(duì)病毒蛋白酶的小分子化合物（如瑞德西韋和莫努匹拉韋等）對(duì)新冠患者進(jìn)行治療［20-22］。

冠狀病毒科可分為α、β、γ和δ等4個(gè)屬。其中屬于β屬的3種病毒能引發(fā)人類(lèi)嚴(yán)重急性傳染病，包括SARS-CoV-2、嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）和中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）。

冠狀病毒屬于單股正鏈RNA病毒（+ssRNA），其基因組長(zhǎng)度為26～32 kb，是目前已知最大的RNA病毒［23］。新冠病毒基因組RNA長(zhǎng)約29 870 bp。它和寄主mRNA結(jié)構(gòu)相似，也具有5′帽子和3′多聚腺苷［ploy（A）］尾巴結(jié)構(gòu)。新冠病毒基因組RNA可分為前后兩個(gè)部分［24］。前面的5′端部分約占整個(gè)基因組長(zhǎng)度的2/3，是由2個(gè)部分重疊的閱讀框（ORF1a/1ab）組成，它們分別編碼2個(gè)多聚蛋白pp1a和pp1ab，后者的翻譯是通過(guò)在ORF1a終止密碼子上游1個(gè)堿基處的程序性核糖體框架移位過(guò)程實(shí)現(xiàn)。這兩個(gè)蛋白表達(dá)后，具有蛋白酶活性的病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP3和NSP5等把它們切割成16個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NSPs）［25-27］。這些蛋白包括蛋白酶、RNA依賴(lài)的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp，NSP12）和其他裝配復(fù)制-轉(zhuǎn)錄復(fù)合物（replication-transcription complexe，RTC）所需的蛋白，用于正義或反義的病毒基因組和亞基因組RNA合成［28］。后面的3′端部分占整個(gè)長(zhǎng)度的1/3，編碼9個(gè)附屬蛋白和4個(gè)病毒結(jié)構(gòu)蛋白［S蛋白、包膜蛋白（envelope，E）、膜蛋白（membrane，M）和核衣殼蛋白（nucleocapsid，N）］［29-34］。

新冠病毒先是以布朗運(yùn)動(dòng)、擴(kuò)散和靜電等方式和受體細(xì)胞接觸，再通過(guò)其表面的S蛋白和受體細(xì)胞膜上的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）相結(jié)合。S蛋白由球狀頭部S1亞基和莖狀S2亞基構(gòu)成。S1亞基負(fù)責(zé)宿主識(shí)別，而S2亞基介導(dǎo)病毒和宿主細(xì)胞膜融合。與SARS-CoV的S蛋白受體結(jié)合域（RBD）相比，SARS-CoV-2 S蛋白的RBD對(duì)ACE2的結(jié)合親和力更高。SARS-CoV-2的S蛋白上有兩個(gè)切割位點(diǎn)，S1/S2和S2′。SARS-CoV-2的S蛋白在S1/S2位點(diǎn)被宿主弗林蛋白酶切割，將S蛋白轉(zhuǎn)化為亞穩(wěn)態(tài)。宿主細(xì)胞膜上的跨膜絲氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）或組織蛋白酶B和L等蛋白酶在S2′位點(diǎn)切割S蛋白以去除S1亞基，同時(shí)激發(fā)S2亞基發(fā)生構(gòu)象變化，使得病毒和宿主細(xì)胞膜融合，從而進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中［35］。

在進(jìn)入受體細(xì)胞后，病毒RNA基因組首先從核衣殼結(jié)構(gòu)中釋放出來(lái)，利用宿主的核糖體翻譯系統(tǒng)對(duì)病毒mRNA進(jìn)行翻譯，之后進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生的負(fù)鏈模板用于基因組RNA合成，不連續(xù)合成的負(fù)鏈模板用于亞基因組RNA（subgenomic RNA，sgRNA）的合成，其中4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和9個(gè)附屬蛋白均由sgRNA翻譯［36］。病毒單鏈基因組RNA被包裝在串珠型構(gòu)象的N蛋白之中，形成核衣殼結(jié)構(gòu)，然后以出芽的方式進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體中間體，在獲得含有S、M和E等蛋白的脂質(zhì)雙分子層后，形成新的有感染力的病毒顆粒，再開(kāi)始新一輪的生命周期［37］。

由于新冠病毒具有很強(qiáng)的傳染性，所以有關(guān)該病毒的生物學(xué)特性、藥物篩選和疫苗研發(fā)等實(shí)驗(yàn)工作都必須在生物安全三級(jí)及以上的實(shí)驗(yàn)室中展開(kāi)。但是，生物安全三級(jí)及以上的實(shí)驗(yàn)室稀少，且實(shí)驗(yàn)成本高昂，實(shí)驗(yàn)過(guò)程煩瑣，這些不利因素使得SARS-CoV-2病毒相關(guān)的研究工作受到了極大的限制［38-40］。

隨著過(guò)去幾十年現(xiàn)代病毒學(xué)的發(fā)展，科學(xué)家們發(fā)展了病毒復(fù)制子這種工具來(lái)研究高傳染性病毒。所謂的病毒復(fù)制子是通過(guò)分子生物學(xué)的手段使病毒基因組中的一個(gè)或幾個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白基因缺失，同時(shí)不影響病毒的復(fù)制能力。改造過(guò)的病毒復(fù)制子可以在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行正常的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯，但由于缺少一個(gè)或幾個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，因而不能裝配形成完整的病毒顆粒，即喪失了持續(xù)感染細(xì)胞的能力。有些病毒復(fù)制子能和結(jié)構(gòu)基因（如N基因［41］、E基因或ORF3A基因）［42］或異源糖蛋白反向互補(bǔ)，形成有單次侵染力的病毒粒子。但在這種病毒顆粒中，仍然缺乏部分結(jié)構(gòu)基因，因此在沒(méi)有互補(bǔ)基因共轉(zhuǎn)染的情況下，就只能侵染一次容納細(xì)胞。這些復(fù)制子平臺(tái)具有快速、敏感和安全的特點(diǎn)，是研究病毒入侵細(xì)胞和觀(guān)察病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等情況以及抗病毒藥物評(píng)價(jià)和篩選的理想工具［43］。

通常來(lái)說(shuō)，一個(gè)典型的新冠病毒復(fù)制子包括以下四個(gè)部分［44-50］：

①啟動(dòng)子：如原核生物的T7啟動(dòng)子和真核生物的CMV啟動(dòng)子，分別用于在體外無(wú)細(xì)胞體系中由T7 RNA聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄或在體內(nèi)由宿主細(xì)胞RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)下游的病毒序列的轉(zhuǎn)錄。

②缺失部分結(jié)構(gòu)基因的DNA或cDNA序列：通常是缺失一個(gè)或幾個(gè)結(jié)構(gòu)基因的部分或全長(zhǎng)DNA或cDNA序列。

③轉(zhuǎn)錄終止序列poly（A）：用于終止病毒序列的轉(zhuǎn)錄。

④報(bào)告基因：用于方便跟蹤病毒在細(xì)胞體內(nèi)的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等情況，通常是在結(jié)構(gòu)基因如S或N基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列下游插入報(bào)告基因，如綠色熒光蛋白、熒光素酶或由兩者組成的雙報(bào)告系統(tǒng)［51-54］。

