腫瘤類器官及其在合成生物學(xué)中的研究進(jìn)展

孟倩，尹聰，黃衛(wèi)人，2

（1 深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，國(guó)家地方聯(lián)合醫(yī)學(xué)合成生物學(xué)臨床應(yīng)用關(guān)鍵技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518036； 2 中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所，廣東 深圳 518000）

在過(guò)去的幾十年里，科學(xué)家對(duì)癌癥的研究付出了巨大的努力，在診斷和治療方面也取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展［1-3］。然而癌癥仍然是全球主要健康問(wèn)題，為進(jìn)一步提高癌癥患者的生活質(zhì)量并延長(zhǎng)生存期，迫切需要準(zhǔn)確的臨床前模型來(lái)研究腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制，加速實(shí)驗(yàn)成果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用［4］。二維細(xì)胞系模型和患者來(lái)源的腫瘤異種移植模型是臨床前研究較為常用的兩種模型。細(xì)胞系模型作為癌癥研究中最普遍應(yīng)用的模型，具有操作方便、無(wú)限繁殖及高通量的特點(diǎn)［5］，但其細(xì)胞種類單一，無(wú)法模擬細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用，并且經(jīng)過(guò)多次傳代后原始腫瘤缺乏遺傳異質(zhì)性［6］。患者來(lái)源的異種移植瘤模型可結(jié)合患者腫瘤的特異性和動(dòng)物整個(gè)在體環(huán)境，但建模時(shí)間較長(zhǎng)、種間差異較大、無(wú)法廣泛應(yīng)用于所有類型腫瘤［7-9］。近年來(lái)，類器官培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展為開(kāi)發(fā)更接近機(jī)體細(xì)胞組成和病理生理的癌癥模型開(kāi)辟了新途徑。類器官（organoid）是由多能干細(xì)胞（pluipotent stem cell， PSC）和成體干細(xì)胞（adult stem cell，ASC）在體外培養(yǎng)獲得的與人體組織結(jié)構(gòu)和功能高度相似的一種3D細(xì)胞模型［10-14］。

多能干細(xì)胞包括誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞，此兩種多能干細(xì)胞類型均可以自我更新并分化成所有的細(xì)胞類型?；趯?duì)各個(gè)器官的起源細(xì)胞和發(fā)育譜系的了解，可在體外培養(yǎng)過(guò)程中動(dòng)態(tài)調(diào)整不同階段所需發(fā)育和生長(zhǎng)的生長(zhǎng)因子種類及其濃度，階段性微環(huán)境誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的同質(zhì)群體經(jīng)過(guò)不同的階段定向分化形成不同的類器官細(xì)胞群和對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)，多能干細(xì)胞來(lái)源的類器官可以模擬體內(nèi)器官發(fā)育，探究在不同的時(shí)間節(jié)點(diǎn)器官發(fā)育的形態(tài)及變化［15-19］。成體干細(xì)胞位于分化成熟的組織器官之中，分離的成體干細(xì)胞在添加適當(dāng)細(xì)胞因子的體外培養(yǎng)體系中可以誘導(dǎo)成相應(yīng)的類器官，成體干細(xì)胞來(lái)源的類器官主要包括正常類器官和腫瘤類器官，在精準(zhǔn)醫(yī)療、難治疾病建模及藥物篩選領(lǐng)域發(fā)揮較大的作用［20-28］（圖1）。

圖1 從干細(xì)胞和癌細(xì)胞中構(gòu)建類器官［29］Fig. 1 Constructing organoids from stem cells and cancer cells[29]

由此可見(jiàn)，類器官可以在很大程度上維持目標(biāo)組織或器官的遺傳特征和表型特征，具有巨大的臨床應(yīng)用潛力，特別是在癌癥研究方面，為癌癥基礎(chǔ)研究成果更有效地轉(zhuǎn)化應(yīng)用于臨床治療帶來(lái)了新的曙光［29-34］。

