微生物發(fā)酵法合成蝦青素的研究進(jìn)展

周強(qiáng)，周大偉，孫敬翔，王靖楠，姜萬奎，章文明，2，蔣羽佳，2，信豐學(xué)，2，姜岷，2

（1 南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，材料化學(xué)工程國家重點實驗室，江蘇 南京 211816； 2 南京工業(yè)大學(xué)，江蘇先進(jìn)生物與化學(xué)制造協(xié)同創(chuàng)新中心（SICAM），江蘇 南京 210009）

蝦青素（astaxanthin）是一種橙紅色的酮式類胡蘿卜素，分子式為C40H52O4，化學(xué)名為3，3′-二羥基-4，4′-二酮基-β，β′-胡蘿卜素［1-2］。蝦青素不溶于水，具脂溶性，易溶于苯、氯仿、丙酮和二硫化碳等有機(jī)溶劑，微溶于甲醇、乙醇等極性較大的有機(jī)溶劑［3］。蝦青素是由8個異戊二烯單位組成的四萜烯類，以共軛雙鍵連接，在共軛雙鍵的末端存在不飽和的羥基和酮基［4］。因此，蝦青素存在著不同的構(gòu)型（圖1），包括：左旋（3S，3'S），右旋（3R，3'R）和內(nèi)消旋（3S，3'R）［5］。其中（3S，3'S）異構(gòu)體是自然界中最常見的蝦青素構(gòu)型，也是抗氧化活性最高的構(gòu)型，其次是（3R，3'R）和（3S，3'R）構(gòu)型［6］。

圖1 蝦青素的三種構(gòu)型Fig. 1 Configurations of astaxanthin

蝦青素應(yīng)用價值非常高，其長共軛多烯烴鏈能夠猝滅單線態(tài)氧，清除自由基，提高細(xì)胞的活性，對人體的脂質(zhì)體起到保護(hù)作用，因此在一定程度上起到提高免疫力、抗衰老等效果。有研究顯示，蝦青素的抗氧化能力是維生素C的6000倍，是自然界報道中最強(qiáng)的抗氧化劑［7-9］。同時它可以預(yù)防大部分的氧化應(yīng)激和相關(guān)的炎癥，包括高血壓、癌癥、肥胖、心血管疾病、炎癥性疾病、骨骼病、皮膚病等，因此可作為多靶點藥物制劑［10］。例如，Lignell等［11］研究表明口服含蝦青素的藥物能夠明顯提升人體的肌肉力量以及運動耐力。蝦青素還是天然的著色劑，以不同的構(gòu)型存在于不同的物種中，賦予機(jī)體獨特的顏色。鮭魚肉質(zhì)所呈現(xiàn)出的紅色往往就給人一種視覺上的享受，使人輕易判斷出食物的新鮮度以及風(fēng)味。此外，蝦青素還可以用于家禽飼料的添加，有研究指出在飼料中添加10 mg/kg的天然蝦青素可以有效在肉鴨體內(nèi)沉積，使活鴨的喙、掌呈現(xiàn)出健康的金黃色，同時也可提高肌肉脂質(zhì)的氧化穩(wěn)定性，使其營養(yǎng)價值更高［12］。蝦青素還對環(huán)境植物起著保護(hù)作用，如蝦青素噴霧劑可以增加葡萄葉的光合作用，提高葡萄葉的抗逆性，改變葡萄葉的色澤。因此，目前蝦青素在醫(yī)療、化妝品、食品、飼料添加劑、保健品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用與日俱增（圖2）［13-14］。2017年全球類胡蘿卜素市場估值為15億美元，2022年已達(dá)到20億美元［15］。而作為第二大類胡蘿卜素的蝦青素，它的全球市場價值預(yù)計到2027年將增長到近34億美元［16］。

圖2 蝦青素的應(yīng)用領(lǐng)域Fig. 2 Applications of astaxanthin

目前，生產(chǎn)蝦青素的方法主要包括天然提取法、化學(xué)合成法以及微生物發(fā)酵法。天然提取法是從龍蝦、螃蟹等甲殼類廢棄物中提取蝦青素，但產(chǎn)量極低、過程復(fù)雜、成本高昂，且提取過程易受污染，在經(jīng)濟(jì)上不可行［17-18］?；瘜W(xué)合成法生產(chǎn)周期較長且過程復(fù)雜［19］，合成的產(chǎn)物是多種構(gòu)型混合的蝦青素并且還積累多種副產(chǎn)物［20］，在生物體內(nèi)吸收利用率低于天然提取的蝦青素，因此不被批準(zhǔn)用于人類使用［19］。

隨著合成生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，使用微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然產(chǎn)物展現(xiàn)出巨大潛力［21-23］。利用微生物生產(chǎn)的蝦青素具有構(gòu)型明確、環(huán)境友好、副產(chǎn)物少等優(yōu)點［16］，因此，這是一種極具前景的蝦青素生產(chǎn)方法［18，24］。目前用于發(fā)酵合成蝦青素的微生物包括藻類、細(xì)菌、酵母等［25］。本文通過論述雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、紅法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）等微生物生產(chǎn)蝦青素的最新進(jìn)展，總結(jié)了用以提高蝦青素產(chǎn)量、降低成本的蝦青素高產(chǎn)菌株的篩選與代謝工程改造策略。

1 蝦青素的生物合成路徑

蝦青素的生物合成一般可分為3個階段［10］：

第一階段為中心碳代謝，生物體利用葡萄糖等碳源經(jīng)糖酵解途徑（Embden-Meyerhof-Parnas，EMP）生成丙酮酸（pyruvate）、乙酰輔酶A（acyl-CoA）等，它們作為萜類物質(zhì)合成的前體物流向甲羥戊酸途徑（mevalonate pathway， MVA）和甲基赤四醇4-磷酸途徑（methylerythritol phosphate，MEP）途徑。

MVA和MEP是蝦青素合成途徑中的第二階段（圖3）。MVA途徑不僅可以提供萜類合成所需要的前體物，而且還可以提供細(xì)胞生長必需物質(zhì)的前體物。其從乙酰輔酶A出發(fā)，經(jīng)6步酶促反應(yīng)生成異戊烯焦磷酸酯（isopentenylpyrophosphate，IPP），再通過異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶（isopentenyl diphosphate isomerase，IDI）將IPP異構(gòu)化成二甲基烯丙基焦磷酸酯（dimethylallylpyrophosphate，DMAPP），最后以IPP和DMAPP為前體合成萜類物質(zhì)的前體物。而MEP途徑是另一條合成天然萜類物質(zhì)的前體供應(yīng)途徑，廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物和藻類中。該途徑從丙酮酸出發(fā)，經(jīng)7步酶促反應(yīng)生成DMAPP，然后通過IDI將DMAPP異構(gòu)化成IPP，最后以IPP和DMAPP為前體合成萜類物質(zhì)的前體物。