隨著反向遺傳學(xué)的發(fā)展和完善，科研人員積累了多種構(gòu)建RNA病毒復(fù)制子的方法，如體外連接法、痘苗病毒載體法、BAC（bacterial artificial chromosome）載體法、酵母體內(nèi)重組法（TAR）、環(huán)形聚合酶延伸反應(yīng)法（circular polymerase extension reaction，CPER）等?？茖W(xué)家利用這些方法構(gòu)建了包括微小RNA病毒科（Picornaviridae）［55］，杯狀病毒科（Caliciviridae）［56］，黃病毒科（Flaviviridae）［57-62］和冠狀病毒科（Coronaviridae）［63-67］等在內(nèi)的眾多的病毒復(fù)制子。其中一個(gè)有名的例子是丙型肝炎病毒的復(fù)制子，它為抗丙肝病毒感染的藥物篩選提供了可靠的模型［68-70］。

常用的將復(fù)制子mRNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的方法有兩種：一種是利用體外無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，將質(zhì)粒中的新冠復(fù)制子序列轉(zhuǎn)錄成mRNA，再通過(guò)電擊或脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法，將mRNA導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)；第二種方法是將帶有真核啟動(dòng)子的復(fù)制子質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞，利用真核細(xì)胞本身的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)，把質(zhì)粒里的新冠復(fù)制子序列轉(zhuǎn)錄成復(fù)制子mRNA序列，并翻譯成相關(guān)的蛋白。第一種利用體外轉(zhuǎn)錄的方法，優(yōu)點(diǎn)是可以直接得到功能性復(fù)制子mRNA，但缺點(diǎn)有二：一是體外轉(zhuǎn)錄的mRNA容易降解；二是轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，如果條件控制不好，得到的全長(zhǎng)mRNA比例會(huì)比較少，從而造成拯救效率低下。而第二種利用攜帶復(fù)制子的質(zhì)粒來(lái)直接轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的方法，不但轉(zhuǎn)染方法比較成熟，而且mRNA表達(dá)水平通常比較高，但同一啟動(dòng)子在不同細(xì)胞中的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的水平可能會(huì)有差異，所以對(duì)于不同種類(lèi)的細(xì)胞，需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和靶細(xì)胞來(lái)決定采用合適的啟動(dòng)子。采用qPCR和Western blot等方法來(lái)測(cè)定病毒基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平可以推測(cè)病毒復(fù)制子在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和翻譯情況。此外，復(fù)制子通常含有報(bào)告基因，可通過(guò)觀(guān)察表達(dá)綠色熒光蛋白細(xì)胞的數(shù)量或測(cè)定熒光素酶基因表達(dá)活性等方案來(lái)間接監(jiān)控病毒復(fù)制子的表達(dá)和復(fù)制情況。

新冠病毒從爆發(fā)到現(xiàn)在的3年多時(shí)間里，全世界科學(xué)家成功構(gòu)建了多種新冠病毒不同結(jié)構(gòu)蛋白缺失的復(fù)制子，進(jìn)行了瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞系的研究。這些復(fù)制子為探索新冠病毒的基因功能、病毒和宿主互作機(jī)制、疫苗評(píng)價(jià)和抗病毒藥物的篩選和評(píng)價(jià)等奠定了堅(jiān)實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)。下面就主要的四種新冠病毒復(fù)制子人工合成方法、一次性復(fù)制子和穩(wěn)定表達(dá)復(fù)制子及其應(yīng)用進(jìn)行逐一討論。

1 新冠病毒復(fù)制子的合成方法

1.1 通過(guò)Ⅱ型或ⅡS型限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行體外連接

由于新冠病毒cDNA序列長(zhǎng)達(dá)約30 kb，加上報(bào)告基因或抗性基因就更長(zhǎng)，很難一次從頭合成全長(zhǎng)，所以研究人員通常把設(shè)計(jì)好的全長(zhǎng)序列分成若干段，在體外逐一化學(xué)合成或通過(guò)RT-PCR得到后，通過(guò)Ⅱ型或ⅡS型限制性?xún)?nèi)切酶酶切產(chǎn)生不同的黏性末端，這些黏性末端能夠逐一互補(bǔ)配對(duì)，從而將不同片段按順序連接起來(lái)，形成全長(zhǎng)的病毒復(fù)制子序列。同時(shí)，復(fù)制子的首尾末端通過(guò)設(shè)計(jì)和載體的首尾端也能互補(bǔ)配對(duì)，從而能把全長(zhǎng)的新冠病毒復(fù)制子序列克隆進(jìn)載體。由于各個(gè)片段是分步單獨(dú)克隆，很好地解決了某些病毒cDNA片段在大腸桿菌內(nèi)不穩(wěn)定的現(xiàn)象。通常在構(gòu)建過(guò)程中，會(huì)刪除某些病毒基因，并加上一些靈敏的報(bào)告基因，比如綠色熒光蛋白（GFP）或熒光素酶基因等，方便后續(xù)對(duì)復(fù)制子的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的觀(guān)察和跟蹤。根據(jù)設(shè)計(jì)原理的不同，有的復(fù)制子是通過(guò)T7 RNA聚合酶，體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生病毒RNA復(fù)制子，再通過(guò)脂質(zhì)體等方法轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的；而有的復(fù)制子是直接將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出病毒RNA復(fù)制子。

2022年，匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)院郭海濤教授團(tuán)隊(duì)［51］利用這種方法構(gòu)建了兩個(gè)目前最小的新冠病毒復(fù)制子。這兩個(gè)復(fù)制子僅包含非結(jié)構(gòu)蛋白ORF1a/1ab和N蛋白序列，其中一個(gè)攜帶T7啟動(dòng)子，能在體外轉(zhuǎn)錄成病毒復(fù)制子mRNA，而另一個(gè)是攜帶CMV啟動(dòng)子的BAC質(zhì)粒。兩個(gè)復(fù)制子都帶有熒光素酶報(bào)告基因。構(gòu)成這兩個(gè)復(fù)制子的F1、F2、F3、F4這4個(gè)片段由BsaI酶切質(zhì)粒得到，而F5片段和LbN片段由Esp3I酶切而來(lái)。這6個(gè)片段由于帶有與上下游片段匹配的黏性末端，在T4 DNA連接酶作用下，按順序連接得到了全長(zhǎng)的IVT-CoV2-Rep cDNA序列，再亞克隆到可誘表達(dá)的pCC1BAC質(zhì)粒中得到BAC-CoV2-Rep質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)表明，由T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄得到的mRNA在轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后，表達(dá)的熒光素酶活性低且不穩(wěn)定，可能是全長(zhǎng)mRNA占比比較少的原因。作者考察了3種SARS-CoV-2病毒復(fù)制抑制劑——瑞德西韋和EIDD-1931（兩者為RdRp酶抑制劑）、GC376（3CL蛋白酶抑制劑）對(duì)復(fù)制子的復(fù)制抑制作用。他們發(fā)現(xiàn)在5 μmol/L濃度時(shí)，三種抑制劑都能完全抑制復(fù)制子mRNA在CHO-K1細(xì)胞中的復(fù)制。與轉(zhuǎn)染復(fù)制子mRNA相比，轉(zhuǎn)染了克隆于BAC質(zhì)粒中的復(fù)制子的細(xì)胞產(chǎn)生了強(qiáng)烈持久的熒光素酶活性。BAC質(zhì)粒復(fù)制子轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞后，同樣用5 μmol/L的這3種病毒抑制劑處理，能降低70%的N蛋白的表達(dá)，瑞德西韋只能降低約10%的熒光素酶活性，而GC376和EIDD-1931分別能降低15%和50%的熒光素酶活性。所以，他們認(rèn)為，用BAC質(zhì)粒復(fù)制子在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生mRNA比體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA在藥物篩選等實(shí)驗(yàn)中效果更好?？傊?，該研究團(tuán)隊(duì)成功地構(gòu)建了2個(gè)迷你型的新冠病毒復(fù)制子系統(tǒng)，并證明可用于病毒復(fù)制、病毒寄主互作和抗病毒藥物的研究中。該工作的巧妙之處在于，在這兩個(gè)迷你型的復(fù)制子中，只包含了新冠病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄必需的復(fù)制轉(zhuǎn)錄酶和必要的N蛋白，而刪除了絕大部分結(jié)構(gòu)蛋白和非必要蛋白，一方面簡(jiǎn)化了構(gòu)建過(guò)程，降低了實(shí)驗(yàn)難度，另一方面排除了非必要蛋白對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，可謂一舉兩得。

