人工調(diào)控受體聚集的化學(xué)合成生物學(xué)策略及應(yīng)用

袁燕燕，陳慧芳，楊思慧，王洪輝，聶舟

（湖南大學(xué)，化學(xué)生物傳感與化學(xué)計量學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，化學(xué)化工學(xué)院，生物學(xué)院，生物大分子化學(xué)生物學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410082）

細(xì)胞膜受體是一種重要的膜蛋白，能夠介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境之間的信號傳遞。受體通過其胞外結(jié)構(gòu)感知胞外化學(xué)或物理刺激，隨后將這一信號通過跨膜結(jié)構(gòu)域傳遞并放大信號至細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞做出相應(yīng)的決策。在生理?xiàng)l件下，受體信號激活的穩(wěn)態(tài)控制在細(xì)胞增殖、干細(xì)胞分化、傷口修復(fù)和免疫激活等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用［1］。同時，膜蛋白受體的基因突變可能引起異常激活或抑制的細(xì)胞信號通路，參與癌癥、糖尿病和動脈硬化等多種疾病的病理發(fā)生過程［2］?；诖耍?xì)胞膜受體已被廣泛認(rèn)為是免疫調(diào)節(jié)和癌癥治療的重要靶點(diǎn)。

細(xì)胞膜受體聚集是調(diào)控細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子過程［3］。包括受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases， RTK）、整合素受體和免疫細(xì)胞受體（T cell receptor， TCR）在內(nèi)的多種受體家族在受到細(xì)胞外刺激后，會經(jīng)歷從自由擴(kuò)散的單體到流動性較低的納米簇，再到高階低聚物的轉(zhuǎn)變［4］。最新研究表明，由多價分子之間弱相互作用驅(qū)動的液-液相分離（liquid-liquid phase separation，LLPS）可能是細(xì)胞膜受體組裝成簇的一般物理化學(xué)機(jī)制［5-6］。在生理系統(tǒng)中，液-液相分離可以濃縮特定的蛋白質(zhì)和核酸集合，形成生物分子縮合物，最終通過增加蛋白質(zhì)結(jié)合親和力和調(diào)節(jié)局部生物化學(xué)環(huán)境，來調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，細(xì)胞表面受體聚集是精準(zhǔn)識別細(xì)胞外信號和啟動內(nèi)部信號級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵分子機(jī)制。鑒于受體聚集介導(dǎo)的細(xì)胞功能與健康和疾病的廣泛相關(guān)性，研究人員一直致力于探究細(xì)胞受體信號傳遞和激活的物理和化學(xué)機(jī)制，并基于相關(guān)科學(xué)機(jī)理開發(fā)多樣的分子工程策略，用于操縱受體聚集激活和相關(guān)細(xì)胞功能（圖1）。

圖1 受體聚集調(diào)節(jié)下游信號Fig.1 Regulation of the downstream signaling by cell surface receptor clustering

在生理機(jī)制中，配體-受體相互作用是受體聚集激活的關(guān)鍵觸發(fā)事件。信號配體作為細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的第一信使，是傳遞環(huán)境刺激給細(xì)胞的關(guān)鍵生物化學(xué)物質(zhì)。受體的天然蛋白配體主要包括細(xì)胞因子、生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等［7-9］。這些信號配體通過旁分泌、內(nèi)分泌和神經(jīng)傳導(dǎo)機(jī)制對靶受體發(fā)出刺激信號。細(xì)胞膜界面上發(fā)生的配體-受體的多價相互作用通過與細(xì)胞膜的流動性結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞表面受體的重排和共定位，從而控制下游生物學(xué)效應(yīng)。然而，天然配體存在多效性，可能與不同受體結(jié)合引起細(xì)胞信號，從而容易引起非靶向毒性等副作用，同時，基于天然配體的策略難以對細(xì)胞信號進(jìn)行人工編程。因此，亟需開發(fā)基于理性設(shè)計的定制細(xì)胞受體聚集激活分子工程工具，使受體能夠自主感知用戶指定的刺激信號，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的功能和命運(yùn)精確調(diào)控。

隨著合成生物學(xué)和細(xì)胞工程學(xué)的發(fā)展，基于基因工程的合成受體平臺和嵌合受體已經(jīng)成為一種有效的分子工程手段，已廣泛用于實(shí)現(xiàn)對定制受體激活和下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的合成控制。Lim等［10］通過DNA重組技術(shù)，全新重構(gòu)受體的細(xì)胞外傳感器模塊和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄模塊，實(shí)現(xiàn)了對Notch信號途徑的控制。他們通過合成Notch（synthetic Notch receptor， synNotch）途徑可以在不同的哺乳動物細(xì)胞類型中驅(qū)動用戶定義的生物學(xué)功能。Roybal等［11］近期報道了一種系統(tǒng)性策略，從頭開始重新設(shè)計synNotch受體，開發(fā)了一類合成膜內(nèi)蛋白水解受體（synthetic intramembrane proteolysis receptor，SNIPR）。這些受體是完全人源化且具有可定制的傳感和轉(zhuǎn)錄能力，有效降低了原始synNotch受體免疫原性的風(fēng)險，進(jìn)一步拓展了合成受體在細(xì)胞療法中的應(yīng)用。