圖3 微生物合成蝦青素的代謝途徑Fig. 3 Metabolic pathways for astaxanthin synthesis by microorganisms

第三階段為蝦青素合成階段，IPP和DMAPP在法尼基二磷酸合酶（fanicky diphosphate synthase）ispA的作用下生成香葉基焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphate，GPP）。GPP繼續(xù)在ispA的作用下生成法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP），F(xiàn)PP在香葉基香葉基二磷酸合酶（geranylgeranyl diphosphate synthase）CrtE的作用下生成香葉基二磷酸（geranylgeranyl diphosphate，GGPP），GGPP在八氫番茄紅素合酶/環(huán)化酶（phytoene synthase，lycopene cyclase）CrtYB和八氫番茄紅素去飽和酶（phytoene desaturase）CrtI的作用下生成番茄紅素，番茄紅素在CrtYB的作用下生成β-胡蘿卜素。β-胡蘿卜素與蝦青素的結(jié)構(gòu)差異在于碳鏈兩端環(huán)上的羥基與羰基的不同。因此，將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為蝦青素的過程就是在β-胡蘿卜素分子環(huán)上的兩端補(bǔ)充羥基與羰基的過程。但在不同生物體內(nèi)的合成路徑會有所差異，例如在泛菌中，主要通過β-胡蘿卜素酮醇酶（β-carotenoid ketolase）CrtW和β-胡蘿卜素羥化酶（β-carotene hydroxylase）CrtZ來合成蝦青素；在雨生紅球藻中，主要通過β-胡蘿卜素酮醇酶（β-carotenoid ketolase，BKT）和β-胡蘿卜素羥化酶（β-carotene hydroxylase）CrtR來合成蝦青素；在紅法夫酵母中，主要通過CrtR和CrtS來合成蝦青素；在其他一些工程酵母中，一般也都是通過表達(dá)β-胡蘿卜素酮醇酶和β-胡蘿卜素羥化酶來合成蝦青素；夏側(cè)金盞花是目前唯一可以生產(chǎn)蝦青素的植物，它通過表達(dá)類胡蘿卜素4-羥基-β-環(huán)-4-脫氫酶（carotenoids 4-hydroxyβ-cyclo-4-dehydrogenase，HBFD）和類胡蘿卜素-β-環(huán)-4-脫氫酶（carotenoids-β-cyclo-4-dehydrogenase，CBFD）來合成蝦青素。

2 蝦青素合成底盤細(xì)胞

目前，通過發(fā)酵過程調(diào)控和代謝工程改造菌種仍是常用的提高微生物合成蝦青素的策略。如：①通過發(fā)酵條件的優(yōu)化提高微生物蝦青素產(chǎn)量；②通過強(qiáng)化代謝路徑中的MVA和MEP來提高前體物質(zhì)的供應(yīng)量；③篩選表達(dá)不同來源的關(guān)鍵基因；④模塊化工程連接表達(dá)基因，增加其拷貝數(shù)；⑤定位不同亞細(xì)胞器等。

2.1 藻類

自然界中許多藻類都可以生產(chǎn)蝦青素，如雨生紅球藻、衣藻（Chlamydomonas）、傘藻（Acetabularia）、裸藻（Euglena）等［26］。雨生紅球藻是一種淡水單細(xì)胞綠藻，其蝦青素含量可達(dá)到細(xì)胞干重的5%，是蝦青素生產(chǎn)的主要藻類，同時通過雨生紅球藻生產(chǎn)的蝦青素是抗氧化能力最強(qiáng)的左旋（3S，3'S）構(gòu)型［27］。但是，雨生紅球藻的生長周期長、培養(yǎng)條件要求高、需要光照，且蝦青素存在于厚壁孢子中，提取率低、成本高、連續(xù)性差［19，28］。

雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的高昂成本限制了其大規(guī)模應(yīng)用，因此，迫切需要開發(fā)新的工藝，以實現(xiàn)通過降低生產(chǎn)成本和增加雨生紅球藻中蝦青素的含量來滿足商業(yè)化應(yīng)用的目的。雨生紅球藻的生長需要光，但由于光生物反應(yīng)器內(nèi)部的光強(qiáng)分布和混合不均，藻類會受到光暗周期的影響，從而影響到生物量以及次級代謝物的產(chǎn)生。Ranjbar等［29］設(shè)計出氣升式光生物反應(yīng)器，相較于傳統(tǒng)生物反應(yīng)器，其液體循環(huán)呈現(xiàn)出更規(guī)則的流型，從而使反應(yīng)器中光暗循環(huán)周期更穩(wěn)定、液體混合更均勻，增加次級代謝物的產(chǎn)生，明顯提升了雨生紅球藻中蝦青素的產(chǎn)量。

除上述策略以外，通過添加一些外源物質(zhì)也是提升蝦青素產(chǎn)量的可行方案。王想等［30］發(fā)現(xiàn)添加rac-GR24（一種合成的植物激素類似物）可有效增加雨生紅球藻產(chǎn)生的生物量以及蝦青素的積累量。rac-GR24能夠提高植物的光合作用和增加碳水化合物合成中CO2的利用率，從而增加生物量的積累。同時它還促進(jìn)NADPH和過氧化酶的過量生產(chǎn)，從而減輕活性氧造成的損害。此外，rac-GR24處理雨生紅球藻還改變了脂肪酸生物合成以及蝦青素酯化途徑的活性，從而使蝦青素的積累量增加。

由于藻類堅硬厚實的細(xì)胞壁增加了細(xì)胞的機(jī)械抗性和化學(xué)抗性，提取蝦青素是藻類生產(chǎn)蝦青素的最大挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的提取方法并不適用藻類蝦青素的提取，因此黃文燦等［31］提出了一種利用可切換親水性溶劑從雨生紅球藻中提取蝦青素的新方法。二甲氨基環(huán)己烷（DMCHA）作為一種可切換親水性溶劑，具有低揮發(fā)性和低溶解性。利用它，無需蒸餾，只需同時加入水和CO2，就可使雨生紅球藻中蝦青素的萃取率達(dá)87.2%。