1 腫瘤類器官來(lái)源及構(gòu)建

類器官的起源可以追溯到上個(gè)世紀(jì)［35-36］，多個(gè)實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)動(dòng)物細(xì)胞可從任意的、非人為設(shè)計(jì)的狀態(tài)體外發(fā)育成具有器官特征的自組裝結(jié)構(gòu)，并報(bào)道了多種類型的培養(yǎng)系統(tǒng)［37-38］。早期的研究雖報(bào)道了多種類型的三維培養(yǎng)體系，但沒(méi)有一種方法可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期培養(yǎng)并穩(wěn)定保持相應(yīng)的生理結(jié)構(gòu)［39-40］。2009年，Hans Clevers團(tuán)隊(duì)［41］將小鼠腸段分離出來(lái)的Lgr5陽(yáng)性腸道細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)添加一些生長(zhǎng)因子，最終培養(yǎng)出帶有隱窩-絨毛的腸道上皮樣細(xì)胞團(tuán)塊，揭開(kāi)了類器官領(lǐng)域的新篇章。自Chen Yu團(tuán)隊(duì)建立了前列腺腫瘤類器官培養(yǎng)體系以來(lái)［42］，研究人員通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基中細(xì)胞因子種類及濃度，使不同組織來(lái)源的腫瘤類器官培養(yǎng)體系相繼建立［43-46］。

目前，腫瘤類器官主要來(lái)源于兩類：一是干細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外誘導(dǎo)分化后，利用基因編輯技術(shù)定向操控腫瘤類器官的形成［47-48］；二是直接來(lái)源于癌癥患者的腫瘤組織［49-51］。

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（retinoblastoma， Rb）是一種由RB1基因的雙等位基因失活引起的、易發(fā)生于兒童的視網(wǎng)膜惡性病變。生殖細(xì)胞有RB1突變的兒童在以后的生活中有很大的可能性發(fā)展成視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤和其他眼部相關(guān)惡性腫瘤。Liu等［47］利用RB1基因雙等位基因突變的基因工程人胚胎干細(xì)胞成功構(gòu)建了視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤類器官模型。這些Rb類器官表現(xiàn)出與Rb腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)錄組和全基因組甲基化高度一致的特性。

Driehui等［52］總結(jié)了從腫瘤組織中建立類器官的方法。患者來(lái)源的腫瘤類器官（patient derived organoid， PDO）建立的成功與否，可根據(jù)腫瘤組織病理學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察（細(xì)胞水平）、腫瘤標(biāo)志物的染色鑒定（蛋白水平）、基因表達(dá)變化及基因突變分析（基因水平）等多個(gè)維度進(jìn)行考量。無(wú)論是通過(guò)基因編輯誘導(dǎo)所構(gòu)建的腫瘤類器官，或者患者來(lái)源的腫瘤類器官，其均具有與人體腫瘤相近的基因組和轉(zhuǎn)錄組特征，為腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制及預(yù)測(cè)臨床患者的用藥反應(yīng)提供了有價(jià)值的體外高保真模型。

2 藥物篩選及精準(zhǔn)醫(yī)療

相比于傳統(tǒng)的細(xì)胞系和異種移植瘤模型，由于腫瘤類器官構(gòu)建成功率高、培養(yǎng)周期短，并且在多次傳代后仍能維持原有腫瘤的組織病理學(xué)特征及關(guān)鍵的遺傳特征，因此能夠更加真實(shí)地反映出藥物在患者體內(nèi)的治療作用［43，45］，可提前預(yù)測(cè)患者用藥的成功率［53-54］。Sachs等［45］選擇了6種靶向HER2通路的藥物，發(fā)現(xiàn)在HER2不表達(dá)或表達(dá)量低的情況下，乳腺癌類器官對(duì)HER2信號(hào)通路靶向藥物耐受，而在HER2過(guò)表達(dá)狀態(tài)下敏感。Nuciforo等［55］發(fā)現(xiàn)索拉非尼以劑量依賴性的方式抑制了肝細(xì)胞癌類器官以及肝膽管細(xì)胞癌類器官的生長(zhǎng)，表明從原發(fā)肝癌活檢樣本中構(gòu)建的類器官可用于體外測(cè)試腫瘤對(duì)常見(jiàn)治療藥物的敏感性。