通過基因編碼構(gòu)建的合成受體，研究人員已經(jīng)實(shí)現(xiàn)對新功能細(xì)胞的人工操縱，為醫(yī)學(xué)帶來了全新變革，揭示了一種實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)和個性化細(xì)胞治療的新途徑。然而，基于合成受體的改造策略仍然存在一些固有挑戰(zhàn)。例如，遺傳改造可能會干擾體內(nèi)其他內(nèi)源性生物過程，而且難以保證受體的穩(wěn)定表達(dá)以及嵌合蛋白結(jié)構(gòu)的正確折疊［12］。此外，對獨(dú)特的蛋白質(zhì)模塊進(jìn)行基因編碼，使其能夠?qū)τ脩舳x的物理刺激（如光、磁場和熱變化）產(chǎn)生響應(yīng)仍然存在巨大的困難。為了彌補(bǔ)基因工程構(gòu)建合成受體策略的不足，研究人員一直致力于開發(fā)非遺傳調(diào)控受體聚集的新方法，集中解決以下三方面的問題：①精確控制受體聚集的納米級分辨率，以控制細(xì)胞黏附、增殖、遷移和分化等細(xì)胞功能；②時空分辨的可控受體激活，以解析細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的時間和空間復(fù)雜性；③高細(xì)胞選擇性的受體聚集，以提高復(fù)雜環(huán)境中的靶向操控細(xì)胞的精確度。針對上述目標(biāo)，多種模塊化的分子工程策略已經(jīng)被開發(fā)出來精準(zhǔn)操控受體的聚集和激活，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定制的細(xì)胞功能和命運(yùn)。

1 受體聚集調(diào)控的功能元件

在合成生物學(xué)的大框架內(nèi)，化學(xué)合成生物學(xué)方法為我們研究生命活動提供了一系列新穎有趣的視角?；瘜W(xué)合成生物學(xué)涉及合成新生物大分子結(jié)構(gòu)（如蛋白質(zhì)和核酸）和最小生命形式（如半合成最小細(xì)胞）［13-14］，旨在運(yùn)用化學(xué)思維、理論、方法和技術(shù)手段研究生命現(xiàn)象和生命過程，并精準(zhǔn)地識別、修飾和調(diào)控生命體系中的分子。與傳統(tǒng)合成生物學(xué)的依賴于基因工程技術(shù)不同，化學(xué)合成生物學(xué)策略更強(qiáng)調(diào)化學(xué)分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)反應(yīng)程序的理性設(shè)計和模塊化操控原則。近年來，化學(xué)合成生物學(xué)充分發(fā)揮化學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的跨學(xué)科優(yōu)勢，為開發(fā)具有智能設(shè)計、易用性和高生物相容性的人工受體激活工程策略提供了重要功能元件和交叉融合技術(shù)。目前，基于化學(xué)合成生物學(xué)的受體聚集分子調(diào)控元件可以分為以下四個主要類型：①特異識別和結(jié)合受體的識別元件；②可編程的空間組織元件；③可重構(gòu)的動態(tài)激活元件；④選擇性受體操控元件。本文對這些不同功能元件的常用工具、設(shè)計原則和開發(fā)策略進(jìn)行了歸納和總結(jié)（圖2）。

圖2 受體聚集工程中的調(diào)控元件Fig. 2 Modules in the receptor clustering engineering

1.1 受體識別分子元件

人工受體激活的元件工程主要依賴于細(xì)胞表面受體的含量，因此開發(fā)能夠特異識別和結(jié)合受體的識別元件是進(jìn)行細(xì)胞受體操作的先決條件。目前，已經(jīng)有多種成熟的識別元件可供選擇，包括基于多肽類如抗體、工程化多肽和環(huán)肽等的受體識別元件，以及基于核酸類的特異性適配體識別元件。隨著各種篩選技術(shù)的不斷發(fā)展，受體識別元件的資源也變得越來越豐富，使人們可以更有效地制定受體聚集策略。

