酶催化雜Diels-Alder反應(yīng)

王翠珍，陳窕，王健博，2

（1 湖南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，化學(xué)生物學(xué)及中藥分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，植化單體開(kāi)發(fā)與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410081； 2 浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥物生物技術(shù)研究所，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院綜合ICU科室，浙江 杭州 310030）

［4+2］Diels-Alder（DA）環(huán)加成反應(yīng)是合成復(fù)雜天然產(chǎn)物的最有效的合成策略之一，而神奇之處在于，許多復(fù)雜結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物生物合成也包含了這一策略的應(yīng)用［1-2］。DA反應(yīng)是通過(guò)具有共軛結(jié)構(gòu)的雙烯體和提供不飽和鍵的親雙烯體發(fā)生反應(yīng)，從而生產(chǎn)六元環(huán)己烯。該反應(yīng)一次可以產(chǎn)生兩個(gè)碳碳鍵，且在烯烴末端均有取代時(shí)，會(huì)新建四個(gè)相鄰的手性中心，是一種構(gòu)筑C—C鍵的有效方法，因此被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜多環(huán)天然產(chǎn)物的全合成中［3-4］。DA反應(yīng)自1928年Otto Diels和Kurt Alder發(fā)現(xiàn)以來(lái)，在近百年的時(shí)間里不斷發(fā)展，現(xiàn)已成為有機(jī)合成的有力工具，且依舊是化學(xué)家關(guān)注的熱點(diǎn)反應(yīng)［5-6］。有關(guān)催化DA反應(yīng)的報(bào)道不勝枚舉，主要催化劑包括Lewis酸［7］、絡(luò)合催化劑［8］、有機(jī)催化劑［9］等非酶催化劑，而在生物催化領(lǐng)域，這一類催化報(bào)道還相對(duì)較少，早期的催化劑主要包括抗體［10］和RNA［11］。天然酶催化DA反應(yīng)的報(bào)道始于2011年［12］，隨后陸續(xù)也有其他新型DA酶被發(fā)現(xiàn)，多數(shù)酶類存在于天然產(chǎn)物的生物合成途徑中，有關(guān)人工設(shè)計(jì)催化DA反應(yīng)的酶也有報(bào)道。生物催化所具有的條件溫和以及高選擇性的優(yōu)點(diǎn)，迅速引起大家對(duì)這個(gè)領(lǐng)域探索的興趣［13-16］。

雜原子參與的DA反應(yīng)稱為Hetero-Diels-Alder（HDA）反應(yīng)，是由雜雙烯體和親雙烯體，或者是雙烯體和雜親雙烯體進(jìn)行DA反應(yīng)得到六元雜環(huán)的反應(yīng)［17］。按雜原子的不同，HDA反應(yīng)可以分為氧雜［18-19］、氮雜［20-21］、硫雜［22］和磷雜［23-24］DA反應(yīng)等，其中最常見(jiàn)的是氧雜DA反應(yīng)和氮雜DA反應(yīng)［25］。與經(jīng)典DA反應(yīng)相比，已知HDA加合物的生物催化方法報(bào)道相對(duì)較少［26］。HDA反應(yīng)在合成各種雜環(huán)天然產(chǎn)物中發(fā)揮了重要作用，因此也成為構(gòu)建復(fù)雜雜環(huán)化合物的有力工具。其中利用HDA合成天然活性產(chǎn)物的經(jīng)典合成例子包括Leporin B（1）［27］、Leporin C（2）［28］等含有吡喃環(huán)的氧雜HDA產(chǎn)物（圖1），以及（+）-Malbrancheamide（17）、（+）-Premalbrancheamide（18）［29］等含有雙環(huán)［2.2.2］重氮辛烷的氮雜DA產(chǎn)物的合成（圖2）。本綜述主要對(duì)已報(bào)道的酶催化氧雜DA反應(yīng)和氮雜DA反應(yīng)進(jìn)行歸類整理，概述了HDA反應(yīng)的研究進(jìn)展，希望通過(guò)對(duì)合成途徑以及催化機(jī)理的總結(jié)分析，促進(jìn)該類生物催化劑的發(fā)展與應(yīng)用。

圖1 吡喃類化合物Fig. 1 Pyran compounds

圖2 含有雙環(huán)［2.2.2］重氮辛烷的產(chǎn)物Fig. 2 Products containing bicyclo[2.2.2]diazaoctane rings