類似于體內(nèi)腫瘤的腫瘤類器官能夠更加準(zhǔn)確地反映出患者體內(nèi)腫瘤對(duì)靶向和化療藥物的治療和毒副作用，結(jié)合腫瘤類器官和腫瘤組織的基因組圖譜、代謝組學(xué)特征、蛋白組學(xué)特征，可針對(duì)不同的個(gè)體患者量身制定治療方案，以期達(dá)到最佳治療效果，從而實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療。Tiriac等［56］對(duì)每位患者重復(fù)活檢后的樣本進(jìn)行出行處理，建立了66例胰腺癌患者來(lái)源類器官生物庫(kù)，對(duì)患者來(lái)源的類器官進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后，主成分分析圖譜和差異表達(dá)基因圖譜顯示PDO體外重現(xiàn)了各個(gè)胰腺癌患者對(duì)化療藥物的空間-患者內(nèi)異質(zhì)性以及時(shí)間演變，可預(yù)測(cè)患者化療后耐藥機(jī)制的獲得，通過(guò)分析每例類器官的化療藥物劑量反應(yīng)曲線，再結(jié)合對(duì)接受化療的患者臨床隨訪，結(jié)果表明基于PDO分子圖譜預(yù)測(cè)患者的化療反應(yīng)和臨床隨訪結(jié)果相符，提示結(jié)合PDO的分子譜和治療譜可能預(yù)測(cè)臨床反應(yīng)，并使前瞻性的治療選擇成為可能。van de Wetering等［43］將結(jié)直腸癌類器官對(duì)83種化合物的藥敏反應(yīng)與基因組特征相關(guān)聯(lián)，以識(shí)別與不同藥物反應(yīng)相關(guān)的腫瘤細(xì)胞亞群及其分子特征，證明了結(jié)腸腫瘤類器官在指導(dǎo)患者臨床用藥決策方面的可行性和實(shí)用性。Chen等［57］試圖利用患者來(lái)源的乳腺腫瘤類器官作為實(shí)時(shí)平臺(tái)，指導(dǎo)晚期乳腺癌的臨床治療，并取得了巨大的成功。該團(tuán)隊(duì)研究結(jié)果顯示，PDO通常對(duì)米托蒽醌、表阿霉素、阿霉素和硼替佐米（蛋白酶體抑制劑）治療敏感，而對(duì)福司坦和卡鉑持續(xù)耐藥。與乳腺原發(fā)腫瘤相比，來(lái)自轉(zhuǎn)移性腫瘤的類器官對(duì)許多藥物表現(xiàn)出更高的耐藥性，包括微管和EGFR靶向藥物、帕博西尼（CDK4/6抑制劑）和千金藤堿（抑制TNF-α介導(dǎo)的NF-κB刺激）。另外，患者用藥治療后構(gòu)建的類器官和患者未經(jīng)治療后構(gòu)建的類器官之間的藥物敏感性有顯著差異，部分類器官株存在多重耐藥，其中13例對(duì)75%的所測(cè)藥物耐藥，而敏感藥物不超過(guò)3種。Lee等［58］利用臨床上常見(jiàn)的化療藥物對(duì)膀胱腫瘤類器官進(jìn)行藥敏測(cè)試，發(fā)現(xiàn)不同患者來(lái)源的腫瘤類器官的藥物敏感程度與其突變譜有一定的相關(guān)性，這表明來(lái)自患者的膀胱腫瘤類器官可用于預(yù)測(cè)治療反應(yīng)并指導(dǎo)每位患者的個(gè)性化治療。黃衛(wèi)人等［59］發(fā)布了全球第一部《類器官藥物敏感性檢測(cè)指導(dǎo)腫瘤精準(zhǔn)治療臨床應(yīng)用專家共識(shí)》，為腫瘤類器官藥物敏感性檢測(cè)在臨床中的應(yīng)用提供了很好的學(xué)術(shù)支持，推動(dòng)類器官作為藥物模型應(yīng)用臨床規(guī)范化治療，引領(lǐng)相關(guān)領(lǐng)域工作進(jìn)展。