同年，羅莎琳德富蘭克林醫(yī)科大學(xué)的Johnny He課題組［71］利用同樣的方法構(gòu)建了攜帶雙啟動(dòng)子和雙報(bào)告基因的SARS-CoV-2復(fù)制子。這個(gè)質(zhì)粒攜帶了HIV長(zhǎng)末端重復(fù)序列啟動(dòng)子，在轉(zhuǎn)染293T和Vero E6細(xì)胞后，通過(guò)HIV Tat蛋白的協(xié)助，可以進(jìn)行長(zhǎng)片段病毒RNA的復(fù)制。同時(shí)他們還檢測(cè)到兩個(gè)報(bào)告基因［螢火蟲(chóng)熒光素酶（FLuc）和GFP］的表達(dá)。另外，該復(fù)制子攜帶的T7啟動(dòng)子可以在T7 RNA聚合酶作用下，體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生長(zhǎng)的病毒RNA。經(jīng)電擊后，也可在Vero E6和293T細(xì)胞中復(fù)制，并檢測(cè)到雙報(bào)告基因的表達(dá)。藥物篩選實(shí)驗(yàn)表明，10 μmol/L瑞德西韋處理能使多個(gè)細(xì)胞系中的報(bào)告基因表達(dá)下降70%。這些實(shí)驗(yàn)表明，該復(fù)制子平臺(tái)可用于SARS-CoV-2病毒復(fù)制研究和抗病毒藥物的篩選，具有安全、方便、快速和靈敏的特點(diǎn)。研究巧妙地利用了HIV長(zhǎng)末端重復(fù)序列啟動(dòng)子，不僅啟動(dòng)效率高，而且必須要在同時(shí)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的HIV Tat蛋白協(xié)助下才能啟動(dòng)，排除了背景非特異性啟動(dòng)的干擾，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。另外，利用雙報(bào)告系統(tǒng)，一方面可以直觀(guān)地觀(guān)察轉(zhuǎn)染情況，另一方面可以對(duì)轉(zhuǎn)染效果、復(fù)制效率和抗病毒藥物作用效果進(jìn)行定量分析。

綜上所述，通過(guò)體外連接方法構(gòu)建新冠病毒復(fù)制子的優(yōu)勢(shì)是簡(jiǎn)單易行，技術(shù)成熟。所采用的質(zhì)粒可為高拷貝或中拷貝，擴(kuò)增和引入突變都很容易。同時(shí)這個(gè)策略也很好地規(guī)避了把新冠病毒cDNA構(gòu)建進(jìn)BAC載體只有有限的酶切位點(diǎn)的限制。通過(guò)這些實(shí)驗(yàn)，我們可以看出，在體外利用T7反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)對(duì)新冠病毒cDNA逆轉(zhuǎn)錄成全長(zhǎng)RNA并加帽，這種實(shí)驗(yàn)策略需要很多額外的步驟和豐富的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，并且反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA均質(zhì)性不好，因此不適用于野生型和突變型病毒復(fù)制子的定量比較分析。而利用BAC載體構(gòu)建的質(zhì)粒是DNA，在體外非常穩(wěn)定，并且不需要體外轉(zhuǎn)錄和加帽等復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，一致性好，所以更適合用于野生型和突變型病毒復(fù)制子的定量比較分析和抗病毒藥物的高通量篩選工作。

1.2 基于細(xì)菌人工染色體的構(gòu)建

把病毒DNA或cDNA序列克隆進(jìn)高拷貝載體是研究病毒基因功能的重要技術(shù)手段。然而，由于某些病毒DNA或cDNA序列的高表達(dá)在大腸桿菌內(nèi)不能穩(wěn)定存在，造成了在克隆某些全長(zhǎng)病毒基因組時(shí)困難重重。

BAC質(zhì)粒pBeloBAC11的出現(xiàn)成功地解決了這個(gè)問(wèn)題。這個(gè)質(zhì)粒包括F因子、啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)、氯霉素抗性基因、LoxP位點(diǎn)和λcos位點(diǎn)等元件。由于它的復(fù)制受到了大腸桿菌F因子的嚴(yán)格調(diào)控，使得每個(gè)細(xì)菌體內(nèi)只能產(chǎn)生1～2個(gè)拷貝的質(zhì)粒，因而保證了外源病毒序列在大腸桿菌體內(nèi)的穩(wěn)定存在。2000年，Enjuanes等首先應(yīng)用pBeloBAC11質(zhì)粒克隆了全長(zhǎng)的豬傳染性胃腸炎冠狀病毒（TGEV）［72］。隨后，該方法又成功地運(yùn)用到人冠狀病毒OC43（HCoV-OC43）、貓傳染性腹膜炎病毒（FIPV）、SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2等不同冠狀病毒全長(zhǎng)cDNA序列的克隆構(gòu)建中［73-79］。但這個(gè)載體的缺點(diǎn)是拷貝數(shù)過(guò)低，提取的質(zhì)粒量少，容易造成大腸桿菌DNA污染。

為了解決這個(gè)問(wèn)題，Wild等把oriV復(fù)制子克隆進(jìn)質(zhì)粒pBeloBAC11，構(gòu)建了pCC1-BAC載體［80］。該載體中的oriV復(fù)制子受TrfA復(fù)制蛋白調(diào)控，后者的表達(dá)受可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子PBAD啟動(dòng)的AraC蛋白調(diào)控。經(jīng)誘導(dǎo)后，oriV復(fù)制子可使細(xì)菌中質(zhì)粒pCC1-BAC的拷貝數(shù)由1個(gè)增加到100個(gè)，因此能極大地增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)，使轉(zhuǎn)染細(xì)胞所需的大量質(zhì)粒很容易獲得。另一個(gè)常用的克隆大片段的可誘導(dǎo)BAC載體是Lucigen公司的pSMART BAC載體，它通過(guò)改變氯霉素抗性基因的轉(zhuǎn)錄方向，避免了抗性基因轉(zhuǎn)錄對(duì)插入DNA片段的影響。