1 Diels-Alder反應(yīng)的分類

DA反應(yīng)可分為正電子需求反應(yīng)和逆電子需求反應(yīng)，雙烯體通常是富電子的，而親雙烯體通常是缺電子的，它們之間的反應(yīng)稱為正常的正電子需求DA反應(yīng)。當(dāng)雙烯體缺電子而親雙烯體富電子的時(shí)候，就會(huì)發(fā)生逆電子需求DA（IEDDA）反應(yīng)［30-31］?？梢岳们熬€軌道理論（FMO）來(lái)理解DA反應(yīng)，其快速反應(yīng)動(dòng)力學(xué)主要由于雙烯體的最高占有分子軌道（HOMO）和親雙烯體的最低未占有分子軌道（LUMO）之間的低能隙［32］。正常的［4+2］環(huán)加成被HOMOdiene-LUMOdienophile之間的相互作用所限制，由于這種限制的存在，需要催化劑的參與，以便有利于反應(yīng)的發(fā)生，這通常是通過(guò)雙烯體的親核性或親雙烯體的親電性的增加以加強(qiáng)HOMOdiene-LUMOdienophile之間的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)，雙烯體上的給電子基團(tuán)可以提高HOMOdiene的能量，從而改善與親雙烯體分子LUMOdienophile的軌道相互作用。同樣地，吸電子取代基的作用是降低親雙烯體LUMOdienophile的能量，從而增加與雙烯體HOMOdiene的軌道混合，促進(jìn)環(huán)加成反應(yīng)。而逆電子需求則相反，是被HOMOdienophile-LUMOdiene的相互作用所限制（圖3）［33-35］。對(duì)于化學(xué)合成來(lái)說(shuō)，通常會(huì)用到Br?nsted酸［36］、Lewis酸［37］、手性磷酸［38］等催化劑，來(lái)降低LUMO或者是提高HOMO，從而增加HOMO-LUMO的相互作用，達(dá)到提高活性的效果［39-40］。而酶催化DA反應(yīng)生物合成中，除了未被驗(yàn)證的酶外，已被證實(shí)的催化DA反應(yīng)的酶大多是正電子需求，如PyrE3［41］、CghA［42］和MycB［43］等，而IEDDA反應(yīng)則報(bào)道較少，IccD3［44］、MalE［45］已被證實(shí)是催化發(fā)生IEDDA反應(yīng)的酶。

圖3 Diels-Alder反應(yīng)的分類Fig. 3 Classification of Diels-Alder reactions

2 氧雜Diels-Alder反應(yīng)

吡喃類化合物是指含有一個(gè)氧原子的六元雜環(huán)化合物，廣泛存在于真菌以及植物中，具有多種抗癌活性，因此該類化合物也成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。其中，二氫吡喃環(huán)和四氫吡喃環(huán)是天然產(chǎn)物中普遍存在的結(jié)構(gòu)特征。從生源途徑分析，HDA反應(yīng)被認(rèn)為是構(gòu)建吡喃環(huán)的關(guān)鍵生物合成反應(yīng)，也是目前制備這一類化合物的主流方法［46-47］。

2.1 二氫吡喃類化合物的生物合成

二氫吡喃類化合物包括具有細(xì)胞毒和抗真菌特性的Leporin B（1）［48］、具有抗腫瘤活性的Neosetophomone B（3）和Eupenifeldin（7）［49］、基質(zhì)溶素抑制劑和潛在的抗關(guān)節(jié)炎藥物Epolone B（4）［50］、潛在的降糖藥物Asperpyridone A（9）［51］等（圖1）?；谄渖锘钚约敖Y(jié)構(gòu)特征，該類化合物生物合成研究的熱度更是不斷上升，取得了不少令人矚目的研究結(jié)果。

2015年Jeffrey W. Cary等［52］對(duì)絲狀真菌黃曲霉（Aspergillus flavus）的基因組進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)lep基因簇導(dǎo)致了Leporin B（1）以及去羥基前體Leporin C（2）的生物合成，但并未對(duì)其合成途徑進(jìn)行深入研究。