以上研究表明，通過(guò)為患者構(gòu)建屬于自己的類器官生物庫(kù)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行靶向藥物、單種化療藥物、聯(lián)合化療藥物等的多種治療方案的篩選，結(jié)合單細(xì)胞測(cè)序、批量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析預(yù)測(cè)各個(gè)患者對(duì)不同藥物的敏感性，可為患者臨床用藥提供參考，推動(dòng)癌癥患者個(gè)體化精準(zhǔn)治療的進(jìn)展［57，60］。

3 腫瘤類器官在合成生物學(xué)中的應(yīng)用

腫瘤類器官可維持原有腫瘤的組織病理學(xué)特征及關(guān)鍵的遺傳特征，能夠在體外更加真實(shí)地反映出藥物在患者體內(nèi)的治療作用，提高臨床患者用藥成功率［43，45］。合成生物學(xué)（synthetic biology）作為一門(mén)以應(yīng)用為目標(biāo)、設(shè)計(jì)為導(dǎo)向的新興交叉學(xué)科，針對(duì)細(xì)胞不同的狀態(tài)形成基因線路（gene circuits）和網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)過(guò)工程方式設(shè)想、革新甚至重新分解有特定功用的生物系統(tǒng)［61-62］，人工調(diào)控了生物體一系列分子成分的變化，如DNA、RNA 和蛋白質(zhì)，可預(yù)測(cè)并有效地對(duì)目的細(xì)胞進(jìn)行重新編程，以執(zhí)行計(jì)算和特定的生物任務(wù)［63-64］。合成生物學(xué)的一個(gè)基本目標(biāo)是在臨床腫瘤治療中，利用人工理性設(shè)計(jì)，合成腫瘤識(shí)別及干預(yù)治療的基因回路，在載體協(xié)助下植入體內(nèi)底盤(pán)細(xì)胞，糾正機(jī)體原有的缺陷回路功能，實(shí)現(xiàn)疾病治療的最終目的［65］。從正常組織上皮細(xì)胞中構(gòu)建的上皮類器官模型，可結(jié)合基因編輯技術(shù)進(jìn)行突變建模，以探究特定基因在癌癥中的作用，而對(duì)于DNA等遺傳物質(zhì)進(jìn)行精準(zhǔn)、快速、高效的組裝和編輯也是合成生物學(xué)中不可分割的內(nèi)容，因此基因組編輯技術(shù)在合成生物學(xué)和類器官疾病建模間起到了橋梁作用（圖2）。Zhao等［54］利用CRISPR/Cas9敲除了類器官中兩個(gè)關(guān)鍵的腫瘤抑制基因（TP53和CDKN2A），這些基因的雙重敲除導(dǎo)致胃食管交接部（gastroesophageal junction， GEJ）類器官發(fā)生癌變，生長(zhǎng)速度加快，從而揭示了早期胃食管交界部腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了胃食管交界部腫瘤的治療靶點(diǎn)——血小板激活因子（PTAF），體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用siRNA或小分子抑制劑抑制PTAF，能夠減緩或停止小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。Guo等［66］對(duì)小鼠前列腺正常上皮細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了管腔細(xì)胞中存在一類前列腺成體干細(xì)胞，并命名為L(zhǎng)uminal-C，該類管腔上皮細(xì)胞在體外可表現(xiàn)出更強(qiáng)的類器官形成能力，在體內(nèi)可表現(xiàn)出前列腺上皮管腔再生能力；他們進(jìn)一步利用條件性基因敲除系統(tǒng)，證明Luminal-C細(xì)胞可導(dǎo)致前列腺上皮內(nèi)瘤變（prostatic intraepithelial neoplasia， PIN），為L(zhǎng)uminal-C可能為前列腺腫瘤祖細(xì)胞提供了關(guān)鍵證據(jù)。另外，Ogawa等［67］使用CRISPR-Cas9技術(shù)通過(guò)同源重組破壞腫瘤抑制因子TP53的特定位點(diǎn)，通過(guò)演示顯微成像可觀察到正常的腦類器官轉(zhuǎn)化為具有侵襲性的類器官結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生。Bian團(tuán)隊(duì)［68］構(gòu)建了一例腦腫瘤類器官（neoCOR）模型，在該模型中，利用轉(zhuǎn)座子和CRISPR-Cas9技術(shù)將致癌突變引入經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來(lái)的正常腦類器官，體外再現(xiàn)了腦腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，并進(jìn)一步證明neoCOR模型適用于腫瘤生物學(xué)方面的研究，如侵襲性，以及在特定DNA畸變的情況下評(píng)估藥物效應(yīng)。Dekkers等［69］通過(guò)靶向敲除正常乳腺上皮類器官中4個(gè)乳腺癌相關(guān)腫瘤抑制基因（P53、PTEN、RB1、NF1），以模擬乳腺癌的發(fā)生過(guò)程。該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)在正常的乳腺類器官中，至少有三個(gè)腫瘤抑制基因同時(shí)失活才能驅(qū)動(dòng)腫瘤發(fā)生，展現(xiàn)了正常類器官結(jié)合CRISPR/Cas9基因編輯對(duì)了解腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素的重要應(yīng)用前景（圖2）。