2021年，默沙東公司的He等科學(xué)家［52］把SARS-CoV-2病毒cDNA序列分成5個(gè)片段，在體外化學(xué)合成后，用Gibson系統(tǒng)把它們和酶切后的細(xì)菌人工染色體載體pSMART BAC進(jìn)行重組，成功得到新冠病毒的復(fù)制子。通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄和電轉(zhuǎn)把RNA復(fù)制子導(dǎo)入不同的細(xì)胞系后，利用GFP或熒光素酶活性來(lái)觀(guān)察和定量分析復(fù)制和轉(zhuǎn)錄活性。在轉(zhuǎn)染12 h后的293T和A549細(xì)胞中，除了可以觀(guān)察到GFP的表達(dá)外，還可以檢測(cè)到Luc/GFP sg mRNA的轉(zhuǎn)錄。在電擊48 h后，與293T細(xì)胞相比，A549細(xì)胞中的GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)下降更快，表明復(fù)制子在293T細(xì)胞中更加穩(wěn)定。這個(gè)GFP表達(dá)報(bào)告系統(tǒng)還表明，在其他的細(xì)胞系中，如Calu-1和Huh-7.5，復(fù)制子也能進(jìn)行復(fù)制。對(duì)于293T細(xì)胞，電轉(zhuǎn)效率是1.3%，而對(duì)A549、Calu-1和Huh-7.5等細(xì)胞，電轉(zhuǎn)效率可達(dá)到3%～4%。為了驗(yàn)證GFP信號(hào)確實(shí)來(lái)自于新合成的RNA，在編碼RNA依賴(lài)的RNA聚合酶的NSP12中引入2個(gè)點(diǎn)突變；D760N和D761N。這兩個(gè)突變的聯(lián)合可以使RNA依賴(lài)的RNA聚合酶失去功能，導(dǎo)致RNA不能合成。在轉(zhuǎn)染這兩個(gè)突變的復(fù)制子的A549、Calu-1和Huh-7.5細(xì)胞中，都不能表達(dá)GFP。這些數(shù)據(jù)表明，該復(fù)制子報(bào)告系統(tǒng)的表達(dá)來(lái)自于有活性病毒復(fù)制子RNA的復(fù)制，因此該系統(tǒng)可用于進(jìn)行SARS-CoV-2病毒復(fù)制酶抑制劑有效性的評(píng)價(jià)?？傊?，該論文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，新冠病毒復(fù)制子能在不同細(xì)胞系中復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，但在轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)上有較大的差異。同時(shí)他們巧妙地利用2個(gè)點(diǎn)突變來(lái)失活依賴(lài)于RNA的RNA聚合酶活性，表明轉(zhuǎn)染的RNA確實(shí)發(fā)揮了病毒的轉(zhuǎn)錄功能，從而為體外篩選抗病毒藥物奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

同年，上海復(fù)旦大學(xué)的Zhang Yang等研究人員［81］，以BAC為載體，構(gòu)建了一個(gè)SARS-CoV-2復(fù)制子，其帶有T7啟動(dòng)子、分泌型長(zhǎng)腹水蚤熒光素酶報(bào)告基因，且刪除了S、M和E基因。他們把體外轉(zhuǎn)錄加帽后的復(fù)制子mRNA與N蛋白mRNA共轉(zhuǎn)Huh-7、Huh-7.5、Vero和BHK-21等不同細(xì)胞系，同時(shí)以RNA依賴(lài)的RNA聚合酶的突變體（759-SAA-761）為陰性對(duì)照。結(jié)果表明，該復(fù)制子在BHK-21細(xì)胞中的復(fù)制活性比較高，而在Vero和Huh-7.5細(xì)胞中復(fù)制活性不高。藥物處理實(shí)驗(yàn)表明，在1～100 nmol/L濃度范圍內(nèi)，瑞德西韋濃度越高，熒光素酶的活性就越低。用α干擾素（IFN-α）處理復(fù)制子后，其熒光素酶活性比SAA突變體的熒光素酶活性還要低［82-83］。對(duì)于轉(zhuǎn)化了抗病毒鋅指蛋白長(zhǎng)異構(gòu)體（long isoform of zinc-finger antiviral protein，ZAPL，鋅指抗病毒蛋白能識(shí)別非自我RNA的CPG二核苷酸而起抗病毒的作用）的Huh-7細(xì)胞，復(fù)制子轉(zhuǎn)化的效率是對(duì)照組的1/10，說(shuō)明該復(fù)制子的復(fù)制對(duì)ZAPL的過(guò)表達(dá)很敏感。同時(shí)，在研究中也發(fā)現(xiàn)丙肝病毒抑制劑達(dá)卡他韋、索非布韋和甲氧基胞苷幾乎不能下調(diào)熒光素酶活性或?qū)晒馑孛富钚詻](méi)有影響，說(shuō)明新冠復(fù)制子只對(duì)新冠病毒的抑制劑敏感。總之，該研究同時(shí)比較了RNA依賴(lài)的RNA聚合酶突變體、瑞德西韋、IFN-α、鋅指抗病毒蛋白和丙肝病毒抑制劑對(duì)新冠病毒復(fù)制子復(fù)制和轉(zhuǎn)錄活性的影響，對(duì)于在臨床上指導(dǎo)新冠病毒感染的治療有重要的參考價(jià)值。

2022年，丹麥哥本哈根大學(xué)的Bukh等學(xué)者［84］把SARS-CoV-2病毒分為4個(gè)片段，采用提取臨床樣品中新冠病毒RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR得到；再通過(guò)無(wú)縫克隆的方法，分3步得到含全長(zhǎng)新冠病毒的BAC質(zhì)粒，并分別構(gòu)建了有感染性的病毒和無(wú)感染性的復(fù)制子。其中構(gòu)建的有感染性病毒序列帶有NSP12基因的5個(gè)點(diǎn)突變（L323P，A97V，N491S，F(xiàn)480L和V557L），以及在ORF7a中間部分或全部缺失的位置插入GFP、Fluc或納米熒光素酶（nLuc）基因等報(bào)告基因。在帶nLuc報(bào)告基因的復(fù)制子基礎(chǔ)上，通過(guò)缺失部分S蛋白序列或全部S、E和M蛋白序列得到2個(gè)無(wú)感染性的病毒復(fù)制子。這2個(gè)無(wú)感染性的病毒復(fù)制子，在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，產(chǎn)生的nLuc信號(hào)在轉(zhuǎn)染4 h后不斷增加，到24～30 h到達(dá)高峰，但在72 h后幾乎檢測(cè)不到。取其上清感染新的Vero E6細(xì)胞，15 d內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞病理現(xiàn)象，同時(shí)免疫熒光也沒(méi)有檢測(cè)到N蛋白的表達(dá)，表明它們不能產(chǎn)生有活力的病毒。另外，瑞德西韋對(duì)這2個(gè)無(wú)感染力的病毒復(fù)制子表現(xiàn)出濃度依賴(lài)的抑制作用，25 μmol/L的瑞德西韋能下調(diào)熒光素酶活性至低于對(duì)照組的1/100，而低濃度2.5 μmol/L的處理能使熒光素酶活性下調(diào)至低于對(duì)照組的1/5～1/10?？傊撗芯繄F(tuán)隊(duì)不僅構(gòu)建了缺失不同片段的新冠病毒復(fù)制子，而且還討論了不同報(bào)告基因在不同位置的表達(dá)效果和持續(xù)時(shí)間，對(duì)后來(lái)的實(shí)驗(yàn)人員構(gòu)建類(lèi)似的質(zhì)粒提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)。

需要注意的是，以BAC質(zhì)粒為基礎(chǔ)的新冠病毒復(fù)制子構(gòu)建通常需要把長(zhǎng)達(dá)30 kb的基因組分成6個(gè)以上的片段，每個(gè)片段長(zhǎng)度控制在5 kb以下，因?yàn)榇笥? kb的片段不容易克隆進(jìn)中間載體，并且在凝膠回收時(shí)可能會(huì)斷裂。中間過(guò)渡克隆需要進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，以防PCR帶來(lái)不必要的突變。相鄰的片段是通過(guò)唯一的酶切位點(diǎn)進(jìn)行連接，以保證克隆方向的正確。如果沒(méi)有合適的酶切位點(diǎn)，可以通過(guò)引入沉默突變，產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)，同時(shí)該突變也可用于病毒克隆的遺傳標(biāo)記。然而，多次克隆和多次測(cè)序造成了步驟煩瑣，過(guò)程漫長(zhǎng)。同時(shí)，某些病毒片段在大腸桿菌體內(nèi)不穩(wěn)定，這些都是BAC克隆方法的缺點(diǎn)。為了克服這些局限性，科學(xué)家們發(fā)展了利用酵母的重組克隆系統(tǒng)。