雨生紅球藻富含天然蝦青素、不飽和脂肪酸等，具有很高的研究利用價值［32］。同時國內(nèi)外市場對天然蝦青素的需求量日益上漲，其開發(fā)潛力巨大。但仍存在幾個問題需探索解決：①雨生紅球藻合成蝦青素的中間代謝物轉(zhuǎn)化、關(guān)鍵酶的表達(dá)調(diào)控需要進(jìn)一步深入探索；②雨生紅球藻由于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜，導(dǎo)致提取收率低，未來仍需開發(fā)新的提取工藝以降低生產(chǎn)成本。

2.2 酵母

自然界中天然生產(chǎn)蝦青素的酵母主要有紅法夫酵母、黏紅酵母（Rhodotorula rubra）、海洋紅酵母（R. benthica）以及深紅酵母（R. glutinis）等。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，基于基因工程構(gòu)建的工程酵母也可以生產(chǎn)蝦青素，如解脂耶氏酵母、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）。相對于藻類等微生物而言，酵母生產(chǎn)蝦青素的底物來源廣泛、生長速度快、發(fā)酵周期短以及具有相對成熟的基因修飾工具。因此，酵母是目前蝦青素工業(yè)化生產(chǎn)的最有潛力的底盤細(xì)胞之一。

2.2.1 紅法夫酵母

紅法夫酵母被認(rèn)為是除雨生紅球藻外，自然界中最適合生產(chǎn)蝦青素的微生物［33-34］。其可利用多種糖作為碳源發(fā)酵合成蝦青素［35］，且細(xì)胞生長速度快，生長周期短，能夠?qū)崿F(xiàn)高密度培養(yǎng)，可顯著降低生產(chǎn)成本［34，36］。同時生產(chǎn)的蝦青素為右旋（3R，3'R）構(gòu)型，易被人體吸收。因此，紅法夫酵母成為合成蝦青素理想的底盤細(xì)胞之一。表1為紅法夫酵母產(chǎn)蝦青素的最新進(jìn)展。

表1 紅法夫酵母產(chǎn)蝦青素進(jìn)展Table 1 Progress in astaxanthin production by X. dendrorhous

發(fā)酵條件的優(yōu)化是最容易、最直接的提高蝦青素產(chǎn)量的方式。其中pH對紅法夫酵母的細(xì)胞生長和蝦青素積累均有影響。有研究表明，紅法夫酵母細(xì)胞生長的最適初始pH為6.0，蝦青素形成的最適pH為4.0，蝦青素積累的最適pH為5.0［37］。因此，通過利用變pH的調(diào)控策略，紅法夫酵母的蝦青素產(chǎn)量比恒定pH發(fā)酵提高了24.1%。蝦青素合成路徑復(fù)雜，需要多種不同的底物和前體物參與，所以發(fā)酵過程中某些物質(zhì)的添加也會促進(jìn)蝦青素的生物合成。例如，楊浩易等［42］以紅法夫酵母為底盤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)嘌呤、嘧啶、氨基酸合成和糖酵解途徑的下調(diào)均有助于蝦青素的生物合成，脂質(zhì)代謝途徑的上調(diào)有助于蝦青素的積累。原釩酸鈉的加入可抑制氨基酸代謝途徑，使蝦青素產(chǎn)量增加19.2%；褪黑素的加入可促進(jìn)脂質(zhì)代謝，使蝦青素產(chǎn)量增加30.3%。通過代謝通量分析，茹毅等［41］發(fā)現(xiàn)乙醇可以提高紅法夫酵母細(xì)胞代謝中丙酮酸、乙酰輔酶A的含量，使流向蝦青素合成途徑的通量提高2.3倍，進(jìn)而促進(jìn)蝦青素的合成。同時，對蝦青素合成途徑中α-酮戊二酸和5-磷酸核酮糖代謝節(jié)點進(jìn)行調(diào)控，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入0.5 g/L的α-酮戊二酸，可使紅法夫酵母細(xì)胞生長量提高0.4 g/L。在培養(yǎng)基中加入3 g/L谷氨酸，蝦青素的產(chǎn)量提高到67.9 mg/L，是對照組通量的1.7倍。

眾所周知，酵母具有很強(qiáng)的代謝能力，不僅可以利用單糖、二糖、多糖、有機(jī)酸等小分子物質(zhì)，還可以利用簡單的氮源以及復(fù)雜的有機(jī)混合物。使用工業(yè)廢料中的廉價底物可以有效降低蝦青素生產(chǎn)的成本，如甘蔗渣、甜高粱蔗渣（sweet sorghumbagasse，SSB）等。莊媛等［38］對紅法夫酵母菌株進(jìn)行了常溫及紫外線誘變研究，選育得到的突變株經(jīng)在22 ℃和220 r/min下發(fā)酵甘蔗渣水解液96 h后，類胡蘿卜素濃度達(dá)到88.57 mg/L；進(jìn)一步采用超聲波和纖維素酶破碎細(xì)胞壁后，蝦青素得率達(dá)96.01%。Stoklosa等［39］以甜高粱蔗渣為碳源培養(yǎng)紅法夫酵母生產(chǎn)蝦青素，但由于SSB中的酚類化合物對紅法夫酵母會產(chǎn)生抑制作用，于是通過活性炭和漆酶處理SSB來緩解其對紅法夫酵母的抑制作用，最終使菌體的細(xì)胞干重從15.6 g/L提高到23.6 g/L，蝦青素產(chǎn)量從9.55 mg/L提高到48.9 mg/L。

在合成生物學(xué)中，最常見的手段還是通過誘變以及代謝工程改造來提升目標(biāo)產(chǎn)物的含量。Gassel等［40］通過隨機(jī)誘變得到一株蝦青素含量高的紅法夫酵母，在其基礎(chǔ)上，通過表達(dá)番茄紅素環(huán)化酶基因crtYB以及蝦青素合成基因ASY，進(jìn)一步提高蝦青素合成的通量，最后通過發(fā)酵罐放大實驗，蝦青素最大含量達(dá)到9.7 mg/g DCW。另外一項研究中指出，麥角甾醇的合成途徑會反饋抑制MVA途徑。因此，通過刪除參與麥角甾醇合成的基因來改善萜類物質(zhì)生產(chǎn)是一個有效的策略。Yomamoto等［43］依次刪除編碼與麥角甾醇生物合成相關(guān)的C-22甾醇去飽和酶的雙CYP61基因后，通過發(fā)酵驗證，重組紅發(fā)夫酵母的蝦青素產(chǎn)量提高了1.4倍。