1.1.1 基于多肽類的受體識別元件

（1）天然蛋白配體改造策略

對蛋白質(zhì)配體進(jìn)行工程改造是一種直觀而實(shí)用的方法，可得到具有改進(jìn)或新功能的受體識別元件。改造配體可以產(chǎn)生與天然配體誘導(dǎo)的生物輸出相似或不同的生物輸出。目前，改造配體的研究主要集中于通過調(diào)整受體-配體復(fù)合物的穩(wěn)定性、結(jié)合親和力和/或幾何形狀等方式來獲得具有調(diào)節(jié)下游信號輸出和靶向特定細(xì)胞的新型結(jié)合配體［15-17］。改造配體的一般策略是通過定向進(jìn)化實(shí)現(xiàn)的，這個過程包括隨機(jī)誘變和/或基因重組生成多樣化的變體庫，進(jìn)行多輪篩選，直到得到具有所需分子性質(zhì)的突變體［18］。與自然進(jìn)化以生存和繁殖為目標(biāo)不同，定向進(jìn)化采用更高的突變率和重組率去篩選所需生物功能。目前，應(yīng)用該策略已經(jīng)鑒定出了白細(xì)胞介素-2（interleukin-2， IL-2）［19］、干細(xì)胞因子（stem cell factor， SCF）［20］和促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin， EPO）［21］等細(xì)胞因子的合成突變體，這些突變體對其受體具有部分和偏倚的信號特性。改造配體根據(jù)其功能可以分為受體激動劑、拮抗劑或抑制劑，并且可以用作藥物候選物以及研究復(fù)雜細(xì)胞功能的分子機(jī)制的化學(xué)工具。

（2）文庫篩選策略

大多數(shù)天然配體都是由DNA序列編碼的功能蛋白。隨著各種蛋白質(zhì)/多肽合成技術(shù)日趨成熟，人們已經(jīng)篩選出了多種能夠跟受體高親和力結(jié)合的蛋白質(zhì)/多肽。其中，單克隆抗體以其高度特異性、高親和力和高穩(wěn)定性成為靶向細(xì)胞表面受體的一種特別優(yōu)越的識別元件。已有一系列針對RTK、人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor 2， HER2）和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor， EGFR）的抗體在臨床中進(jìn)行了研究，有望運(yùn)用于疾病治療［22］。抗體篩選技術(shù)中，雜交瘤技術(shù)較為成熟。該技術(shù)首先將小鼠產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)而對其進(jìn)行篩選和分離，鑒定并獲得可產(chǎn)生單抗的細(xì)胞系［23］。盡管該技術(shù)可以生產(chǎn)大量單克隆抗體，但耗時長、樣本消耗大和操作步驟煩瑣限制了其使用。在20世紀(jì)80年代中期，各種抗體分子工程技術(shù)得到廣泛應(yīng)用，如噬菌體抗體庫、核糖體抗體庫、酵母表面展示和轉(zhuǎn)基因小鼠，這些技術(shù)也成功地應(yīng)用于單克隆抗體的篩選［24］。隨著時間的推移，這些技術(shù)逐步推動了嵌合和人源化單克隆抗體的發(fā)展［25］，從而顯著提高了抗體的靶向效率并降低了其免疫原性。

近年來，工程多肽已成為一類極具潛力的受體識別分子元件，具有媲美抗體的選擇性和親和力，且尺寸較小，易于生產(chǎn)和修飾。氨基酸配方或化學(xué)修飾延長半衰期技術(shù)的突破，極大地促進(jìn)了工程多肽在生物應(yīng)用方面的發(fā)展。通過體內(nèi)或體外展示技術(shù)，工程多肽配體的分子篩選取得了許多進(jìn)展。例如，通過噬菌體展示和mRNA展示，研究者們已經(jīng)篩選得到多種具有亞微摩爾親和力的工程多肽配體［26］，這些配體對靶標(biāo)受體具有優(yōu)異的親和力和特異性。這些方法可以針對不同類型的受體進(jìn)行設(shè)計和優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)更加精準(zhǔn)的調(diào)控。此外，這些多肽配體可以直接靶向細(xì)胞表面受體，實(shí)現(xiàn)特異性治療，也可以作為藥物載體，搭載其他藥物分子，提高藥物的靶向性和生物利用度。

與線性的工程多肽相比，環(huán)狀肽由于其可調(diào)控的剛性、穩(wěn)定性和藥代動力學(xué)特性近期受到特別關(guān)注。為了得到具有高親和力的環(huán)肽配體，目前已經(jīng)發(fā)展出多種篩選方法。與基于細(xì)胞表面展示的技術(shù)相比，隨機(jī)非標(biāo)準(zhǔn)肽集成發(fā)現(xiàn)（random nonstandard peptides integrated discovery， RaPID）系統(tǒng)具有快速高效、可定制、適用于多種靶標(biāo)、篩選范圍廣等特點(diǎn)［27］。該系統(tǒng)使用靈活的體外翻譯系統(tǒng)制備隨機(jī)肽庫，并通過mRNA展示技術(shù)將表達(dá)的多肽與其同源mRNA融合構(gòu)建肽-mRNA融合文庫，最終篩選高親和力的大環(huán)肽。此外，該系統(tǒng)還可用于大環(huán)肽的后修飾及功能分析，為開發(fā)更加有效的環(huán)肽藥物提供了新思路。通過RaPID系統(tǒng)，Takagi等［28］已經(jīng)從由1012個序列組成的隨機(jī)序列庫中篩選獲得了針對各種靶蛋白的大環(huán)肽結(jié)合劑。