1.3 利用酵母轉(zhuǎn)化相關(guān)重組進(jìn)行克隆

用常規(guī)質(zhì)?？寺∪L(zhǎng)病毒序列主要有兩個(gè)困難：一是可插入片段大小的限制；二是某些病毒序列在大腸桿菌中不穩(wěn)定。和大腸桿菌相比，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）對(duì)外源病毒序列相對(duì)不敏感，且酵母人工染色體載體（YAC）的容量也比較大，可達(dá)250 kb［85］。研究人員利用酵母在體內(nèi)能重組首尾末端有相同序列的不同DNA雙鏈片段，發(fā)展了一種轉(zhuǎn)化相關(guān)重組克隆技術(shù)（transformation-associated recombination，TAR）。它能一次把十幾個(gè)甚至幾十個(gè)末端有部分相同序列的片段和酵母人工染色體載體首尾相連，重組成一個(gè)新的雙鏈DNA分子。最長(zhǎng)的重組DNA分子長(zhǎng)度可達(dá)110 kb以上。TAR載體一般包括一個(gè)著絲粒序列和一個(gè)酵母組氨酸選擇標(biāo)記。TAR載體的克隆位點(diǎn)和病毒復(fù)制子的首尾序列有30～110 bp相同的序列，確保兩者能在酵母體內(nèi)重組，連接形成一個(gè)閉環(huán)的質(zhì)粒。

TAR法的原理是，酵母-大腸桿菌穿梭人工染色體載體和組成病毒復(fù)制子的多個(gè)片段在合適濃度的PEG/乙酸鋰溶液中，30 ℃溫浴30 min后，在一定濃度DMSO處理和42 ℃熱激20 min條件下，可同時(shí)被部分酵母菌攝入體內(nèi)。酵母體內(nèi)天然的重組系統(tǒng)能把載體和復(fù)制子的不同片段按順序重組形成一個(gè)新的質(zhì)粒。沒(méi)有連接復(fù)制子的空載體或只有復(fù)制子片段轉(zhuǎn)化的酵母由于缺乏生成組氨酸的能力，不能生長(zhǎng)繁殖形成克隆，而連接了外源復(fù)制子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化形成的酵母，由于具備組氨酸生成能力，能夠生長(zhǎng)繁殖形成克隆。利用PCR可以鑒定陽(yáng)性含復(fù)制子的酵母菌。通過(guò)電轉(zhuǎn)化等手段，可以將酵母中復(fù)制子質(zhì)粒轉(zhuǎn)到大腸桿菌中。通過(guò)大腸桿菌大規(guī)模制備病毒復(fù)制子后，可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染等實(shí)驗(yàn)。目前，TAR克隆技術(shù)已經(jīng)成功地應(yīng)用于克隆大的DNA病毒，如巨細(xì)胞病毒和1型單純皰疹病毒（HSV-1）等［86-87］。TAR可以連接的片段不僅包括從臨床患者樣品分離的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR得到的cDNA序列，還包括病毒的酶切片段、PCR擴(kuò)增片段或化學(xué)合成的DNA片段等［88-90］。

2020年，瑞士伯爾尼大學(xué)的Jores和Thiel等研究人員［91］根據(jù)2020年1月10日公布的新冠病毒基因組序列，把它分成12個(gè)首尾末端有部分相同序列的片段（圖1），除了第5和第7片段是利用從一個(gè)慕尼黑患者體內(nèi)分離的SARS-CoV-2病毒進(jìn)行RT-PCR得到外，其他片段由化學(xué)合成得到。之后再應(yīng)用酵母轉(zhuǎn)化相關(guān)重組克隆技術(shù)將這12個(gè)片段和質(zhì)粒載體pVC604進(jìn)行重組，從而得到6個(gè)含3種不同5′端序列的完整SARS-CoV-2病毒和用GFP取代ORF7a閱讀框架內(nèi)第40～282 bp序列的SARS-CoV-2病毒。從得到化學(xué)合成的片段后算起，構(gòu)建全長(zhǎng)病毒序列整個(gè)過(guò)程僅耗時(shí)7 d。這充分表明應(yīng)用酵母轉(zhuǎn)化相關(guān)重組克隆技術(shù)可以快速應(yīng)對(duì)突發(fā)疫情。采用T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)產(chǎn)生帶帽的病毒RNA，與編碼新冠病毒N蛋白mRNA共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，或單獨(dú)轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)新冠病毒N蛋白的BHK-21細(xì)胞。電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞鋪在Vero E6細(xì)胞上，2 d后觀(guān)察到了綠色熒光信號(hào)，或產(chǎn)生了空斑，表明構(gòu)建的病毒進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄和翻譯，同時(shí)構(gòu)建的完整病毒質(zhì)粒產(chǎn)生了有感染力的病毒。復(fù)制動(dòng)力學(xué)表明，不含GFP重組病毒和野生型的病毒沒(méi)有差別或稍微下降，但在ORF7a內(nèi)含GFP的病毒復(fù)制子的生長(zhǎng)和野生型的病毒相比顯著下降。血清中和實(shí)驗(yàn)表明，用康復(fù)期患者血清倍比稀釋1∶320以?xún)?nèi)，重組病毒觀(guān)察不到GFP熒光，而在1∶640稀釋時(shí)可以觀(guān)察到微弱熒光。同時(shí)，采用半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）分析法對(duì)不同濃度的瑞德西韋對(duì)SARS-CoV-2-GFP的表達(dá)抑制作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明構(gòu)建的病毒能很好地應(yīng)用于抗病毒藥物的篩選。總之，在新冠暴發(fā)的初期，研究人員就利用了人工化學(xué)合成的方法和酵母的快速重組系統(tǒng)，僅7 d就迅速構(gòu)建了有活性的病毒和帶熒光標(biāo)記的病毒，為后繼的藥物篩選和阻止疫情的蔓延做出了重要的貢獻(xiàn)。

圖1 基于酵母轉(zhuǎn)化相關(guān)重組克隆技術(shù)的新冠病毒復(fù)制子構(gòu)建［91］Fig. 1 SARS-CoV-2 genome organization and construction of SAS-CoV-2 replicon using the TAR technology[91]

2021年，洛克菲勒大學(xué)的Inna Ricardo-Lax等研究人員［43］利用酵母的反向遺傳重組系統(tǒng)，構(gòu)建了缺失了S蛋白的SARS-CoV-2復(fù)制子。他們采用Phi29聚合酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，極大地提高了質(zhì)粒的產(chǎn)量和純度，得到表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞增加了20多倍。傳統(tǒng)的復(fù)制子質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)由于病毒DNA序列比較長(zhǎng)，一般會(huì)采用低拷貝質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒DNA往往量較少，該論文的科學(xué)家靈活地利用了Phi29聚合酶的高保真和高擴(kuò)增的特性，為大量生產(chǎn)用于轉(zhuǎn)染的復(fù)制子質(zhì)粒提供了一種新的思路。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，缺失S蛋白的SARS-CoV-2復(fù)制子可以被皰疹性口腔炎病毒糖蛋白（VSV-G）包裝，形成的病毒粒子能進(jìn)行一次性感染，但病毒進(jìn)入細(xì)胞不依賴(lài)于SARS-CoV-2的受體，如ACE2蛋白和TMPRSS2蛋白，因此極大地?cái)U(kuò)大了可感染細(xì)胞的范圍。由于這種侵染只是一次性的侵染，而不是持續(xù)侵染，可以很方便地在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室里進(jìn)行操作。同時(shí)，他們的實(shí)驗(yàn)還表明該復(fù)制子系統(tǒng)可以用于抗病毒藥物的篩選、驗(yàn)證和發(fā)現(xiàn)與新冠病毒作用的宿主因子。