雖然紅法夫酵母是天然生產(chǎn)蝦青素的底盤細(xì)胞之一，但野生型紅法夫酵母產(chǎn)量低，且容易退化，實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)仍存在一定的挑戰(zhàn)。因此選育蝦青素高產(chǎn)菌株就成了目前研究的首要目標(biāo)。未來，通過誘變選育高產(chǎn)菌株、代謝工程改造，并結(jié)合培養(yǎng)基配方優(yōu)化、發(fā)酵條件優(yōu)化可進(jìn)一步提高蝦青素產(chǎn)量。

2.2.2 釀酒酵母

釀酒酵母是第一個進(jìn)行全基因組測序的真核微生物，其遺傳操作簡便、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理清楚且高密度發(fā)酵技術(shù)成熟，特別是近年來一系列適用于釀酒酵母途徑組裝工具的開發(fā)，使得釀酒酵母成為合成生物學(xué)研究的理想底盤細(xì)胞［44］。但是和許多工程酵母一樣，野生型釀酒酵母不能合成蝦青素，需要通過基因工程改造，引入蝦青素合成的關(guān)鍵基因，才能實現(xiàn)蝦青素的合成，且合成的蝦青素多為左旋（3S，3'S）構(gòu)型。表2為釀酒酵母產(chǎn)蝦青素的最新進(jìn)展。

表2 釀酒酵母產(chǎn)蝦青素進(jìn)展Table 2 Progress in astaxanthin production by S. cerevisiae

不同物種的crtZ和crtW對釀酒酵母合成蝦青素有顯著的影響，因此外源合成蝦青素基因和底盤細(xì)胞的匹配性尤為重要。王瑞兆等［45］對不同物種的crtZ和crtW在釀酒酵母進(jìn)行組合表達(dá)，從30個組合中選擇了來自泡囊短波單胞菌（Brevundimonas vesicularis）的crtW和來自產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes）的crtZ，得到的工程菌株SyBESc118076中蝦青素產(chǎn)量高達(dá)81.0 mg/L。篩選關(guān)鍵基因的突變體也是提高蝦青素產(chǎn)量的有效方法。例如，融合酶的構(gòu)建可有效降低中間代謝物積累，在利用linker將crtW和crtZ融合的基礎(chǔ)上，通過定向進(jìn)化獲得9個蝦青素產(chǎn)量提高的融合突變體。組合這些顯性突變體得到了高產(chǎn)蝦青素的釀酒酵母菌株L95S+1206L，其蝦青素含量是對照菌株的3.8倍［49-50］。為提高β-胡蘿卜素向蝦青素轉(zhuǎn)化的效率，周萍萍等［46］通過定向協(xié)同進(jìn)化獲得crtZ和crtW的釀酒酵母優(yōu)越突變體，同時引入基于Gal4M9的溫度響應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)［51］，將蝦青素的合成與細(xì)胞生長進(jìn)行解耦，即：第一階段的溫度保持在30 ℃，使細(xì)胞快速生長；當(dāng)細(xì)胞生長進(jìn)入對數(shù)中期，將培養(yǎng)溫度改變?yōu)?4 ℃，促進(jìn)蝦青素的合成；最后，通過兩階段高密度發(fā)酵合成了235 mg/L的蝦青素。

由于蝦青素是脂溶性的，這恰恰與釀酒酵母等模式微生物對脂類的有限儲存能力相沖突［52］，因此可以通過促進(jìn)脂質(zhì)合成來擴(kuò)大脂滴，為蝦青素的合成提供更多的儲存空間，以提高蝦青素的含量。于是李明等利用三功能CRISPR系統(tǒng)篩選了與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因文庫［47，53］，通過適度上調(diào)opi3和hrd1的表達(dá)水平來促進(jìn)脂質(zhì)的合成，在平衡crtZ和crtW的表達(dá)后，使蝦青素含量提高到10.21 mg/g DCW。最后，通過脂質(zhì)合成的空間調(diào)控和溫度響應(yīng)的時間調(diào)控相結(jié)合，在補(bǔ)料分批發(fā)酵中合成了446.4 mg/L蝦青素。

2.2.3 解脂耶氏酵母

解脂耶氏酵母是目前研究最多、應(yīng)用最廣泛的非常規(guī)酵母之一，通過解脂耶氏酵母生產(chǎn)的蝦青素多為左旋（3S，3'S）構(gòu)型。與常規(guī)酵母釀酒酵母相比，解脂耶氏酵母具有多種獨特的生化和代謝特征。它是典型的二型性酵母，其作為一種好氧菌，基本不產(chǎn)生對細(xì)胞有毒害作用的乙醇［54］；且胞內(nèi)具有高效的乙酰輔酶A代謝通路和較高的三羧酸循環(huán)通量，脂質(zhì)的積累量可達(dá)77%，這使其成為有機(jī)酸、脂質(zhì)及其衍生物工業(yè)生產(chǎn)的理想選擇［55-57］。此外，解脂耶氏酵母可以在較低pH值和較高的滲透壓條件下生長，并且可以利用多種碳源、蛋白質(zhì)和疏水性底物，如糖類、烴類、醇類、脂類等，因此其對生長環(huán)境要求不嚴(yán)格，可在各種環(huán)境條件下生長，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景［58］。表3為解脂耶氏酵母產(chǎn)蝦青素的最新進(jìn)展。

表3 解脂耶氏酵母產(chǎn)蝦青素進(jìn)展Table 3 Progress in astaxanthin production by Y. lipolytica

不同來源的蝦青素合成基因依然是影響解脂耶氏酵母中蝦青素產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。Kildegaard等［59］在一株高產(chǎn)β-胡蘿卜素的解脂耶氏酵母菌株基礎(chǔ)上，表達(dá)來自副球菌（Paracoccussp. N81106）的crtW和來自泛菌（P. ananatis）的crtZ，同時對相關(guān)基因的拷貝數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到了3.5 mg/g DCW（54.6 mg/L）的蝦青素；另一項研究表達(dá)3對不同來源的crtW和crtZ，指出來自雨生紅球藻的HpCrtW和HpCrtZ轉(zhuǎn)化β-胡蘿卜素為蝦青素的活性最強(qiáng)［65］。通過對RIAD-RIDD短肽對相關(guān)基因進(jìn)行模塊化組裝［62］，同時增加拷貝數(shù)到20后，在補(bǔ)料分批培養(yǎng)條件下，重組解脂耶氏酵母的蝦青素產(chǎn)量達(dá)3.3 g/L，是迄今為止在微生物底盤中合成蝦青素的最高水平。