（3）多肽識別元件從頭設(shè)計策略

定向進(jìn)化技術(shù)以天然存在的蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)，通過基因突變的方法產(chǎn)生新的結(jié)合蛋白變體。雖然這種方法功能強(qiáng)大，但難以改變起始蛋白的整體形狀，通常只能對采樣蛋白序列空間進(jìn)行微調(diào)［29］。相對而言，基于計算生物學(xué)的從頭蛋白質(zhì)設(shè)計策略可以根據(jù)所需功能及精確幾何形狀裁剪出無限數(shù)量的蛋白質(zhì)，得到具有預(yù)定結(jié)構(gòu)和功能的全新設(shè)計配體，而且通常具有更優(yōu)越的熱變性和穩(wěn)定性［30］。目前，蛋白從頭設(shè)計的主要方法是基于Rosetta算法［31-32］。該算法通過參數(shù)化改變現(xiàn)有結(jié)構(gòu)模板之間的相對幾何形狀來構(gòu)建新的骨架，以設(shè)計螺旋束［33-34］或重復(fù)蛋白質(zhì)［35］或通過從現(xiàn)有結(jié)構(gòu)組裝肽片段構(gòu)建新的主干。基于Rosetta算法的從頭設(shè)計往往需要在一定程度上依賴已知蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)作為模板，然后通過改變其側(cè)鏈和序列來實(shí)現(xiàn)特定的功能和結(jié)構(gòu)。近期，研究報道了一種名為SCUBA（for side chain-unknown backbone arrangement）的統(tǒng)計模型，為無模板蛋白質(zhì)設(shè)計工作提供了新的可能性［36］。它將側(cè)鏈排列與主鏈的幾何形狀聯(lián)系起來，從而可在主鏈結(jié)構(gòu)空間中搜索側(cè)鏈排列。通過這種方法，人們可以探索任意蛋白質(zhì)主鏈結(jié)構(gòu)，然后在此基礎(chǔ)上填充序列，大大提高了從頭設(shè)計蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)多樣性，同時也使蛋白質(zhì)設(shè)計更加靈活。Baker等［37］已經(jīng)從靶標(biāo)結(jié)構(gòu)開始從頭設(shè)計了針對酪氨酸激酶（tyrosine kinase， TrkA）、血小板衍生生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor， PDGFR）、EGFR、胰島素受體（insulin receptor， IR）等受體的蛋白識別元件，結(jié)合親和力最高能夠達(dá)到860 nmol/L。進(jìn)一步，Baker等［38］還開發(fā)了一種用于從頭設(shè)計與目標(biāo)蛋白表面高親和力結(jié)合的環(huán)狀多肽的通用計算方法“錨”擴(kuò)展（anchor extension）。該方法利用已知能夠與目標(biāo)表面結(jié)合的分子中的一個特定官能團(tuán)作為錨點(diǎn)，進(jìn)一步通過引入額外的不同類型的相互作用來增強(qiáng)環(huán)肽與目標(biāo)之間的結(jié)合力，從而實(shí)現(xiàn)靈活而高效的環(huán)肽設(shè)計?；凇板^”擴(kuò)展方法，研究人員從頭設(shè)計了組蛋白去乙?；?（histone deacetylase-2， HDAC2）和組蛋白去乙?；?（histone deacetylase-6， HDAC6）的結(jié)合配體。這些配體具有與許多酶抑制劑相媲美的高親和力，并且在體外和體內(nèi)都表現(xiàn)出很好的生物活性。

1.1.2 基于核酸類的受體識別元件

核酸適配體一直被視為抗體的合成替代物，可用作核酸納米結(jié)構(gòu)中的分子識別基序。各種類型的適配體已作為識別元件在生物分析中發(fā)揮重要作用。與抗體相比，適配體更加穩(wěn)定，對還原條件和熱變性更具有抵抗力。典型的適配體短于40個核苷酸，易于化學(xué)合成和高質(zhì)量生產(chǎn)。短的寡核苷酸鏈通過折疊成獨(dú)特的三級構(gòu)象，使適配體能夠通過包裹或配合目標(biāo)分子的表面結(jié)構(gòu)與目標(biāo)分子相互作用［39］。核酸適配體的獲得可以通過“指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化”（systematic evolution of ligands by exponential enrichment， SELEX）技術(shù)進(jìn)行篩選。這種技術(shù)利用受體的重組胞外結(jié)構(gòu)域?yàn)榕潴w，通過隨機(jī)單鏈DNA文庫進(jìn)行篩選［40］。在此過程中，特異性的DNA序列與目標(biāo)蛋白共同孵育富集，并在體外通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行擴(kuò)增。經(jīng)過多輪篩選和擴(kuò)增，最終能夠獲得與目標(biāo)受體具有高親和力的適配體序列［41］。