2017年，唐奕教授課題組［27］在此基礎(chǔ)上，將已報(bào)道的黃曲霉中Leporin B（1）生物合成基因簇，轉(zhuǎn)入構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）中異源表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)Leporin B（1）合成途徑的解析。研究發(fā)現(xiàn)底物苯丙氨酸（21）在聚酮合酶-非核糖體肽合酶（PKS-NRPS）LepA、烯酰還原酶（ER）LepG和用于環(huán)擴(kuò)展的P450酶LepH的共同作用下生成22［53］，然后在短鏈脫氫酶（SDR）LepF作用下進(jìn)一步生成23。而23在無(wú)酶情況下，自發(fā)反應(yīng)得到分子內(nèi)DA以及HDA反應(yīng)的混合物，反應(yīng)無(wú)立體選擇性。據(jù)此推測(cè)，反應(yīng)立體選擇的控制必然來(lái)源于酶促，而其中最為可能的候選者為L(zhǎng)epI，其歸屬于SAM（S-腺苷甲硫氨酸）依賴的O-甲基轉(zhuǎn)移酶家族。隨后經(jīng)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，當(dāng)反應(yīng)體系中存在LepI時(shí)，只有Leporin B（1）的前體Leporin C（2）生成，進(jìn)一步加入P450 LepD得到了預(yù)期的最終產(chǎn)物L(fēng)eporin B（1）。為進(jìn)一步分析LepI，作者分離出23的兩個(gè)異構(gòu)體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在無(wú)酶對(duì)照中依舊會(huì)自發(fā)反應(yīng)，這與前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果保持一致。在添加LepI后，23在輔助因子不存在的情況下完全轉(zhuǎn)化為2，由此證明LepI是23轉(zhuǎn)化成2的關(guān)鍵因素，具體反應(yīng)過(guò)程需要先立體選擇性脫水生成（E）-24，然后再經(jīng)HDA反應(yīng)生成2（圖4）。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)該反應(yīng)伴隨有分子內(nèi)Diels-Alder反應(yīng)，證明LepI具有催化脫水、分子內(nèi)Diels-Alder反應(yīng)、HDA反應(yīng)以及反Claisen重排的多種功能。為了進(jìn)一步解析LepI催化機(jī)理，作者進(jìn)行了密度泛函理論（DFT）計(jì)算。計(jì)算結(jié)果發(fā)現(xiàn)與（Z）-24相比，（E）-24轉(zhuǎn)化為2的自由能要低得多，這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。（E）-24經(jīng)HDA反應(yīng)和分子內(nèi)DA反應(yīng)分別轉(zhuǎn)化為2和25的過(guò)渡態(tài)能量都較低（分別為-11.2 kcal/mol和-17.1 kcal/mol，1 kcal=4.2 kJ），這也是兩種產(chǎn)物均能產(chǎn)生的原因。但是相對(duì)而言，經(jīng)HDA反應(yīng)的能壘更低，產(chǎn)物2占比更大［54-55］。

圖4 Leporin B（1）的生物合成途徑Fig. 4 Biosynthetic pathway of Leporin B (1)

隨后，LepI的催化機(jī)理引發(fā)了人們的廣泛興趣，目前也有數(shù)例結(jié)構(gòu)以及催化機(jī)理的研究報(bào)道［54，56-60］，郭瑞庭教授課題組［56］通過(guò)與來(lái)自草酸青霉（Penicillium oxalicum）的一種SAM依賴的O-甲基轉(zhuǎn)移酶OxaC結(jié)構(gòu)比較，進(jìn)一步解析了LepI的晶體結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，與典型的Ⅰ類甲基轉(zhuǎn)移酶一樣，LepI也折疊成N端和C端結(jié)構(gòu)域。程偉教授課題組［59］則發(fā)現(xiàn)α1與α2螺旋的缺失，會(huì)完全消除酶的活性，這也意味著LepI與其他同源O-甲基轉(zhuǎn)移酶中觀察到相同的二聚體組織不同，其二聚體會(huì)通過(guò)α1和α2螺旋相互作用形成四聚體，底物周?chē)?yáng)離子殘基有增強(qiáng)反應(yīng)活性的功能。此外，SAM與C端的Rossmann折疊結(jié)合，化合物2位于N端和C端界面上形成的一個(gè)大口袋中，靠近SAM結(jié)合位點(diǎn)，SAM的腺苷環(huán)和氨基酸分別通過(guò)π-π相互作用和氫鍵結(jié)合在口袋中，結(jié)合強(qiáng)度也對(duì)LepI的反應(yīng)活性產(chǎn)生影響。同時(shí)SAM帶正電的部分可能與22的苯基部分和吡啶環(huán)形成陽(yáng)離子π-π相互作用，這也證明SAM對(duì)酶的催化功能至關(guān)重要。雖然對(duì)SAM的具體功能還未研究透徹，但為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供了有力的參考與借鑒。