在微生物中生產(chǎn)高附加值化學(xué)品的代謝調(diào)控手段大多是使用細(xì)胞質(zhì)作為反應(yīng)容器［66］，然而，酶和底物的隔離以及代謝串?dāng)_經(jīng)常阻礙細(xì)胞質(zhì)中目標(biāo)化合物的有效合成。真核細(xì)胞中細(xì)胞器的區(qū)域化為打破這一瓶頸提供了解決思路。例如，馬勇爍等［60］通過將蝦青素合成途徑定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與過氧化物酶體，不僅加速了β-胡蘿卜素向蝦青素的轉(zhuǎn)化，同時顯著減少了類胡蘿卜素中間體的積累，使蝦青素產(chǎn)量提高141倍，在補(bǔ)料分批發(fā)酵中可合成858 mg/L的蝦青素。

蝦青素是一種脂溶性的萜類化合物，其強(qiáng)疏水性導(dǎo)致生物利用度較低。通過加入外源油相可以促進(jìn)蝦青素的溶解并防止晶體的形成，以此來增加蝦青素的產(chǎn)量。Yuzbasheva等［61］通過模塊化工程途徑和兩種關(guān)鍵酶的融合技術(shù)，構(gòu)建了一株蝦青素產(chǎn)量為587.3 mg/L的重組解脂耶氏酵母菌株，在添加油覆蓋層的情況下，蝦青素產(chǎn)量可提高到973.4 mg/L。糖基化也可以顯著增加蝦青素的水溶性，從而提高其生物利用度、光穩(wěn)定性和生物活性［67-68］。陳靖等［63］通過在解脂耶氏酵母中表達(dá)來自夏側(cè)金盞花的類胡蘿卜素4-羥基-β-環(huán)-4-脫氫酶（HBFD）和類胡蘿卜素-β-環(huán)4-脫氫酶（CBFD）基因，構(gòu)建了一株植物來源的蝦青素合成菌株，蝦青素產(chǎn)量達(dá)到3.46 mg/L。在此基礎(chǔ)上，通過表達(dá)來自菠蘿泛菌（P. ananatisATCC 19321）的玉米黃素糖基化酶（CrtX）基因，成功構(gòu)建了糖基化蝦青素合成途徑，其產(chǎn)量達(dá)到1.47 mg/L，是迄今為止報道的微生物生產(chǎn)糖基化蝦青素的最高產(chǎn)量。

2.2.4 馬克斯克魯維酵母

近年來，馬克斯克魯維酵母廣泛用于天然產(chǎn)物的合成。相比于其他傳統(tǒng)酵母，其擁有以下幾個優(yōu)勢：馬克斯克魯維酵母可以通過提供過量碳源提高菌體產(chǎn)量［69］；一些馬克斯克魯維酵母耐高溫，能在25～52 ℃的溫度下發(fā)酵［70］；具有適當(dāng)?shù)奶腔洼^強(qiáng)的信號肽，與釀酒酵母相比具有較高的分泌能力［71］。

目前，基于代謝工程手段，馬克斯克魯維酵母已被用作底盤細(xì)胞合成蝦青素，且合成的蝦青素多為左旋（3S，3'S）構(gòu)型。例如，林語聚等［72］通過在馬克斯克魯維酵母中構(gòu)建蝦青素異源合成路徑，實現(xiàn)了利用葡萄糖合成蝦青素。他們將來自雨生紅球藻的Hpchyb和bkt基因整合到馬克斯克魯維酵母的基因組上，并增加其拷貝數(shù)，獲得4株改造菌。為了進(jìn)一步提高產(chǎn)量，對Hpchyb基因進(jìn)行了定點突變，以提高酶效率和防止泛素化引起的異源蛋白降解，最終實現(xiàn)了在5 L發(fā)酵罐中合成9972 μg/g DCW蝦青素。另外一項研究中，通過使用木糖誘導(dǎo)型啟動子和溫度調(diào)控系統(tǒng)，可實現(xiàn)將細(xì)胞生長與產(chǎn)物合成解耦；進(jìn)一步通過對代謝路徑以及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，蝦青素產(chǎn)量達(dá)到56.8 mg/L［73］。雖然有關(guān)馬克斯克魯維酵母用作底盤細(xì)胞生產(chǎn)蝦青素的報道較少，但其擁有的獨特優(yōu)勢，為微生物發(fā)酵合成蝦青素提供了新的技術(shù)選擇。

2.2.5 其他酵母

除上述典型的工程酵母外，還有一些報道相對較少的生產(chǎn)蝦青素的酵母，如黏紅酵母、海洋紅酵母等。黏紅酵母作為一種含油脂的紅酵母，主要用于生產(chǎn)β-胡蘿卜素。有團(tuán)隊通過誘變篩選獲得一株產(chǎn)蝦青素的黏紅酵母RG-31，最后通過優(yōu)化發(fā)酵條件，蝦青素含量達(dá)到7.41 μg/mL。海洋紅酵母是海洋中自然存在的一種單細(xì)胞酵母，有較好的耐鹽性，生產(chǎn)以蝦青素為主的類胡蘿卜素。一株高產(chǎn)類胡蘿卜素的海洋深紅酵母菌株S8，通過紫外誘變獲得菌株ST5，并通過發(fā)酵條件優(yōu)化，蝦青素含量可達(dá)520 μg/g。

2.3 細(xì)菌

由于細(xì)菌合成蝦青素的產(chǎn)量較低，因此國內(nèi)外研究蝦青素主要集中在藻類和真菌，對細(xì)菌合成蝦青素的研究相對較少。盡管大多數(shù)細(xì)菌的蝦青素含量遠(yuǎn)低于一些藻類及真菌，但通過在細(xì)菌中引入合成蝦青素的相關(guān)基因［20］，可以極大地提升蝦青素的產(chǎn)量。同時相比于真菌和藻類，利用細(xì)菌發(fā)酵更容易提取蝦青素，可大大簡化后續(xù)的提取工藝。尤其是革蘭氏陰性細(xì)菌，細(xì)胞壁薄易破碎，方便提取胞內(nèi)的蝦青素。因此，通過細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素，可以大幅度降低蝦青素的生產(chǎn)成本，對未來的工業(yè)化生產(chǎn)有重要意義。