另一種新興的核酸適配體篩選方法是細(xì)胞SELEX技術(shù)。與蛋白SELEX技術(shù)不同，該適配體和受體在生理?xiàng)l件下相互作用并富集，使得篩選出的適配體能夠更好地適應(yīng)復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境。在這種策略中，研究人員直接使用單鏈DNA文庫對受體過表達(dá)的活細(xì)胞進(jìn)行篩選，經(jīng)過幾輪篩選和擴(kuò)增，篩選出的適配體可以通過質(zhì)譜等技術(shù)進(jìn)行鑒定，從而確定其與目標(biāo)分子的結(jié)合情況［42］。通過在生理?xiàng)l件下進(jìn)行篩選，能夠更好地模擬細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境，提高適配體的特異性和親和力。因此，細(xì)胞SELEX技術(shù)在研究細(xì)胞和分子相互作用方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

通過蛋白SELEX和細(xì)胞SELEX技術(shù)，目前已經(jīng)成功篩選獲得大量具有特異性識別細(xì)胞表面受體（RTK［43］、整合素［44］和TCR［45］）的核酸適配體?；趩捂満怂岬姆肿犹匦?，這些特異性和高親和力結(jié)合受體的適配體元件具有多種優(yōu)點(diǎn)，例如容易合成、高穩(wěn)定性、容易定制化等，為基于核酸分子的受體聚集控制工程策略提供了優(yōu)秀的分子識別模塊。

1.2 受體聚集的空間組織元件

受體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分布對受體信號激活至關(guān)重要，理想的受體操作工程應(yīng)該能夠以納米級分辨率精確控制受體的空間排列，并具有高度的可編程性。因此，需要開發(fā)可編程的受體空間組織元件，從而靈活控制細(xì)胞表面受體聚集的納米尺度空間組織，使其執(zhí)行復(fù)雜和協(xié)調(diào)的功能。目前，常用的四種策略包括：基于從頭設(shè)計蛋白框架的拓?fù)淇刂撇呗?，通過從頭設(shè)計蛋白框架，精確地控制蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，使其能夠精準(zhǔn)地識別目標(biāo)受體；基于DNA納米結(jié)構(gòu)的多價控制策略，利用雙鏈DNA納米結(jié)構(gòu)的特異性識別能力，通過控制受體在DNA結(jié)構(gòu)表面上的分布實(shí)現(xiàn)對受體的空間控制；基于流動脂膜展示的工程策略，利用脂質(zhì)流動膜上修飾的特異性配體的空間排列，精確控制受體分布；基于水凝膠的立體空間控制策略，通過與特定水凝膠支架排布的配體空間相互作用控制受體聚集激活（表1）。

表1 受體聚集空間組織元件的納米精度比較Table 1 Comparison for the spatial organization elements of cell surface receptors at of nanometer scale

1.2.1 基于從頭設(shè)計蛋白框架的拓?fù)淇刂撇呗?/p>

雖然許多人工蛋白質(zhì)/多肽可以直接作為替代細(xì)胞因子配體，但普遍缺乏對單體之間精確幾何結(jié)構(gòu)或距離的靈活控制。隨著蛋白質(zhì)從頭設(shè)計技術(shù)的發(fā)展，人們能夠?qū)⒍鄠€蛋白質(zhì)域組合在一起，通過控制它們之間的相對位置和角度，或通過設(shè)計蛋白質(zhì)分子間的相互作用，使之形成特定的二維、三維結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)對受體空間分布的精確控制。

Baker和Garcia等［50］基于蛋白質(zhì)結(jié)合支架技術(shù)（designed ankyrin repeat protein scaffold， DARPin）創(chuàng)造了一個自組裝的、剛性連接的二聚體支架。該支架能夠精確控制二聚體復(fù)合物中受體胞外結(jié)構(gòu)域的相對方向。通過DARPin激動劑的角度和距離參數(shù)的系統(tǒng)變化，他們成功實(shí)現(xiàn)了在造血的特定階段誘導(dǎo)紅細(xì)胞生成素受體（erythropoietin receptor， EPOR）信號部分和偏向激動。近期，Baker等［46］報道了一種蛋白籠策略，構(gòu)建了精確幾何形狀和組成的多價位抗體型蛋白質(zhì)納米顆粒［圖3（a）］。該策略通過將抗體Fc結(jié)合蛋白、單體螺旋連接體和環(huán)狀低聚物三種類型的“構(gòu)件”蛋白硬性融合，成功地創(chuàng)建了包括二面體、四面體、八面體和二十面體在內(nèi)的8個抗體納米籠結(jié)構(gòu)。與游離抗體或Fc融合蛋白相比，這些針對細(xì)胞表面受體的抗體納米籠表現(xiàn)出增強(qiáng)的受體聚集信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

圖3 受體聚集的空間組織元件Fig. 3 Spatial organization elements of cell surface receptor clustering