胡友財(cái)教授課題組［28］利用鄰醌甲基托丙酮（29）與葎草烯的HDA反應(yīng)合成Neosetophomone B（3）、Epolone B（4）和Eupenifeldin（7）。該課題組最初從微紫青霉（Penicillium janthinellum）中分離出3和4，證明微紫青霉中存在這一類化合物的生物合成途徑。進(jìn)一步對(duì)其基因組進(jìn)行生物信息學(xué)分析，鑒定出一個(gè)NR-PKS基因簇，將其命名為eupf簇［61-62］。為驗(yàn)證eupf基因簇并闡明3的生物合成途徑，將該基因簇轉(zhuǎn)入構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）中進(jìn)行異源表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)非還原聚酮合酶（NR-PKS）EupfA、FAD依賴的單加氧酶EupfB以及α-酮戊二酸依賴的雙加氧酶EupfC共同催化下，生成了化合物29。將短鏈脫氫酶（SDR）EupfE于大腸桿菌（Escherichia coli）中異源表達(dá)，純化后與29以及NADPH孵育，得到新產(chǎn)物30。而EupfG和細(xì)胞色素P450單加氧酶EupfD共表達(dá)后，發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)有33的產(chǎn)生，單獨(dú)表達(dá)EupfG則會(huì)產(chǎn)生32?；衔?2和33具有Z型烯烴鍵，這與3中烯烴的Z型鍵一致，以上結(jié)果表明，EupfG是一種新的倍半萜合酶。此外，該課題組利用EupfF的同源酶EupF［63］（相似度81%/同源度67%），以及30為底物進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，并用甘油來(lái)捕獲31，確定了31的結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EupF催化了30和33向3的轉(zhuǎn)化，而化合物3是對(duì)映體純化合物，這就表明EupF直接控制HDA反應(yīng)的立體選擇性。而后將EupfD在構(gòu)巢曲霉中表達(dá)，34轉(zhuǎn)化為非天然產(chǎn)物35，并檢測(cè)到33自發(fā)與35發(fā)生HDA反應(yīng)，生成Epolone B（4）及其異構(gòu)體5（圖5）。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)EupfF與已知分子內(nèi)DA酶不同，其并沒(méi)有可識(shí)別的輔因子結(jié)合位點(diǎn)。最后通過(guò)密度泛函理論（DFT）計(jì)算發(fā)現(xiàn)，對(duì)應(yīng)兩條途徑的過(guò)渡態(tài)能量都相對(duì)較低，加成的兩分子處在距離較近的合適構(gòu)型狀態(tài)，因此環(huán)加成極易發(fā)生。遺憾的是，在30和33為底物實(shí)驗(yàn)中均未檢測(cè)到雙HDA加合物Eupenifeldin（7）。隨后，Carsten Schotte等［64-65］報(bào)道了來(lái)自暗球腔菌屬（Phaeosphaeriaceaesp.）的CF-150626產(chǎn)生了化合物6。通過(guò)對(duì)對(duì)應(yīng)基因簇測(cè)序，將其命名為eup2，然后對(duì)eup2和來(lái)自乳產(chǎn)孢桿菌屬（Leptobacilliumsp.）CF-236968的同源基因簇pyc進(jìn)行了探究，成功利用PycR1合成了雙HDA加合物36，該化合物進(jìn)一步在米曲霉菌（Aspergillus oryzae）中轉(zhuǎn)化成了產(chǎn)物6（圖5）。雖然體外合成未能完成，且對(duì)7合成途徑的探究尚存在欠缺，但仍成功實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)雙HDA加合物的合成。

圖5 Neosetophomone B（3）與Epolone B（4）的生物合成途徑Fig. 5 Biosynthetic pathway of Neosetophomone B (3) and Epolone B (4)

2017年，曹樹(shù)更教授課題組［66］利用真菌FT1061（Camporesia sambuci）和FT1062（Epicoccum sorghinum）共培育獲得了新的N-甲氧基吡啶酮類化合物8，該產(chǎn)物為Fusaricide（10）的類似物（圖1）［67］。2020年，唐奕教授課題組［68］在此基礎(chǔ)上，報(bào)道了Fusaricide（10）的前體Asperpyridone A（9）的生物合成途徑。作者通過(guò)基因組搜索，發(fā)現(xiàn)了含有聚酮合成酶-非核糖體肽合成酶（PKS-NRPS）的基因簇，以及催化HDA反應(yīng)的EpiI。具體生物合成途徑包括起始底物在PdxC（PKS-NRPS）和烯酰還原酶（ER）PdxD催化下反應(yīng)生成37，然后進(jìn)一步利用P450酶PdxA催化環(huán)擴(kuò)展生成38。接下來(lái)在短鏈脫氫酶（SDR）PdxG和輔因子NADPH的存在下，38被還原為醇39。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在溶液中，39易發(fā)生非酶脫水生成（Z）-QM（40），而PdxG孵育過(guò)長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生42。當(dāng)加入O-甲基轉(zhuǎn)移酶（OMT）PdxI或者其同源簇AdxI和ModxI時(shí)，主要發(fā)生Alder-ene反應(yīng)形成43；當(dāng)體系中加入EpiI或者其同源簇UpiI和HpiI時(shí)，周環(huán)發(fā)生選擇性切換，經(jīng)HDA反應(yīng)生成41（圖6）。這兩種酶催化具有很強(qiáng)的周環(huán)選擇性，不能相互轉(zhuǎn)化。接下來(lái)作者又對(duì)PdxI和HpiI以及兩種酶和底物與產(chǎn)物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)EpiI為非SAM依賴的酶，且PdxI突變體（V413M）和EpiI雙突變體（M411V/T231A）表現(xiàn)出相反的周環(huán)選擇性［69］。

圖6 Fusaricide（10）前體Asperpyridone A（9）的生物合成途徑Fig. 6 Pathway for synthesizing the precursor Asperpyridone A (9) of Fusaricide (10)