2.3.1 大腸桿菌

大腸桿菌是一種革蘭氏陰性、兼性厭氧細(xì)菌，培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉，且分子遺傳改造工具成熟，已成為代謝工程和合成生物學(xué)的最佳宿主之一。它作為一種非類胡蘿卜素產(chǎn)生菌株，能夠通過MEP途徑合成萜類化合物的前體IPP和DMAPP。在野生型的大腸桿菌中，其體內(nèi)能夠生成FPP合成酶，這種酶可以將IPP和DMAPP進(jìn)行縮合反應(yīng)，生成GPP和FPP，但缺乏將FPP轉(zhuǎn)化為最終蝦青素的酶類。因此通過向大腸桿菌引入外源的蝦青素合成模塊，就能較容易實現(xiàn)大腸桿菌合成蝦青素，且合成的蝦青素多為左旋（3S，3'S）構(gòu)型。表4為大腸桿菌產(chǎn)蝦青素的最新進(jìn)展。

表4 大腸桿菌產(chǎn)蝦青素進(jìn)展Table 4 Progress in astaxanthin production by E. coli

蝦青素代謝合成途徑中關(guān)鍵基因的確定，為構(gòu)建蝦青素高產(chǎn)工程菌提供了可能。Jeong等［75］利用來自庫克菌（Kocuria gwangallensis）MEP途徑的dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH和idi和轉(zhuǎn)化蝦青素合成的相關(guān)基因（crtI、crtE、crtYB、crtW、crtZ）在大腸桿菌中進(jìn)行共表達(dá)以增加蝦青素的產(chǎn)量。這種含有非甲羥戊酸途徑基因的工程大腸桿菌能夠合成1100 μg/g DCW的蝦青素。類異戊二烯途徑中l(wèi)ytB、ispA和idi基因?qū)PP、DMAPP、FPP的合成必不可少，但由于大腸桿菌本身合成的這些前體物僅能滿足自身生長，無法流向蝦青素合成路徑，所以造成蝦青素產(chǎn)量過低。因此Lee等［76］在攜帶蝦青素合成基因（crtI、crtE、crtYB、crtW、crtZ）的大腸桿菌中過表達(dá)lytB、ispA和idi，最終工程大腸桿菌合成1200 μg/g DCW的蝦青素。篩選不同來源的crtW和crtZ依然是提升蝦青素產(chǎn)量的常規(guī)方案之一。例如，魯騫等［78］通過比較不同來源crtW和crtZ，認(rèn)為來自短波單胞菌（Brevundimonassp. SD212）的crtW和來自泛菌的crtZ是生產(chǎn)蝦青素的最佳組合。通過平衡crtW和crtZ的表達(dá)活性后，構(gòu)建了一株既不攜帶質(zhì)粒也不攜帶抗生素標(biāo)記的大腸桿菌ASTA-1，在不添加誘導(dǎo)劑的情況下，重組菌株合成的蝦青素占類胡蘿卜素含量的96.6%，其含量達(dá)7.4 mg/g DCW。而吳元慶等［79］篩選9個不同來源的crtZ和crtW，并分別將其導(dǎo)入到高產(chǎn)β-胡蘿卜素的工程大腸桿菌中，其蝦青素含量達(dá)0.49～8.07 mg/L。隨后，利用優(yōu)化的肽連接物將crtZ與crtW進(jìn)行融合，進(jìn)一步增加了蝦青素的產(chǎn)量，使蝦青素產(chǎn)量增加了127.6%。李順等［80］通過選用GadE啟動子在大腸桿菌表達(dá)來自雨生紅球藻的HpCHY基因和來自萊茵衣藻（Chlamydomonas）的CrBKT基因，最終工程菌株能夠合成24.16 mg/L蝦青素，比原始菌株增加了40倍。由此可見，選取合適的蝦青素合成基因元件，會顯著影響蝦青素的表達(dá)含量。

增加關(guān)鍵基因的拷貝數(shù)是一種提升蝦青素產(chǎn)量的簡單、直接和有效的方式。例如，在大腸桿菌中，通過增加crtYB的拷貝數(shù)消除蝦青素積累不足的瓶頸，同時通過調(diào)節(jié)操縱子的表達(dá)，最終在補(bǔ)料分批發(fā)酵條件下，蝦青素的產(chǎn)量達(dá)到1.18 g/L［20］。李迪等［82］首先對crtW進(jìn)行隨機(jī)突變以提高其從β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為蝦青素的活性，再通過Cre-loxP的方法增加crtW和crtZ的拷貝數(shù)，構(gòu)建出一株高產(chǎn)蝦青素的大腸桿菌，最后通過補(bǔ)料分批發(fā)酵，蝦青素產(chǎn)量達(dá)到0.88 g/L［84］。張夢等［83］發(fā)現(xiàn)來自馬氏副球菌（Paracoccussp.PC1）的crtZ和來自泛菌的crtZ共表達(dá)可以提高蝦青素以及中間體的積累量，最終構(gòu)建具有兩個拷貝數(shù)的PAcrtZ和一個拷貝數(shù)的PCcrtZ工程大腸桿菌菌株，經(jīng)過70 h的補(bǔ)料分批發(fā)酵，蝦青素產(chǎn)量達(dá)到1.82 g/L。