1.2.2 基于DNA納米結(jié)構(gòu)的多價控制策略

DNA分子具有Watson-Crick堿基配對特異性和可預(yù)測性，使其成為一種強(qiáng)大的可編程分子材料，用于設(shè)計高空間分辨率的納米結(jié)構(gòu)［51］。DNA雜交雙鏈的堿基配對序列依賴性和高選擇性雜交賦予它精確的編碼特性。因此，DNA分子的自組裝特性能夠以高度可控、可尋址和功能化的方式制造DNA納米結(jié)構(gòu)?；贒NA架構(gòu)的多價控制和尺寸控制已成為空間組織元件設(shè)計的一種更加簡單易行的方法。由于每個寡核苷酸鏈在納米結(jié)構(gòu)中的位置都是通過設(shè)計已知的，因此可以修改特定的單條鏈，使納米結(jié)構(gòu)具有特定的功能［52］。這一特征使得DNA納米結(jié)構(gòu)能夠充當(dāng)具有特定價態(tài)、間距和化學(xué)計量比的生物分子的空間圖案，從而精確地重編程細(xì)胞表面受體的納米級分布和幾何形狀。

受遺傳重組過程中的天然可移動Holliday連接的啟發(fā)，1982年Seeman［53］首次使用不可移動的四臂連接構(gòu)建DNA復(fù)合體，并設(shè)計了具有雙交叉的剛性DNA塊以及多臂基序。此外，利用不同的DNA“瓦片”作為構(gòu)建塊可以制造更多復(fù)雜的DNA納米結(jié)構(gòu)，包括一維納米管、二維陣列，甚至三維結(jié)構(gòu)［54］。同時，DNA折紙策略利用病毒DNA M13mp18（一種含有7249個核苷酸的單鏈DNA）以及數(shù)百條短鏈，形成具有明確形狀的離散納米結(jié)構(gòu)，如正方形、三角形和立方體［55］。值得注意的是，Yin等［56］提出了單鏈瓦片自組裝策略（single-stranded tile， SST），并從含有四個域的單鏈DNA“瓦片”中構(gòu)建了復(fù)雜的二維DNA晶格。此外，DNA納米結(jié)構(gòu)構(gòu)建方法還被擴(kuò)展到具有任意三維形狀的各種復(fù)雜離散結(jié)構(gòu)，例如球殼和納米管等［57］。

通過將可控數(shù)量的所需識別元件定制的DNA鏈插入DNA納米結(jié)構(gòu)中，不僅可以準(zhǔn)確量化配體的數(shù)量，還可以人為定義不同配體的數(shù)比和分布模式，以實(shí)現(xiàn)納米級受體的化學(xué)計量和空間控制［58］?；贒NA折紙結(jié)構(gòu)，研究者們已經(jīng)開發(fā)了具有精確ephrin-A5配體定位的“納米卡尺”［47］以及具有可定義的化學(xué)計量、化合價適配體的DNA折紙模板適體納米陣列（DNA origami-templated aptamer nanoarray， DOTA）［59］［圖3（b）］，成功實(shí)現(xiàn)了對EphA2受體、肝細(xì)胞生長因子受體（Met）空間聚集控制。這些工作表明，基于DNA納米結(jié)構(gòu)的配體展示非常有希望以定制的納米尺度分辨率調(diào)節(jié)受體，從而提高我們對配體-受體介導(dǎo)的信號通路機(jī)制的理解。

1.2.3 基于流動脂膜展示的工程策略

基于流動脂膜界面展示的工程策略也是一種常用的方法。流動脂膜包括天然或人工產(chǎn)生的囊泡以及支持的脂質(zhì)雙層（supported lipid bilayer，SLB）。囊泡是生物活性分子的重要載體，具有高生物相容性、低毒性、低免疫原性等獨(dú)特優(yōu)勢，常用于基因和藥物遞送領(lǐng)域［60］，被廣泛認(rèn)為是下一代治療載體。值得注意的是，囊泡還具有易于表面工程化的優(yōu)勢。通過在囊泡表面修飾特異性配體，不僅可以實(shí)現(xiàn)靶向特定細(xì)胞或器官，還能用于促進(jìn)靶標(biāo)細(xì)胞膜受體的聚集［圖3（c）］，調(diào)控細(xì)胞信號傳遞和細(xì)胞表型［61］。研究者通常使用轉(zhuǎn)染、逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒感染細(xì)胞，為囊泡配備靶向肽或抗體，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)其對特異性受體的靶向結(jié)合和激活。例如Kuroda等［62］將PDGFR的跨膜結(jié)構(gòu)域，融合了與EGFR靶向肽的序列，從而使囊泡可與EGFR受體特異性結(jié)合。相對而言，化學(xué)修飾是更加簡單而有效的方法，可以通過共價鍵、PEG衍生物、點(diǎn)擊化學(xué)技術(shù)和利用連接酶等修飾將配體或藥物錨定在囊泡表面［63］。相比于遺傳修飾方法僅能在囊泡展示蛋白質(zhì)或肽，化學(xué)修飾技術(shù)適用于所有類型的分子，例如核酸適配體［64］，更具有廣泛的應(yīng)用范圍。