從以上研究可知，催化HDA反應(yīng)的天然酶相關(guān)基因簇，通常含有一種聚酮合酶（PKS）、一種短鏈脫氫酶/還原酶（SDR）、一種烯酰還原酶（ER）、兩種P450（一種用于環(huán)擴(kuò)展，一種用于羥基化）以及一種O-甲基轉(zhuǎn)移酶（OMT）。

除天然酶外，也有通過(guò)人工設(shè)計(jì)酶實(shí)現(xiàn)HDA反應(yīng)的報(bào)道，例如，Donald Hilvert教授課題組［70］利用人工金屬酶HDA酶MID1sc制備二氫吡喃類化合物11。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，利用44和45合成11的反應(yīng)是一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)的分子間DA和HDA反應(yīng)分別生成46和11（圖7）。通過(guò)DFT計(jì)算表明，Zn（Ⅱ）（HO-）（H2O）2的加入使環(huán)加成反應(yīng)從緩慢一致的反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榭焖俜植挤磻?yīng)，并有利于內(nèi)型HDA產(chǎn)物的生成。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模板MID1sc蛋白無(wú)法催化44和45的轉(zhuǎn)化。通過(guò)DFT計(jì)算發(fā)現(xiàn)如果在位于含鋅離子的結(jié)合袋兩端增加兩個(gè)突變E32L和K68W，可以在保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的同時(shí)改善底物結(jié)合和過(guò)渡態(tài)穩(wěn)定性，由此得到酶DA0，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該突變體具有一定的目標(biāo)活性。在對(duì)DA0的幾個(gè)殘基進(jìn)行了四輪突變后，最后得到活性較高的十二突變體DA7。通過(guò)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)測(cè)試發(fā)現(xiàn)，DA7催化效率相對(duì)于DA0提高了5個(gè)數(shù)量級(jí)以上，且具有高度的立體選擇性，只生成內(nèi)型HDA產(chǎn)物。隨后，通過(guò)對(duì)DA7的晶體結(jié)構(gòu)解析，對(duì)接計(jì)算和分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬發(fā)現(xiàn)，只有產(chǎn)物11的內(nèi)型異構(gòu)體的過(guò)渡態(tài)適合結(jié)合口袋，同時(shí)與Zn（Ⅱ）配位強(qiáng)且沒(méi)有發(fā)生空間沖突。最終利用該優(yōu)勢(shì)突變體的催化活性，成功實(shí)現(xiàn)了11的制備［70］。

圖7 人工鋅金屬酶DA7催化HDA反應(yīng)Fig. 7 HDA reaction catalyzed by the artificial zinc metalloenzyme DA7

2.2 四氫吡喃類化合物的合成

一些重要藥物，如紅霉素、雙氫鏈霉素等分子以及許多碳水化合物都含有四氫吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)［71-72］。如來(lái)自黏菌多酮衍生的Ambruticins（12）（Ambruticin F和S等）家族，包含了兩種雜環(huán)（圖1），具有特殊的生理活性，其中Ambruticin S對(duì)多種真菌病原體表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗真菌活性［73-74］。鏈霉菌屬的Tetronasin（13）被用作抗生素和抗寄生蟲(chóng)劑［75］，Tetromadurin（14）具有抗逆轉(zhuǎn)錄病毒和抗瘧疾活性等作用［76］，該類化合物重要的藥用價(jià)值引發(fā)了人們極大的合成興趣。

Peter F. Leadlay教授課題組通過(guò)測(cè)序以及生物信息學(xué)分析Tetronasin（13）生物基因簇發(fā)現(xiàn)，其中存在兩種［4+2］環(huán)化酶Tsn11和Tsn15，與被證明是四毒霉素生物合成所必需的tmn同源［77］。為了驗(yàn)證兩種酶的功能，作者首先在黃色長(zhǎng)孢鏈霉菌（Streptomyces longisporoflavus）中敲除兩種酶的編碼基因后發(fā)現(xiàn)了代謝產(chǎn)物48的積累，證明48是最終產(chǎn)物的前體。隨后以6-癸氨基-2-氟- 3-氧己酸甲酯（47）作為化學(xué)探針［78］（圖8），確定了PKS結(jié)合中間體的存在。接下來(lái)為了驗(yàn)證其體外活性，將兩種酶表達(dá)純化，并以48為底物進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Tsn11催化HDA反應(yīng)的發(fā)生，產(chǎn)生了氧化二烯中間體49，接著，Tsn15催化重排，形成四氫吡喃環(huán)，并分解氧化二烯部分，產(chǎn)生Tetronasin（13）（圖9）。對(duì)Tsn11蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，Tsn11與生物合成途徑中催化二烷基十氫化萘形成的VstK、PyrE3和ChlE3蛋白序列相似，而Tsn15則類似于類DA環(huán)化酶的第二家族VstJ、PyrI4和AbyU［79-82］。為進(jìn)一步闡明催化機(jī)理，該研究團(tuán)隊(duì)對(duì)Tsn15的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)過(guò)程中通過(guò)周環(huán)重排產(chǎn)生四氫吡喃環(huán)的機(jī)制，類似于其同源酶AOC2［83］和［4+2］環(huán)化酶PyrI4［82］和AbyU［84］。另外在Tsn15與底物共晶中，發(fā)現(xiàn)49羥基脫水生成50。由于Tsn15的活性位點(diǎn)更易與49形成氫鍵，因此49更有可能是Tsn15的底物。雖然確切機(jī)制尚不清楚，但為后續(xù)的進(jìn)一步探究提供了有力的基礎(chǔ)［77，85］。