此外，也可通過非常規(guī)技術(shù)手段來提升蝦青素代謝通路的策略，從而達(dá)到提高蝦青素產(chǎn)量的目標(biāo)。例如，通過在表達(dá)蝦青素合成基因（crtI、crtE、crtYB、crtW、crtZ）的大腸桿菌中共表達(dá)伴侶基因ApcpnA和ApcpnB，最終工程菌能夠生產(chǎn)890 μg/g DCW的蝦青素［74］。Lemuth等［77］構(gòu)建了第一個無質(zhì)粒的大腸桿菌，通過γ-Red重組技術(shù)將蝦青素生物合成途徑的基因穩(wěn)定整合到大腸桿菌染色體中，使該通路只指向蝦青素合成。最終蝦青素的含量達(dá)1.4 mg/g DCW［85］?；谛螒B(tài)學(xué)和氧化應(yīng)激工程也是提高大腸桿菌蝦青素合成的有效策略。如刪除與形態(tài)、膜相關(guān)的基因，可以獲得更大、更長的細(xì)胞，從而增加蝦青素的積累。氧化應(yīng)激是指細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生與抗氧化之間存在不平衡，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。因此刪除氧化應(yīng)激相關(guān)基因能夠增加細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的［81］。同時溫度升高后，細(xì)胞形態(tài)依然會發(fā)生變化，活性氧水平也將更高，所以通過建立溫度敏感質(zhì)粒的互補(bǔ)表達(dá)系統(tǒng)，最終能使這株大腸桿菌的蝦青素含量提高至11.92 mg/g DCW。此外，酶定位策略也可以用來提升工程大腸桿菌中蝦青素的產(chǎn)量。例如，葉麗君等［86-88］利用大腸桿菌定位標(biāo)簽將β-胡蘿卜素裂解雙加氧酶PhCCD1定位到不同的細(xì)胞室，發(fā)現(xiàn)其催化效率的最佳位置是在膜上，最終將CrtW和CrtZ通過GlpF蛋白融合定位到大腸桿菌細(xì)胞膜上后，蝦青素產(chǎn)量增加了215.4%。

2.3.2 副球菌

副球菌（Paracoccussp.）是一種好氧、革蘭氏陰性菌，其胞內(nèi)含有蝦青素以及其他稀有的類胡蘿卜素，然而關(guān)于副球菌合成蝦青素的研究論文還很少［89-90］。天然類胡蘿卜素通常以E構(gòu)型存在，人和動物對其利用率較低，而“Z-異構(gòu)化”是提高其生物利用率的有效手段［91-93］。例如，Honda等［94］以副球菌為底盤細(xì)胞，在亞臨界水條件下（將水加熱至沸點以上，臨界點以下，并控制系統(tǒng)壓力使水保持為液態(tài)）異構(gòu)化蝦青素等類胡蘿卜素，發(fā)現(xiàn)在加溫加壓條件下添加乙醇，“Z-異構(gòu)化”的效率明顯提升，最后，通過30 min的亞臨界水處理，在抑制胡蘿卜素降解的同時，獲得了“Z-異構(gòu)化”比例50%以上的蝦青素。

適當(dāng)調(diào)控培養(yǎng)基的組分以及發(fā)酵過程中的參數(shù)是提高蝦青素產(chǎn)量的有效策略。在培養(yǎng)基中添加三羧酸中間體可增強(qiáng)前體供應(yīng)量；還可通過添加蝦青素合成關(guān)鍵酶的輔因子（硫酸亞鐵、抗壞血酸、NADPH、ATP和2-氧戊二酸）以提升關(guān)鍵酶的活性，從而提高蝦青素的積累。如在以副球菌為底盤細(xì)胞生產(chǎn)蝦青素時，通過添加5 mmol/L的蘋果酸鹽和1 mmol/L的硫酸亞鐵，可以提高Crt酶的活性，使蝦青素的產(chǎn)量從177 μg/L增加到3750 μg/L［95］。雖然細(xì)菌自身合成蝦青素與藻類和酵母相比產(chǎn)量較低，但這為后續(xù)的工程菌株的構(gòu)建、改造提供了可供選擇的基因元件。

2.3.3 其他細(xì)菌

能夠生產(chǎn)蝦青素的細(xì)菌相對較少，且產(chǎn)量相對較低，研究最多的就是大腸桿菌作為底盤細(xì)胞。除此以外，如乳酸分枝桿菌（Mycobacterium lacticola）和短桿菌（Bevibacterium）也都可以生產(chǎn)蝦青素。但乳酸分支桿菌只在烴類培養(yǎng)基上生產(chǎn)蝦青素，在營養(yǎng)培養(yǎng)基上并不生產(chǎn)蝦青素。而短桿菌在石油里生長，發(fā)酵結(jié)束，菌體生物量僅有3 g/L，蝦青素含量則更低。

綜上所述，大腸桿菌是目前細(xì)菌中生產(chǎn)蝦青素的理想底盤細(xì)胞。

3 蝦青素的提取工藝

蝦青素是胞內(nèi)產(chǎn)物，因此從微生物中提取蝦青素分為兩個步驟：細(xì)胞的破壞和蝦青素的收集。相較于細(xì)菌，藻類和酵母的細(xì)胞壁堅韌且厚實，不易破碎，給產(chǎn)物的提取帶來了很大的困難。因此蝦青素的提取重點在于細(xì)胞的破壁處理［96］。

傳統(tǒng)的破壁處理方法主要有物理法、化學(xué)法、酶法等［97］。物理處理方法有機(jī)械破碎、超聲波破碎和超臨界流體萃取等。機(jī)械破碎操作簡單，通過機(jī)械攪拌將細(xì)胞壁撕裂，從而釋放細(xì)胞內(nèi)的蝦青素。但是機(jī)械破碎可能會引起部分位置溫度過高，從而對蝦青素造成一定的破壞；超聲波破碎雖可以有效破除溶質(zhì)中的細(xì)胞壁，但隨著超聲波作用強(qiáng)度以及作用時間的增加，產(chǎn)生的強(qiáng)氧化性自由基增多，從而導(dǎo)致蝦青素的提取率下降，并且其還會產(chǎn)生一定的噪聲污染［98］。超臨界流體萃取是近年來各類藻產(chǎn)品提取中最有效的萃取方法，與傳統(tǒng)液體溶劑相比，其具有一些專有的物理化學(xué)特性，如高擴(kuò)散率、高壓縮性、低表面張力、低黏度，易穿透細(xì)胞壁，提高產(chǎn)品提取效率。

化學(xué)法主要包括有機(jī)溶劑萃取法、酸堿處理法、二甲基亞砜法等。蝦青素為脂溶性天然產(chǎn)物，因此有機(jī)溶劑的選擇要考慮到蝦青素是否可溶以及溶劑的極性。例如，邢濤等［99］以乙酸乙酯作為有機(jī)溶劑，從雨生紅球藻中提取蝦青素，最終其得率為98.51%。雖然利用有機(jī)溶劑提取蝦青素得率較高，但不足之處是許多溶劑具有毒性，可能對蝦青素產(chǎn)生破壞作用。酸堿處理法破壁會用到大量的酸堿試劑，不僅可能會造成對蝦青素的破壞，還會對環(huán)境造成相應(yīng)的污染。二甲基亞砜作為一種既溶于水又溶于有機(jī)溶劑的極性溶劑，成為實驗室常用的破壁溶劑，能夠快速高效地破碎菌體的細(xì)胞壁，并且不會對蝦青素造成太大的影響［100］，同時與丙酮以合適的比例混合，能夠較為完全地提取蝦青素［101］。