綜上所述，與基于BAC載體構(gòu)建、體外連接等方法相比較，TAR方法具有多片段能一次性連接、效率高、無(wú)需酶切位點(diǎn)、連接后序列穩(wěn)定和省時(shí)省力的優(yōu)點(diǎn)。體外連接方法對(duì)連接的片段數(shù)很敏感，片段越多越不容易成功，一般都在10個(gè)以下，而TAR的方法，一次可以重組連接10個(gè)以上的片段，極大地方便了像新冠病毒這樣大RNA病毒的克隆。利用BAC載體進(jìn)行新冠病毒的克隆，找到合適的酶切位點(diǎn)往往比較困難，而TAR方法不需要酶切位點(diǎn)，不同片段和載體之間只需要在首尾有一段30～50 bp左右的相同序列，方便了不同突變體的構(gòu)建和報(bào)告基因插入位置的選擇。另外，在酵母體內(nèi)，重組的全長(zhǎng)新冠病毒序列可以快速擴(kuò)繁，并且通過(guò)酵母-大腸桿菌穿梭載體，很容易把帶有全長(zhǎng)新冠病毒序列的質(zhì)粒從酵母中轉(zhuǎn)入大腸桿菌，方便快速產(chǎn)生足夠量的質(zhì)粒用于后續(xù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。總之，TAR方法在病毒復(fù)制子的構(gòu)建特別是大病毒復(fù)制子的構(gòu)建中將發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。

1.4 應(yīng)用環(huán)形聚合酶延伸反應(yīng)構(gòu)建

前面提到的三種方法（體外連接、基于BAC載體構(gòu)建和酵母TAR系統(tǒng)）都要進(jìn)行煩瑣的病毒cDNA擴(kuò)增、連接、轉(zhuǎn)化或重組，以及細(xì)菌和酵母的培養(yǎng)和質(zhì)粒的提取等步驟，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。隨著現(xiàn)代酶學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用PCR技術(shù)和長(zhǎng)片段DNA聚合酶可以擴(kuò)增40 kb的DNA，使得直接擴(kuò)增冠狀病毒基因組成為可能，無(wú)需克隆多個(gè)中間片段后連接［92-93］。2013年，Edmonds等［94］在構(gòu)建黃病毒感染性克隆時(shí)，開(kāi)發(fā)了這種以PCR為基礎(chǔ)，無(wú)需借助細(xì)菌酵母的反向遺傳系統(tǒng)，他們稱(chēng)之為環(huán)形聚合酶延伸反應(yīng)。這種方法和前面3種方法相似的地方是，先把病毒復(fù)制子cDNA序列分為若干段，各個(gè)片段和相鄰的片段之間有部分重疊的末端，再設(shè)計(jì)各個(gè)片段的特異引物，通過(guò)PCR擴(kuò)出。不同的地方是，把各個(gè)片段混合退火，以自身作為引物和模板，連接產(chǎn)生環(huán)形的病毒復(fù)制子。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)生的質(zhì)?？梢灾苯佑糜谵D(zhuǎn)染細(xì)胞，具有快速和高保真的特點(diǎn)［95-97］。

2021年，日本山梨大學(xué)的Torii等研究人員［98］應(yīng)用這種方法合成了新冠病毒和病毒復(fù)制子。應(yīng)用這種方法，他們?cè)?周之內(nèi)就得到高滴度的新冠病毒，同時(shí)利用細(xì)菌人工染色體構(gòu)建了新冠病毒復(fù)制子，它攜帶海腎熒光素酶和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定表達(dá)該復(fù)制子的細(xì)胞株VeroE6/Rep3都能產(chǎn)生亞基因組RNA和病毒蛋白，并檢測(cè)到熒光素酶活性。簡(jiǎn)而言之，科學(xué)家利用CPER的方法能快速構(gòu)建新冠病毒的復(fù)制子，得到穩(wěn)定表達(dá)復(fù)制子的細(xì)胞株，能卓有成效地進(jìn)行抗新冠病毒藥物篩選。

同年，澳大利亞昆士蘭大學(xué)的Amarilla等科學(xué)家［99］利用CPER的方法構(gòu)建了新冠病毒、木麻黃病毒、羅斯河病毒、人和鼠諾如病毒等。實(shí)驗(yàn)表明，構(gòu)建的新冠病毒具有高度的保真性。和轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染高表達(dá)ACE2的ACE2-HEK293T細(xì)胞經(jīng)過(guò)幾代培養(yǎng)后，SARS-CoV-2病毒在弗林蛋白酶切割位點(diǎn)或附近產(chǎn)生的突變最少。細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，用CPER方法得到的病毒和父代的病毒具有相同的噬斑大小和病理變化。另外，利用CPER法還比較容易在全基因組中引入突變或插入報(bào)告基因?？傊?，該實(shí)驗(yàn)的研究人員利用CPER方法快速構(gòu)建一系列活病毒和復(fù)制子，大大拓寬了CPER方法在構(gòu)建不同病毒和病毒復(fù)制子方面的應(yīng)用。

雖然CPER方法可以快速方便產(chǎn)生野生型、突變型和含有報(bào)告基因的病毒復(fù)制子，但它也有一些明顯的缺點(diǎn)，比如：在體外PCR時(shí)，DNA聚合酶不可避免地會(huì)在病毒序列中引入預(yù)測(cè)不到的突變；同時(shí)產(chǎn)生環(huán)形病毒基因組cDNA的效率受設(shè)計(jì)的重疊序列、退火溫度和不同循環(huán)過(guò)程中不配對(duì)等的影響較大。因此，在定量比較野生型和突變型病毒的復(fù)制方面，CPER方法不如基于BAC質(zhì)粒或酵母-細(xì)菌穿梭質(zhì)粒效果好。

2 單周期復(fù)制子系統(tǒng)

由于很多細(xì)胞在細(xì)胞膜上缺乏SARS-CoV-2病毒受體ACE2等蛋白分子，新冠病毒不容易感染成功。為了克服這個(gè)問(wèn)題，新冠病毒復(fù)制子可通過(guò)和編碼其他病毒糖蛋白（如水皰性口炎病毒糖蛋白）的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，包裝得到有感染性的病毒粒子，從而能入侵無(wú)ACE2受體的細(xì)胞并復(fù)制。該類(lèi)型新冠病毒復(fù)制子由于缺乏感染必要的S基因，在沒(méi)有繼續(xù)提供外源病毒糖蛋白的情況下，僅能實(shí)現(xiàn)一輪感染，不能進(jìn)行持續(xù)性感染，因而安全性較高，可以在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展相關(guān)研究。

2021年，清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院丁強(qiáng)課題組［41］構(gòu)建了用GFP取代N蛋白的新冠病毒復(fù)制子，在細(xì)胞中與同時(shí)轉(zhuǎn)染并表達(dá)的SARS-CoV或SARS-CoV-2的N蛋白互補(bǔ)，形成有轉(zhuǎn)錄和復(fù)制能力的類(lèi)SARSCoV-2病毒樣顆粒。同時(shí)，研究者還將病毒N基因克隆到兩個(gè)獨(dú)立的載體，連接后的病毒N蛋白可以在病毒生命周期中發(fā)揮功能，從而進(jìn)一步保證了該細(xì)胞培養(yǎng)模型的生物安全性。此外，他們還開(kāi)發(fā)了96孔高通量抗病毒藥物篩選平臺(tái)，并篩選到沙林霉素、管胞苷I、莫能菌素鈉、氯化霉素和尼格列寧鈉等一批抗SARS-CoV-2感染的強(qiáng)效抗病毒藥物。