圖8 6 -癸氨基-2-氟-3-氧己酸甲酯（47）Fig. 8 Methyl 6-decanamido-2-fluoro-3-oxohexanoate (47)

圖9 Tetronasin（13）的生物合成途徑Fig. 9 Biosynthetic pathway of Tetronasin (13)

2020年，該實(shí)驗(yàn)室又對(duì)與Tetronasin（13）結(jié)構(gòu)高度相似的Tetromadurin（14）生物合成途徑進(jìn)行了報(bào)道［85-86］，確定該化合物生物合成基因簇為mad，并確定與基因簇tmn和tsn同源［77］，合成途徑也類似，其中環(huán)化酶為Mad10和Mad31，可以實(shí)現(xiàn)前體51到54的轉(zhuǎn)化，最后Mad30催化54進(jìn)一步羥基化生成目標(biāo)產(chǎn)物14（圖10）。

圖10 Tetromadurin（14）的生物合成途徑Fig. 10 Biosynthetic pathway of Tetromadurin (14)

綜上可知，酶催化四氫吡喃類化合物的合成，一般包含兩種環(huán)化酶，一種催化HDA反應(yīng)，另一種則催化分子結(jié)構(gòu)的重排，同時(shí)生物合成途徑與合成機(jī)理都大同小異。通過(guò)對(duì)這些研究成果的分析，可以為人們后續(xù)的探索和研究提供借鑒。

3 氮雜Diels-Alder反應(yīng)

來(lái)自于真菌曲霉屬和青霉菌屬中具有獨(dú)特雙環(huán)［2.2.2］重氮辛烷核心結(jié)構(gòu)的吲哚類生物堿，因其有趣的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性而受到越來(lái)越多的關(guān)注［87-89］。不同種類的吲哚生物堿具有不同生物學(xué)特性和藥理活性，例如：具有抗癌作用的Stephacidin A（15）［90］、具有殺蟲(chóng)作用的Notoamide P（16）［91］、具有鈣調(diào)素抑制作用的Malbrancheamides（17）等（圖2）［92］。而這些天然產(chǎn)物的雙環(huán)［2.2.2］重氮辛烷核心的生物合成途徑一直以來(lái)廣受關(guān)注。1970年，A.E.A.Porter和P.G.Sammes［93］首次提出該類結(jié)構(gòu)來(lái)源可能通過(guò)分子內(nèi)［4+2］DA反應(yīng)產(chǎn)生，引發(fā)了人們對(duì)DA反應(yīng)合成吲哚生物堿的關(guān)注。而目前所用手段大多數(shù)基于有機(jī)合成，相對(duì)而言，酶催化DA反應(yīng)合成吲哚生物堿的報(bào)道甚少。

2016年，Sachiko Tsukamoto教授課題組［94］對(duì)多種吲哚生物堿的合成途徑進(jìn)行了匯總，并利用真菌培養(yǎng)分離出7種吲哚生物堿，提出了構(gòu)建這些天然化合物可能的合理生物合成途徑，但并未對(duì)其中酶的催化機(jī)理進(jìn)一步研究。2019年，Robert M.Williams教授課題組［29］報(bào)道了Malbrancheamide（17）的生物合成途徑（圖11）。該課題組為了在化學(xué)上驗(yàn)證17的生物合成途徑，首先通過(guò)有機(jī)合成得到了中間體61，進(jìn)而經(jīng)酶催化HDA反應(yīng)，得到了17的前體（+）-Premalbrancheamide（18），由此表明61可能是合成最終產(chǎn)物的中間體。同時(shí)依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，提出了好氧和厭氧兩種可能的生物合成途徑。隨后，該課題組進(jìn)行了生物合成途徑的體外重建，首先MalG催化L-脯氨酸和L-色氨酸偶聯(lián)生成56，產(chǎn)物自發(fā)縮合脫水經(jīng)57得到58。在有氧條件下，58自發(fā)氧化產(chǎn)生60，在異戊烯基轉(zhuǎn)移酶MalE（來(lái)自mal基因簇）存在時(shí)，60經(jīng)異戊烯基化產(chǎn)生兩性離子61。隨后氧化還原酶MalC先將61還原成62，進(jìn)一步催化分子內(nèi)DA反應(yīng)，產(chǎn)生18，證明MalC具有還原和催化分子內(nèi)DA反應(yīng)的雙重功能；在厭氧條件下，MalE催化58產(chǎn)生59，然后MalC先將59還原成62，接著催化發(fā)生分子內(nèi)DA反應(yīng)，產(chǎn)生18，18可以通過(guò)MalA催化進(jìn)一步生成17（圖11）。研究發(fā)現(xiàn)，與好氧條件相比，厭氧條件下該反應(yīng)的效率相對(duì)較弱，這表明相對(duì)于58，61才是MalC的最適底物。同時(shí)發(fā)現(xiàn)NADPH為MalC的最適輔因子，使用NADPH的催化效率（kcat/Km）比利用NADH高10倍。為了進(jìn)一步探究分子內(nèi)DA酶MalC的催化機(jī)理，對(duì)其晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了探究。但是在獲取MalC的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)時(shí)沒(méi)有成功，因此改為分析同源酶PhqE與底物61的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬和定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，由此提出了MalC的催化機(jī)制。MalC中關(guān)鍵殘基Asp108與Arg130發(fā)生相互作用，穩(wěn)定Arg130給出質(zhì)子后的構(gòu)象，Arg130作為質(zhì)子供體與NADPH核糖的2′-OH結(jié)合促進(jìn)該輔因子的結(jié)合。NADPH是電子供體，Asp165可以穩(wěn)定61的正電荷，促進(jìn)18的形成。IMDA反應(yīng)的立體控制主要由形狀互補(bǔ)驅(qū)動(dòng)，底物與Trp168之間的接觸，以及輔因子結(jié)合位置在IMDA過(guò)程中起著關(guān)鍵作用（圖12）［95-96］。