圖2 腫瘤類器官在合成生物學(xué)中的應(yīng)用Fig. 2 Applications of tumor organoids in synthetic biology

過(guò)繼免疫治療（adoptive immunotherapy）的主要過(guò)程是將患者T細(xì)胞分離，在體外進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕蚧芈诽幚砗笾匦螺斎牖颊唧w內(nèi)，以達(dá)到治療癌癥的效果。經(jīng)過(guò)人工回路改造的T細(xì)胞表面表達(dá)一種嵌合抗原受體（CAR），可識(shí)別癌細(xì)胞表面特異性抗原并啟動(dòng)細(xì)胞殺傷效應(yīng)。Jacob等［70］利用膠質(zhì)母細(xì)胞瘤類器官庫(kù)與2173BBz CAR-T細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，提出了PDO為腫瘤體外測(cè)試CAR-T療法提供了可靠的臨床前模型。Schnalzger等［71］通過(guò)結(jié)腸腫瘤類器官評(píng)估了CAR-NK-92細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)腫瘤類器官的細(xì)胞毒性和療效，為CAR-T細(xì)胞毒性療法在實(shí)體瘤中的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了技術(shù)支持。Dijkstra等［53］將肺癌類器官與外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)出的腫瘤反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞群明顯擴(kuò)增，將腫瘤類器官與自體腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞群共培養(yǎng)，證明了腫瘤類器官可用于體外評(píng)價(jià)自體腫瘤反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷效率。黃衛(wèi)人等［72］證明了通過(guò)CAR-T細(xì)胞與患者來(lái)源的膀胱癌類器官共培養(yǎng)，可以實(shí)現(xiàn)靶向MUC1的CART細(xì)胞的免疫應(yīng)答，為改善膀胱癌和其他實(shí)體腫瘤的個(gè)性化免疫治療提供了新的見(jiàn)解。合成生物學(xué)技術(shù)為腫瘤疾病療法帶來(lái)了更多的可控性和智能性細(xì)胞藥物，與作為新一代腫瘤模型的腫瘤類器官相結(jié)合，不僅為合成生物學(xué)的跨學(xué)科交叉能力帶來(lái)了更多的可能性，也為臨床患者的免疫細(xì)胞藥物快速設(shè)計(jì)測(cè)試與高保真功能評(píng)估帶來(lái)了新的機(jī)遇。