同年，得克薩斯大學(xué)醫(yī)學(xué)分部Shi Pei-Yong課題組［42］構(gòu)建了一種反式互補(bǔ)系統(tǒng)，它能產(chǎn)生可單次感染的SARS-CoV-2病毒。該反式互補(bǔ)系統(tǒng)包括含有ORF3和E基因缺失的基因組cDNA以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列突變的質(zhì)粒，以及表達(dá)這兩個(gè)缺失基因的細(xì)胞系。反式互補(bǔ)產(chǎn)生的病毒粒子只能感染細(xì)胞一輪，但不會(huì)產(chǎn)生野生型SARS-CoV-2。接種互補(bǔ)衍生病毒粒子的倉(cāng)鼠和K18-hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠沒(méi)有表現(xiàn)出可檢測(cè)到的疾病。同時(shí)實(shí)驗(yàn)表明，他們構(gòu)建的單周期可侵染的SARS-CoV-2復(fù)制子可應(yīng)用于高通量中和檢測(cè)和抗病毒藥物篩選。

2022年，愛(ài)荷華大學(xué)的Malicoat等學(xué)者［100］利用BAC系統(tǒng)構(gòu)建了一個(gè)SARS-CoV-2病毒復(fù)制子，其中S蛋白的開(kāi)放閱讀框架序列被長(zhǎng)腹水蚤熒光素酶和neonGFP雙報(bào)告系統(tǒng)取代。通過(guò)共轉(zhuǎn)染該復(fù)制子BAC質(zhì)粒和馬水皰性口炎病毒糖蛋白表達(dá)質(zhì)粒到293T/Huh-7.5的混合細(xì)胞中，拯救得到有感染性的病毒復(fù)制子顆粒，同時(shí)檢測(cè)到有熒光素酶活性和觀(guān)察到表達(dá)GFP的細(xì)胞。把共轉(zhuǎn)染復(fù)制子和糖蛋白的Huh-7.5細(xì)胞上清轉(zhuǎn)到新鮮的Huh-7.5細(xì)胞中，不能檢測(cè)到熒光素酶活性和觀(guān)察到GFP信號(hào)，這表明病毒復(fù)制子只能感染一次?？筕SV血清與對(duì)照血清比可以顯著抑制ΔS-VRP（G）對(duì)Huh-7.5細(xì)胞的感染，證明ΔS-VRP（G）的感染是通過(guò)VSV-G蛋白的介導(dǎo)。在人和小鼠肺上皮細(xì)胞、腎細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞中，ΔS-VRP（G）都能很好地侵染和復(fù)制，但表達(dá)水平不一，表明還有其他因子參與了復(fù)制過(guò)程。同時(shí)在小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞里，可誘導(dǎo)寄主強(qiáng)烈的抗病毒基因的表達(dá)，如α干擾素、β干擾素（IFN-β）、Mx1、Isg15和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達(dá)。這些實(shí)驗(yàn)表明該雙報(bào)告系統(tǒng)可以很好地應(yīng)用于寄主的抗病毒反應(yīng)研究。在ΔS-VRP（G）侵染Huh-7.5細(xì)胞和A549細(xì)胞后，加入不同濃度的瑞德西韋和GC376，觀(guān)察到熒光素酶活性降低和GFP表達(dá)細(xì)胞減少，兩者的IC50值分別為26.7 nmol/L和17.3 nmol/L。同時(shí)觀(guān)察到不同的細(xì)胞對(duì)于抗病毒藥物的敏感性不同。

總之，通過(guò)病毒復(fù)制子和外源的糖蛋白的互補(bǔ)作用，形成具有單周期感染特性的病毒，極大地?cái)U(kuò)展了病毒可侵染細(xì)胞的范圍，為研究病毒基因功能、病毒和細(xì)胞的互作，以及抗病毒藥物篩選和評(píng)價(jià)提供了新的思路和平臺(tái)。同時(shí)，這種互補(bǔ)系統(tǒng)只能形成一次性可侵染病毒，而不能形成持續(xù)性感染的病毒，因此，該類(lèi)實(shí)驗(yàn)可在生物安全二級(jí)的實(shí)驗(yàn)室里進(jìn)行。最后，這種單周期可侵染病毒產(chǎn)生的上清可以?xún)龃婧娃D(zhuǎn)移，具有良好的穩(wěn)定性、一致性和重復(fù)性，因此適合大規(guī)?？共《舅幬锏暮Y選。

3 穩(wěn)定表達(dá)的復(fù)制子系統(tǒng)

由于瞬時(shí)表達(dá)的RNA復(fù)制子對(duì)細(xì)胞有內(nèi)在毒性，導(dǎo)致了它不能在細(xì)胞中持續(xù)地復(fù)制，造成適合復(fù)制檢測(cè)的時(shí)間短，不同細(xì)胞批次之間不穩(wěn)定，因而不適用于高通量篩選大化合物庫(kù)。因此，構(gòu)建能穩(wěn)定表達(dá)SARS-CoV-2復(fù)制子的細(xì)胞株成了這個(gè)領(lǐng)域研究的新方向之一。

2022年，山梨大學(xué)的Kohji Moriishi課題組［101］把攜帶海腎熒光素酶和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的融合基因的新冠病毒復(fù)制子克隆進(jìn)BAC載體，通過(guò)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，建立了穩(wěn)定表達(dá)新冠病毒復(fù)制子的細(xì)胞株。經(jīng)檢測(cè)，該細(xì)胞株能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶，并產(chǎn)生病毒的亞基因組RNA。同時(shí)實(shí)驗(yàn)表明，用瑞德西韋和β-干擾素處理兩種細(xì)胞，都能抑制病毒基因和熒光素酶的表達(dá)，而卡莫司他（一種TMPRSS2抑制劑，抑制新冠病毒進(jìn)入細(xì)胞）和法匹拉韋（一種核苷的類(lèi)似物，有病毒抑制活性）沒(méi)有這種效果。莫那比拉韋是一種新的新冠病毒RNA聚合酶抑制劑，和以VeroE6細(xì)胞為基礎(chǔ)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染相比，它對(duì)VeroE6/Rep3細(xì)胞系有更好的抑制病毒活性潛力。他們的工作表明，該穩(wěn)定轉(zhuǎn)染新冠病毒復(fù)制子的細(xì)胞系是高通量篩選抗病毒藥物的有力工具。

同年，Tony Wang等科學(xué)家［102］構(gòu)建了用納米熒光素酶取代S基因，新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因取代E和M基因和攜帶NSP1蛋白K164A/H165A雙突變的SARS-CoV-2的復(fù)制子（圖2）。該復(fù)制子在電轉(zhuǎn)進(jìn)入到BHK-21細(xì)胞（攜帶穩(wěn)定轉(zhuǎn)染四環(huán)霉素誘導(dǎo)表達(dá)N蛋白的質(zhì)粒）后，能瞬時(shí)表達(dá)納米熒光素酶。在G418的選擇壓力下，得到了12個(gè)存活的細(xì)胞系。經(jīng)20次傳代后，納米熒光素酶的表達(dá)沒(méi)有丟失。同時(shí)細(xì)胞內(nèi)存在SARS-CoV-2的RNA復(fù)制子的活躍復(fù)制。隨后，他們利用該復(fù)制子篩選了273種不同化合物對(duì)病毒的抑制作用。這些化合物通過(guò)模擬篩選，能分別靶向新冠病毒的NSP5（3CLpro）、NSP3（PLpro）、NSP12（RdRP）、NSP15、NSP16和X區(qū)。在5 μmol/L的水平，通過(guò)納米熒光素酶活性測(cè)定，9個(gè)化合物有50%的抑制效果。以瑞德西韋和GC376為陽(yáng)性對(duì)照，分別檢測(cè)了Darapladib、Genz-123346和JNJ-5207852等3個(gè)化合物的抑制效果。結(jié)果表明，3個(gè)化合物都表現(xiàn)出細(xì)胞類(lèi)型特異的抑制活性。對(duì)6個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行GC376處理，發(fā)現(xiàn)它們的IC50值在5.9～13 μmol/L之間。總之，該論文作者巧妙地通過(guò)突變新冠病毒的NSP1蛋白降低新冠病毒對(duì)細(xì)胞的毒性，成功得到了穩(wěn)定表達(dá)復(fù)制子并帶有報(bào)告基因的細(xì)胞株，同時(shí)將它們應(yīng)用到了大規(guī)模的抗新冠病毒藥物庫(kù)的篩選，開(kāi)辟了一條篩選抗新冠病毒藥物的新思路。