圖11 吲哚生物堿Malbrancheamides（17）的生物合成途徑Fig. 11 Biosynthetic pathway of indole alkaloid malbrancheamides (17)

圖12 MalC/Phq催化Diels-Alder反應(yīng)的催化機(jī)理Fig. 12 Catalytic mechanism underlying the MalC/PhqE-catalysed Diels-Alder reaction

近期，K.N.Houk、David H. Sherman以及高雪教授課題組［45］發(fā)現(xiàn)NmrA類酶CtdP可以作為DA酶催化立體選擇性合成（+）-Precitrinadin A（19）。為了驗(yàn)證其催化作用，將其表達(dá)純化后，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)輔因子NADP+在CtdP催化過(guò)程中必不可少，且CtdP催化α-反式選擇性IMDA環(huán)化。底物63在CtdP與輔因子NADPH作用下，生成α-反式中間體19，19可以進(jìn)一步形成20。而在無(wú)酶條件下，63會(huì)自發(fā)生成非對(duì)映異構(gòu)體64和65（圖13）。對(duì)晶體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，大體積殘基Trp160、Phe170和Phe174發(fā)生了空間位沖突，表明這些殘基可以在空間位上阻礙syn構(gòu)象的形成。DFT計(jì)算表明CtdP催化的α-反式選擇性IMDA環(huán)加成是通過(guò)氧化還原途徑介導(dǎo)發(fā)生的，在該途徑中，NADP+氧化降低了LUMOdiene，從而實(shí)現(xiàn)了IEDDA反應(yīng)，這也證明CtdP為雙功能氧化還原酶。通過(guò)MD模擬，NADPH會(huì)與63的氧化中間體形成氫鍵，阻止底物反轉(zhuǎn)形成其他構(gòu)象。據(jù)此提出了CtdP依賴于NADP+/NADPH的催化的逆電子需求DA反應(yīng)的氧化還原機(jī)制（圖14）。這是第一個(gè)報(bào)道的具有立體選擇性催化HDA反應(yīng)生成吲哚生物堿的雙功能氧化還原酶［97-101］。

圖13 吲哚生物堿（+）-Precitrinadin A（19）的生物合成途徑Fig. 13 Biosynthetic pathway of indole alkaloid (+)-Precitrinadin A (19)

圖14 CtdP催化的IEDDA反應(yīng)的催化機(jī)理Fig. 14 Catalytic mechanism underlying the CtdP-catalysed IEDDA reaction

雖然酶催化合成吲哚生物堿雙環(huán)［2.2.2］重氮辛烷核心結(jié)構(gòu)的報(bào)道較少，但因?yàn)槠浜铣蓛r(jià)值，化學(xué)合成的方法有諸多研究。出于對(duì)綠色高效以及高選擇性的制備方式需求，酶催化合成途徑仍值得深入探索。