光可提供能量并驅(qū)動(dòng)細(xì)胞代謝，使有機(jī)體能夠看到或感知到環(huán)境并做出適應(yīng)其生存的細(xì)胞活動(dòng)。將光遺傳學(xué)與合成生物學(xué)相結(jié)合，設(shè)計(jì)合成基于光控開(kāi)關(guān)的基因表達(dá)系統(tǒng)，可對(duì)細(xì)胞活動(dòng)進(jìn)行精確和無(wú)創(chuàng)的調(diào)節(jié)，光遺傳學(xué)工具已較廣泛地應(yīng)用于構(gòu)建干細(xì)胞來(lái)源的類器官［73-74］。Repina等［75］結(jié)合了光遺傳學(xué)刺激和單細(xì)胞成像方法研究人類胚胎干細(xì)胞自組織精確控制形態(tài)發(fā)生信號(hào)動(dòng)態(tài)，利用光遺傳系統(tǒng)，大范圍地激活標(biāo)準(zhǔn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路，高效地驅(qū)動(dòng)了3D培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞亞群中的Wnt信號(hào)，從而誘導(dǎo)分化、遷移和細(xì)胞分選。Legnini等［76］在人類神經(jīng)類器官模型中局部激活了Sonic Hedgehog（SHH）信號(hào)。高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和單細(xì)胞分析表明，這種局部誘導(dǎo)足以在三維空間生成空間分化模式的類器官，并提出將光遺傳學(xué)擾動(dòng)與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)合起來(lái)，可重新編程并研究類器官中的不同細(xì)胞的命運(yùn)和組織模式。因此，與在培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)因子相比，光遺傳學(xué)誘導(dǎo)可以以更可控的方式形成與人體組織結(jié)構(gòu)更相似的類器官模型，光遺傳學(xué)工具也將為理解器官組織形狀和機(jī)械傳導(dǎo)以及如何從干細(xì)胞中構(gòu)建腫瘤類器官提供新的途徑。

4 不足與展望

盡管過(guò)去十年的研究中，腫瘤類器官獨(dú)具優(yōu)勢(shì)且發(fā)展迅猛，但PDO仍存在許多問(wèn)題亟待解決。

4.1 效率

目前，構(gòu)建的腫瘤類器官主要來(lái)源于常見(jiàn)的和高度惡性腫瘤，因其組織更容易獲得，類器官庫(kù)建立的成功率較高。然而，PDO庫(kù)的構(gòu)建和擴(kuò)增效率在其他一些癌種中仍然很低，Gao等［42］報(bào)道了從活檢標(biāo)本和循環(huán)腫瘤細(xì)胞中構(gòu)建的前列腺癌類器官庫(kù)，轉(zhuǎn)移灶的前列腺腫瘤更容易被培養(yǎng)成類器官，而原發(fā)灶的前列腺腫瘤的培養(yǎng)成功率則不盡人意［77］，而利用活檢標(biāo)本和循環(huán)腫瘤細(xì)胞構(gòu)建類器官的總體成功率僅有15%～20%，這就使得整體的腫瘤類器官形成效率并不高。罕見(jiàn)的癌癥亞型和非上皮性腫瘤（如橫紋肌肉瘤）的研究較少，類器官構(gòu)建的效率也未可知。因此，探索PDO建立成功的決定因素對(duì)于提高類器官衍生和擴(kuò)增的效率是非常重要的。