圖2 新冠病毒復(fù)制子的優(yōu)化［102］Fig. 2 Optimization of the SARS-CoV-2 replicon[102]

構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染復(fù)制子的細(xì)胞株，雖然花費(fèi)的時(shí)間較長(zhǎng)，但由于復(fù)制子能在細(xì)胞中持續(xù)的復(fù)制而不丟失，因而適合較長(zhǎng)時(shí)間的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等的檢測(cè)。同時(shí)，不同細(xì)胞批次之間結(jié)果比較穩(wěn)定，一致性和重復(fù)性好，因而必將在高通量篩選抗病毒大化合物庫(kù)的研究工作中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。

4 總結(jié)和展望

對(duì)于具有高度傳染性的病毒來(lái)說(shuō)，其相關(guān)的研究必須在具備生物安全三級(jí)或以上的專(zhuān)門(mén)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，并且步驟煩瑣，實(shí)驗(yàn)成本高，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，這些不利因素阻礙了相關(guān)病毒學(xué)研究的發(fā)展，特別是在重大疫情突然來(lái)臨時(shí)，不能及時(shí)和有效地應(yīng)對(duì)疫情帶來(lái)的危害。隨著最近幾十年現(xiàn)代病毒學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們通過(guò)刪除一個(gè)或幾個(gè)病毒關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因，同時(shí)插入一個(gè)或幾個(gè)報(bào)告基因和不同的表達(dá)調(diào)控元件，即構(gòu)建病毒復(fù)制子，并用它來(lái)侵染相關(guān)細(xì)胞，用于病毒基因和宿主相關(guān)基因功能研究，以及抗病毒化合物的篩選。這樣的好處是：一方面，病毒能在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯；另一方面，由于缺乏一個(gè)或幾個(gè)結(jié)構(gòu)基因，不能持續(xù)產(chǎn)生完整的病毒粒子，從而導(dǎo)致了傳染性的喪失。這些好處使得對(duì)病毒的相關(guān)基礎(chǔ)研究和抗病毒藥物研發(fā)可以在生物安全二級(jí)常規(guī)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，具有安全、方便、實(shí)驗(yàn)成本低和快速的特點(diǎn)。這些病毒復(fù)制子理論和技術(shù)的發(fā)展為遏制重大疫情的傳播和減少病毒的危害做出了重大貢獻(xiàn)。

病毒復(fù)制子的構(gòu)建技術(shù)在過(guò)去的幾十年里得到了快速的發(fā)展。體外連接法、基于BAC質(zhì)粒構(gòu)建、酵母轉(zhuǎn)化相關(guān)重組法和CPER法是目前構(gòu)建新冠病毒復(fù)制子的四種主流方法。其中，體外連接法和基于BAC質(zhì)粒構(gòu)建法是最早應(yīng)用的方法，其原理簡(jiǎn)單明了，但步驟多，過(guò)程冗長(zhǎng)，往往需要多步的連接和轉(zhuǎn)化過(guò)程，需要較高的實(shí)驗(yàn)水平和技巧。同時(shí)，部分病毒序列在大腸桿菌體內(nèi)不穩(wěn)定，增加了構(gòu)建的難度。隨后發(fā)展的酵母體內(nèi)重組方法，所需的連接轉(zhuǎn)化鑒定步驟少，僅一步就可以把多達(dá)十幾個(gè)甚至幾十個(gè)首尾具有相同序列的DNA片段和酵母-細(xì)菌穿梭載體連接起來(lái)，一次就可以得到全長(zhǎng)的病毒復(fù)制子序列。這種方法的好處在于：第一，酵母對(duì)外源同源的DNA重組效率很高；第二，鑒定陽(yáng)性酵母菌快速簡(jiǎn)單；第三，利用酵母-細(xì)菌穿梭人工染色體載體，通過(guò)電轉(zhuǎn)的方法很容易將質(zhì)粒從酵母轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，這極大地方便了大規(guī)模提取病毒復(fù)制子質(zhì)粒，用于下一步的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。這些優(yōu)點(diǎn)使得越來(lái)越多的研究人員采取該技術(shù)路線(xiàn)來(lái)構(gòu)建新冠病毒和其他大病毒的復(fù)制子。最近發(fā)展的CPER方法只需要通過(guò)簡(jiǎn)單的PCR方法，就能將體外合成的若干具有首尾相同序列的DNA片段和載體環(huán)化，得到含有全長(zhǎng)病毒DNA或cDNA的復(fù)制子，可直接用于細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。這種方法簡(jiǎn)單方便，不需要連接轉(zhuǎn)化鑒定和細(xì)菌或酵母的培養(yǎng)以及質(zhì)粒提取等冗長(zhǎng)步驟，極大地節(jié)省了人力和時(shí)間。但由于PCR本身會(huì)帶來(lái)一些突變，需要進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，并且對(duì)引物的選擇要求比較高，增加了實(shí)驗(yàn)的難度。相信在未來(lái)這種方法也會(huì)得到更多的應(yīng)用。

和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染相比，單周期感染復(fù)制子系統(tǒng)和穩(wěn)定表達(dá)復(fù)制子細(xì)胞株具有更好的穩(wěn)定性、一致性和重復(fù)性，因而能夠?yàn)榇笠?guī)模高通量抗病毒藥物篩選提供更好的平臺(tái)。另外，單周期感染復(fù)制子系統(tǒng)使得研究新冠病毒侵染細(xì)胞膜上沒(méi)有新冠病毒受體的細(xì)胞成為可能。

由于3針或以上疫苗接種的普及和充足的治療藥品，新冠病毒對(duì)中國(guó)人的身體健康危害已有所減輕。但是，由于新冠病毒的高傳染性和高突變性并沒(méi)有發(fā)生根本改變，在未來(lái)仍有可能流行，這將對(duì)一些免疫力低下的特殊人群健康造成嚴(yán)重影響。因此，相關(guān)的研究必須繼續(xù)開(kāi)展和深入探索。由于新冠病毒復(fù)制子具有精準(zhǔn)地突變新冠病毒單個(gè)基因甚至單個(gè)核苷酸的能力，同時(shí)可以引入報(bào)告基因并在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，而且能在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室操作等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)，因此在未來(lái)它仍將是科學(xué)家們用來(lái)研究新冠病毒的未知基因功能、致病機(jī)制以及篩選高特異和低副作用的抗新冠病毒藥物的重要工具和手段。

總之，人工構(gòu)建的新冠病毒復(fù)制子平臺(tái)及其應(yīng)用對(duì)研究新冠病毒的致病機(jī)制、基因功能、宿主因子的驗(yàn)證、病毒的變異和抗病毒藥物的篩選提供了一種重要的手段，同時(shí)也對(duì)遏制新冠病毒的大規(guī)模傳播、減少新冠病毒對(duì)人類(lèi)健康的危害起到了不可或缺的作用。