由于囊泡的尺寸和形狀難以精確控制，研究者還開發(fā)了人工SLB策略，它是在平面玻璃基板上自組裝的仿生磷脂膜。作為一個簡單的細(xì)胞膜模型系統(tǒng)，SLB不僅囊括了細(xì)胞膜的關(guān)鍵特征，如維度和橫向遷移率。通過先進(jìn)的光學(xué)工具，研究者還可以對細(xì)胞膜表面的反應(yīng)進(jìn)行高時空分辨率的探究［65］。研究者通過摻入功能化脂質(zhì)的可控部分來對SLB組成進(jìn)行修飾，進(jìn)而精確控制在界面處固定多種配體和受體，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞膜受體聚集分子過程的解析［66］。例如，研究人員已經(jīng)應(yīng)用SLB策略探究了人乳腺癌細(xì)胞的膜受體EphA2與修飾ephrin-A1配體的SLB的相互作用過程和生物學(xué)意義［67］。最近，Wind等［48］通過在SLB平臺上合理控制修飾配體簇的金納米粒子的幾何定位，揭示了配體分布的橫向和縱向幾何距離對TCR聚集激活的控制。該方法不僅能夠研究受體-配體相互作用，還能指導(dǎo)與配體密度和細(xì)胞免疫相關(guān)的細(xì)胞行為。

1.2.4 基于水凝膠的立體空間控制策略

水凝膠是通過共價鍵或非共價相互作用形成的三維交聯(lián)分子網(wǎng)絡(luò)，組成成分明確，并且可以獨(dú)立調(diào)節(jié)基質(zhì)彈性、配體密度和孔隙率等物理和化學(xué)性質(zhì)［68］。因此，水凝膠已成為一種新興的工具，可用于影響立體空間內(nèi)的細(xì)胞受體聚集狀態(tài)，操控細(xì)胞命運(yùn)和行為。研究表明，整合素受體（例如α3β1［69］）、細(xì)胞膜結(jié)合糖蛋白（例如CD44［70］）和受體酪氨酸激酶（例如DDR1［71］）等可以與特定水凝膠支架排布的配體空間相互作用，控制神經(jīng)細(xì)胞或者肝臟上皮樣細(xì)胞的命運(yùn)［圖3（d）］。進(jìn)一步，Bian等［72］構(gòu)建了基于納米凝膠的刺激響應(yīng)動態(tài)調(diào)節(jié)器，研究了兩種模型配體的近端共表達(dá)對干細(xì)胞受體激活的潛在協(xié)同作用。此外，基于水凝膠的受體空間控制策略可以有效分離基質(zhì)剛度和表面化學(xué)的影響。Ding等［49］將Arg-Gly-Asp（RGD）肽以明確的納米陣列形式共價結(jié)合到聚乙二醇水凝膠表面，獨(dú)立考察了細(xì)胞黏附配體的基質(zhì)剛度和納米級空間組織對受體激活誘導(dǎo)的干細(xì)胞分化的影響，結(jié)果顯示基質(zhì)剛度和細(xì)胞黏附配體的空間分布都是干細(xì)胞微環(huán)境中獨(dú)立且有效的重要調(diào)節(jié)劑。

1.3 受體聚集動態(tài)控制策略

配體誘導(dǎo)的受體激活是一個高度動態(tài)和有序的分子過程。開發(fā)可重構(gòu)的動態(tài)激活控制元件，能夠通過用戶定義方式可逆地控制受體的狀態(tài)。為了實(shí)現(xiàn)對受體聚集形成的動態(tài)調(diào)節(jié)，研究者們發(fā)展了多種方法，包括化學(xué)誘導(dǎo)二聚（chemically induced dimerization， CID）和基于DNA鏈取代反應(yīng)的時間控制模塊。這些策略可以通過控制化學(xué)反應(yīng)的時間和空間位置，實(shí)現(xiàn)受體聚集的動態(tài)調(diào)控。此外，物理操作技術(shù)，如光調(diào)控、磁場調(diào)控和電場調(diào)控等方法也可用于時空分辨的受體操控。

1.3.1 化學(xué)誘導(dǎo)二聚策略

化學(xué)誘導(dǎo)二聚系統(tǒng)（CID）已經(jīng)成為了一種細(xì)胞工程的重要的工具，被用于高度亞細(xì)胞定位和高度時間分辨的目標(biāo)分子操縱［73］。該技術(shù)為在有限區(qū)域內(nèi)動態(tài)激活特定受體信號分子提供了有效路徑，也為研究特定生物學(xué)過程創(chuàng)造了新的可能性。在一個典型的CID系統(tǒng)中，添加化學(xué)二聚體后，誘導(dǎo)的二聚體可以通過增加某個細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)的有效濃度，使兩個先前分散的蛋白質(zhì)化學(xué)誘導(dǎo)接近［74］。這個過程可以用于激活或控制生物事件，例如細(xì)胞的增殖、分化和死亡。1993年，Crabtree等［75］提出了由小分子引發(fā)的化學(xué)誘導(dǎo)二聚的概念，當(dāng)FKBP與小分子配體結(jié)合后，F(xiàn)KBP通過二聚將其所連接的蛋白質(zhì)聚集在一起。為了減少非靶向效應(yīng)和改善生物相容性，研究者們已經(jīng)開發(fā)出多種正交蛋白/小分子對，大大擴(kuò)展了小分子響應(yīng)的化學(xué)誘導(dǎo)二聚工具包［76］，如Lim等［77］使用了FKBP結(jié)構(gòu)域和FKBP-雷帕霉素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（FRB*）的T2089L突變體，成功控制了合成嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor， CAR）的聚集［圖4（a）］。此外，CID系統(tǒng)的反應(yīng)時間通常在幾秒鐘到幾分鐘之間，這種快速響應(yīng)特性使得CID技術(shù)被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)定位等生物過程。最新的研究顯示，在同一細(xì)胞區(qū)域內(nèi)可以同時整合多個CID系統(tǒng)，用于多個受體響應(yīng)不同輸入信號分子的調(diào)節(jié)操控［73］。