4.2 微環(huán)境

目前采用基質(zhì)膠培養(yǎng)的PDO通常只含有腫瘤細(xì)胞，缺乏內(nèi)源性腫瘤相關(guān)基質(zhì)成分，限制了腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment， TME）驅(qū)動(dòng)癌癥發(fā)生發(fā)展和藥物敏感性機(jī)制的探索。雖然已經(jīng)設(shè)計(jì)出多種類器官與腫瘤基質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)模型，但其仍不能完全復(fù)制體內(nèi)腫瘤微環(huán)境。氣-液界面培養(yǎng)［78］、3D生物打印技術(shù)［79］、類器官芯片［80-81］等的出現(xiàn)與發(fā)展有助于我們體外重塑TME，進(jìn)一步探索其在腫瘤免疫學(xué)方面的應(yīng)用，并促進(jìn)個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展。

4.3 標(biāo)準(zhǔn)化

基于目前國(guó)內(nèi)外研究，不同團(tuán)隊(duì)常根據(jù)自身需求自制特定的條件培養(yǎng)基來(lái)降低實(shí)驗(yàn)成本，而腫瘤組織來(lái)源、后續(xù)處理、培養(yǎng)基配方和建立成功的標(biāo)準(zhǔn)缺乏明確的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，這必然會(huì)帶來(lái)不可控的實(shí)驗(yàn)室差異以及結(jié)果可重現(xiàn)性問(wèn)題。王樹(shù)斌等［59］制定了國(guó)內(nèi)第一個(gè)基于類器官指導(dǎo)腫瘤精準(zhǔn)藥物治療的專家共識(shí)，但共識(shí)尚處于初級(jí)階段，未來(lái)將根據(jù)臨床實(shí)踐不斷積累循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，逐步完善修訂。由此可見(jiàn)，PDO的標(biāo)準(zhǔn)化尚需全世界臨床醫(yī)生、生物學(xué)家的交流合作和共同努力。

4.4 自動(dòng)化

目前，腫瘤類器官培養(yǎng)及藥物敏感性等實(shí)驗(yàn)操作仍以手工為主，其缺點(diǎn)主要有以下幾個(gè)方面：①引入了不必要的人為因素；②提高了培養(yǎng)成本；③類器官擴(kuò)增、傳代速度慢；④實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性較差。微流控（microfluidics）是一種精確控制和操控微尺度流體，尤其特指亞微米結(jié)構(gòu)的技術(shù)，又稱其為芯片實(shí)驗(yàn)室（Lab-on-a-Chip）或微流控芯片技術(shù)。通過(guò)對(duì)微流體的精確操控有望改進(jìn)傳統(tǒng)人工培養(yǎng)方式［82］。Schuster等［83］建立了一個(gè)用于腫瘤類器官高通量組合藥物篩選的自動(dòng)化微流體平臺(tái)，通過(guò)對(duì)腫瘤類器官進(jìn)行單藥、聯(lián)合藥物篩選，可為每位患者制定出毒副作用更小的用藥方案。Bian等［84］利用人工智能技術(shù)建立了第一個(gè)用于類器官檢測(cè)和跟蹤的高通量類器官圖像數(shù)據(jù)集，表明通過(guò)監(jiān)測(cè)每個(gè)類器官生長(zhǎng)變化的顯微照片使得評(píng)估類器官活性成為可能。此外，微流控設(shè)備與類器官聯(lián)合建立的多器官平臺(tái)，在模擬藥物在體內(nèi)的代謝過(guò)程，進(jìn)行藥物療效、毒副作用及藥代動(dòng)力學(xué)研究方面［85］，提高了體外藥物篩選效率。然而，現(xiàn)在多器官聯(lián)合培養(yǎng)技術(shù)和方案還不夠成熟，未來(lái)還需朝著更高效、更具生理性的方向前進(jìn)。