酶法提取蝦青素具有條件溫和、能耗小、耗時短等優(yōu)點，它不僅可以快速高效地破除細(xì)胞壁，將胞內(nèi)蝦青素釋放出來，而且可以抑制細(xì)胞的活性，從而防止胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)生變性［102］。因此酶法提取的蝦青素相比于其他方法獲得的蝦青素更加穩(wěn)定。例如，β-葡聚糖酶能夠水解細(xì)胞壁中的β-葡聚糖，可以避免蝦青素溢出菌體減少損失［100］。但酶法需要大量的酶，這無疑增加了生產(chǎn)成本，同時由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，易發(fā)生變性，因此并不適用于大規(guī)模蝦青素提取處理。

由于蝦青素是一種強(qiáng)抗氧化劑，如果長期暴露在空氣中，空氣中的氧氣會與蝦青素發(fā)生氧化反應(yīng)，使其失去抗氧化能力。因此無氧（充氮）提取工藝也是目前工業(yè)生產(chǎn)上不可獲取的步驟之一。該方法就是通過采用惰性氣體或氮氣填充，為有機(jī)溶劑萃取提供一個無氧環(huán)境，用以保護(hù)其活性，使蝦青素的抗氧化活性顯著提高。

4 總結(jié)與展望

由于蝦青素在食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，市場對蝦青素的需求將可預(yù)見地增加。目前，化學(xué)合成法仍是蝦青素生產(chǎn)的主要途徑，但由于化學(xué)合成蝦青素的局限性，世界各國對化學(xué)法合成蝦青素的管理越來越嚴(yán)格。然而直接從自然資源中提取的蝦青素遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足消費者的需求。因此，通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素為蝦青素的工業(yè)化生產(chǎn)提供了有前景的選擇。酵母由于底物譜寬、易于生長培養(yǎng)、發(fā)酵周期短以及具有相對成熟的基因修飾工具等優(yōu)點，是最具發(fā)展?jié)摿Φ牡妆P細(xì)胞。其中，紅法夫酵母能夠天然生產(chǎn)蝦青素，生長速度快，可以利用多種碳源；解脂耶氏酵母具有較高的乙酰輔酶A通量以及三羧酸循環(huán)代謝通路，能夠在較低pH和較高的滲透壓下生長；釀酒酵母遺傳操作簡便、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理清楚且高密度發(fā)酵技術(shù)成熟；馬克斯克魯維酵母能夠耐高溫，具有適當(dāng)?shù)奶腔洼^強(qiáng)的信號肽。

隨著合成生物學(xué)、蛋白質(zhì)工程、代謝工程和發(fā)酵工程的快速發(fā)展，許多微生物已被用作底盤細(xì)胞來生產(chǎn)蝦青素。但盡管蝦青素的生物合成已經(jīng)取得了重大突破，卻仍存在挑戰(zhàn)：

第一，能夠天然生產(chǎn)蝦青素的微生物，如紅法夫酵母、雨生紅球藻依然存在產(chǎn)量低、培養(yǎng)條件嚴(yán)格、成本高等問題。為了解決這個問題，今后的研究方向應(yīng)集中在高產(chǎn)菌株的培育和篩選、培養(yǎng)條件的優(yōu)化上，以提高產(chǎn)量、降低成本。

第二，由于蝦青素合成代謝通路復(fù)雜，因此通過代謝工程改造模式生物如大腸桿菌、解脂耶氏酵母、釀酒酵母等依然存在產(chǎn)量低等問題。對此，可通過如下策略提高底盤細(xì)胞合成蝦青素的效率（圖4）：①對MVA代謝途徑進(jìn)行優(yōu)化改造，如截短的tHMG（在N端截短500個氨基酸）被證明是MVA途徑的關(guān)鍵基因，它可以有效地防止自身被降解，從而增加類胡蘿卜素的產(chǎn)量；②更換不同強(qiáng)度的啟動子，提高代謝路徑中的催化匹配性，如在β-胡蘿卜素生物合成的基因中，強(qiáng)啟動子PTEF取代其他弱啟動子顯著提高了解脂耶氏酵母中β-胡蘿卜素的產(chǎn)量［103］；③增加關(guān)鍵基因的拷貝數(shù)，提高限速步驟的代謝通量，如當(dāng)crtYB的拷貝數(shù)從1增加到4的時候，β-胡蘿卜素產(chǎn)量增加了76%［104］；④使用不同的連接子或者短肽，對關(guān)鍵基因進(jìn)行模塊化組裝，提高碳代謝通量，以此來提高蝦青素的效價；⑤定位于不同的亞細(xì)胞器中，提高蝦青素的儲存空間，類胡蘿卜素一般儲存在細(xì)胞膜中，會降低細(xì)胞膜的流動性，造成細(xì)胞的死亡，將類胡蘿卜素的代謝路徑定位于亞細(xì)胞器中，可以減少代謝紊亂，同時也可以擴(kuò)大類胡蘿卜素在細(xì)胞內(nèi)的儲存空間，減少其對細(xì)胞的毒性，如真核細(xì)胞中高爾基體、線粒體、過氧化物酶體具有獨特的物理環(huán)境，可為類胡蘿卜素的合成提供有利的條件；⑥發(fā)酵條件優(yōu)化是最常規(guī)也是最有效提升蝦青素產(chǎn)量的方式，例如，培養(yǎng)基中不同的碳源氮源、不同的碳氮比、pH值的優(yōu)化、溫度的調(diào)控等。

圖4 蝦青素產(chǎn)量提高策略Fig. 4 Strategies for increasing astaxanthin production

同時值得我們關(guān)注的是，即使通過生物合成的蝦青素應(yīng)用價值遠(yuǎn)超過化學(xué)法合成的，但其應(yīng)用還是受到許多國家的法律法規(guī)所限制。如蝦青素長時間加熱會產(chǎn)生致癌物質(zhì)，美國FDA禁止蝦青素用作食品添加劑；法國明確規(guī)定蝦青素只能用于特定的保健品和化妝品中。因此，通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素還有很長一段路要走。