文中提到的HDA酶及其產(chǎn)物總結(jié)于表1。

表1 HDA酶及其產(chǎn)物Table 1 HDA enzymes and products

4 總結(jié)與展望

本綜述主要對(duì)酶催化氧雜DA反應(yīng)和氮雜DA反應(yīng)的相關(guān)研究成果進(jìn)行了概述，包括生物合成途徑以及催化機(jī)理的分析。通過(guò)對(duì)已報(bào)道的HDA酶進(jìn)行分析可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)于二氫吡喃類化合物通常由一種聚酮合成酶（PKS）充當(dāng)HDA酶的角色，催化HDA反應(yīng)的發(fā)生，而四氫吡喃類化合物則由兩種［4+2］環(huán)化酶協(xié)同作用催化產(chǎn)物的合成；而對(duì)于雜氮DA反應(yīng)合成吲哚生物堿，輔因子NADPH的存在極其重要，與其他殘基共同決定了產(chǎn)物的構(gòu)象。

近年來(lái)，酶催化HDA反應(yīng)獲得了廣泛的關(guān)注，得到了較快的發(fā)展。但不可否認(rèn)的是，大多已報(bào)道的HDA酶的催化機(jī)理還沒(méi)有被分析透徹，且多數(shù)HDA酶仍有待分離和表征。通過(guò)這些雜原子參與的酶催化DA反應(yīng)合成雜環(huán)天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，核心結(jié)構(gòu)大同小異，所涉及的HDA酶具有較高的同源性，結(jié)構(gòu)和功能以及催化機(jī)理極為相似，這也為后續(xù)HDA酶的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供了參考。分析新的HDA酶的結(jié)構(gòu)、功能以及催化機(jī)理等時(shí)，可以參考其同源酶，以此來(lái)降低分析難度。另外，酶催化HDA反應(yīng)生物合成雜環(huán)天然產(chǎn)物的相關(guān)酶，大多數(shù)已經(jīng)失去了功能的混雜性，只立體選擇性催化［4+2］DA反應(yīng)產(chǎn)物的生成，目前已知的唯一例外是CtdP，該酶屬于氧化還原酶家族，且具有雙功能［45］。

另外，除了氧雜DA反應(yīng)和氮雜DA反應(yīng)，關(guān)于其他雜原子，例如S或P等參與的DA反應(yīng)大多以非酶催化劑催化反應(yīng)的發(fā)生，而酶催化雜硫和雜磷DA反應(yīng)的相關(guān)報(bào)道很少，已報(bào)道的HDA酶是否可以應(yīng)用于催化含其他雜原子雜環(huán)的合成，這方面的研究還有待開(kāi)發(fā)。

HDA反應(yīng)作為合成天然雜環(huán)極其重要的工具，利用酶催化綠色、高效、高選擇性地合成雜環(huán)天然產(chǎn)物已成為人們關(guān)注的重點(diǎn)，并希望能夠?qū)ζ浜铣赏緩?、結(jié)構(gòu)、機(jī)理進(jìn)行深一步的挖掘。然而大多數(shù)HDA酶有著較高的底物特異性和立體選擇性，且其底物譜非常狹窄，甚至一種HDA酶僅能實(shí)現(xiàn)一種雜環(huán)天然產(chǎn)物的合成，這就使得酶的應(yīng)用受到了很大的限制，難以實(shí)現(xiàn)酶的使用價(jià)值最大化。因此，在之后的HDA酶研究中，一方面，研究者們可以通過(guò)定向進(jìn)化等方法，對(duì)酶進(jìn)行改造，還可以考慮對(duì)HDA酶同源重組進(jìn)行基因融合，以實(shí)現(xiàn)已報(bào)道的HDA酶底物譜擴(kuò)大化，甚至實(shí)現(xiàn)酶對(duì)不同類型底物的識(shí)別，從而得到更加多樣、更加復(fù)雜的天然雜環(huán)產(chǎn)物，如已報(bào)道的PdxI［68］和DA7［70］等；另一方面，可以對(duì)已報(bào)道的HDA酶的同源酶進(jìn)行深入挖掘，通過(guò)對(duì)比、實(shí)驗(yàn)以及MD或者是DFT等計(jì)算，實(shí)現(xiàn)對(duì)同源酶的性能、結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理以及產(chǎn)物合成途徑等的探究；同時(shí)，要關(guān)注已報(bào)道過(guò)或者是新發(fā)現(xiàn)的能夠產(chǎn)生HDA產(chǎn)物的生物，通過(guò)對(duì)該生物體內(nèi)未驗(yàn)證其作用的基因進(jìn)行測(cè)序，異源表達(dá)以及體外實(shí)驗(yàn)等，實(shí)現(xiàn)對(duì)新酶的探索。另外，基于天然酶的序列-結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的解析，可以使用Rosetta等技術(shù)設(shè)計(jì)新的HDA酶，以獲取功能更為強(qiáng)大的新酶。隨著對(duì)HDA酶研究的不斷進(jìn)行，終將實(shí)現(xiàn)對(duì)HDA酶的結(jié)構(gòu)、功能以及催化機(jī)理的深入了解，并指導(dǎo)天然以及非天然雜環(huán)產(chǎn)物的生物合成，成功實(shí)現(xiàn)合成的簡(jiǎn)單化和多樣化。