4.5 精確度

大多數(shù)類器官的培養(yǎng)是根據(jù)該種類器官的培養(yǎng)條件選取，向培養(yǎng)基中添加適宜的生長(zhǎng)因子，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）抑制劑noggin、R-spondin、Wnt-3a等，在該種條件下培養(yǎng)的類器官生長(zhǎng)條件和生長(zhǎng)環(huán)境較為固定，最終形成的類器官并不能反映體內(nèi)真實(shí)的復(fù)雜空間幾何結(jié)構(gòu)。解決這些限制的一個(gè)方法是使用工程材料和設(shè)備，為類器官培養(yǎng)提供體內(nèi)存在的機(jī)械和空間環(huán)境條件。

合成生物學(xué)工程化細(xì)胞黏附可以用于克服類器官細(xì)胞群內(nèi)細(xì)胞-細(xì)胞內(nèi)聚性分布問(wèn)題，通過(guò)調(diào)節(jié)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞間的相互作用以及細(xì)胞的物理特性來(lái)提高不同類型類器官的形成效率［86-88］，合成細(xì)胞黏附分子的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的統(tǒng)一性指定了細(xì)胞間界面形態(tài)和力學(xué)，而不同的同型或異型細(xì)胞外相互作用結(jié)構(gòu)域各自規(guī)定了細(xì)胞之間的黏附性和緊密程度［89］。另外，可識(shí)別合成形態(tài)因子的人工合成受體激活特定細(xì)胞內(nèi)的特定的基因調(diào)控回路為構(gòu)建出包含多個(gè)不同表達(dá)域的類器官打開(kāi)了大門(mén)，合成的形態(tài)因子產(chǎn)生的擴(kuò)散及錨定密度可進(jìn)行更大范圍的控制，細(xì)胞通過(guò)感知特殊形態(tài)發(fā)生蛋白提供的位置信息來(lái)決定它們的命運(yùn)，使用單個(gè)或多個(gè)形態(tài)因子，并對(duì)細(xì)胞電路重新編程，可在體外誘導(dǎo)出空間上包含多個(gè)不同表達(dá)域的組織類器官。Trentesaux等［90］表明合成生物學(xué)可以提供獨(dú)特工具來(lái)重建空間和動(dòng)態(tài)信號(hào)，調(diào)控細(xì)胞間通信，作者主要回顧了五類人工合成工具：光遺傳/化學(xué)遺傳學(xué)工具、近分泌（短程）細(xì)胞間通信、遠(yuǎn)程細(xì)胞通信、細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞命運(yùn)開(kāi)關(guān)等，可讓我們預(yù)測(cè)和設(shè)計(jì)更為復(fù)雜的組織形態(tài)和功能特征，以及培養(yǎng)與體內(nèi)器官功能更貼近的類器官。通過(guò)合成生物學(xué)新興工具構(gòu)建出的類器官具有更高的復(fù)雜性和可重復(fù)性，可成為更好的疾病模型，也可以進(jìn)行更為有效的體外藥物預(yù)測(cè)試驗(yàn)。光遺傳學(xué)工具已運(yùn)用到多種正常類器官的誘導(dǎo)分化方案中，原則上使用該工具可以設(shè)計(jì)出采用多種構(gòu)象的信號(hào)中心，并為任何組織類器官提供一系列信號(hào)，這些研究為探索光操縱腫瘤類器官的定向構(gòu)建和培養(yǎng)的新模式打開(kāi)了大門(mén)。

盡管腫瘤類器官存在這些局限性，但不同癌種類器官生物庫(kù)的建立及與合成生物學(xué)工具等先進(jìn)技術(shù)結(jié)合（如微流控芯片、CRISPR-Cas9系統(tǒng)等），在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和臨床個(gè)體化治療上都扮演著越來(lái)越重要的角色，腫瘤類器官作為患者以身試藥的良好體外替代模型，未來(lái)將在指導(dǎo)每位患者用藥和優(yōu)化患者治療策略中起到舉足輕重的作用。