圖4 受體聚集動態(tài)控制策略Fig. 4 Dynamic control strategies for cell surface receptor clustering

化學(xué)誘導(dǎo)二聚策略在調(diào)控受體方面具有巨大潛力。然而，目前大多數(shù)基于CID系統(tǒng)的受體操控仍需要利用基因工程技術(shù)重組嵌合蛋白受體。本文作者課題組［78］首次提出了一種非遺傳的DNA介導(dǎo)化學(xué)誘導(dǎo)二聚化（DNA-mediated chemically induced dimerization， D-CID）策略，實(shí)現(xiàn)了小分子誘導(dǎo)的細(xì)胞受體激活［圖4（b）］。該策略使用DNA適配體和DNA酶作為動態(tài)模塊，在細(xì)胞表面構(gòu)建DNA納米器件功能化的嵌合受體，并通過觸發(fā)DNA鏈置換以進(jìn)行受體二聚化并實(shí)現(xiàn)化學(xué)響應(yīng)。這種方法不需要基因工程，相對于傳統(tǒng)CID方法更簡單實(shí)用。同時，D-CID的模塊化設(shè)計具有優(yōu)異的靈活性，可定制響應(yīng)不同小分子的細(xì)胞行為。該策略對現(xiàn)有CID體系進(jìn)行了進(jìn)一步拓展，有望成為基于細(xì)胞的治療和再生醫(yī)學(xué)中智能調(diào)節(jié)細(xì)胞行為的新途徑。

1.3.2 基于DNA鏈取代反應(yīng)的動態(tài)控制元件

DNA鏈取代反應(yīng)是實(shí)現(xiàn)動態(tài)控制最常用的策略之一。通過多層DNA雜交以及鏈取代反應(yīng)的可控控制，目前已經(jīng)構(gòu)建了許多核酸化學(xué)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，用于實(shí)現(xiàn)各種功能。DNA鏈取代反應(yīng)本質(zhì)上是一個由自由能差異驅(qū)動的DNA重新雜交的過程。典型的鏈取代反應(yīng)是由立足點(diǎn)介導(dǎo)的，反應(yīng)從立足點(diǎn)開始，長的單鏈DNA置換出一條或多條短的預(yù)雜交DNA單鏈，重新互補(bǔ)配對形成更穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)［79］。通過改變立足點(diǎn)的空間位置、序列長度和堿基組成，鏈置換反應(yīng)的速率可以在超過6個數(shù)量級的范圍內(nèi)變化［80］。

另一種鏈取代方法是基于構(gòu)型熵差異特性。如果反應(yīng)中產(chǎn)物的數(shù)量大于反應(yīng)物的數(shù)量，由于構(gòu)型熵的增加，則鏈取代反應(yīng)依舊可以向前驅(qū)動［80］。另一種有效方法是構(gòu)建濃度不平衡體系。例如：鄰近誘導(dǎo)的鏈取代反應(yīng)［81］，其原理是通過親和力相互作用使多個DNA序列相互接近，從而使競爭序列的局部濃度大幅度增加，驅(qū)動鏈取代反應(yīng)發(fā)生，最終產(chǎn)生可檢測的DNA序列或信號。鄰近誘導(dǎo)的DNA鏈取代經(jīng)常被用作產(chǎn)生靶標(biāo)依賴的檢測信號和/或減少靶標(biāo)無關(guān)背景的關(guān)鍵機(jī)制。

基于DNA分子的可預(yù)測性、可設(shè)計性和可編程性，多個鏈取代反應(yīng)可以組合成級聯(lián)，從而構(gòu)建更為復(fù)雜的DNA回路，并且通過輕微改變輸入和輸出DNA鏈就能實(shí)現(xiàn)反應(yīng)高度可控［82］。基于動態(tài)DNA鏈取代反應(yīng)，研究者們已經(jīng)成功使用從簡單的雙鏈DNA互補(bǔ)配對［83］到復(fù)雜的DNA雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（hybridization chain reaction， HCR）組裝［84］、可逆構(gòu)象開關(guān)［85］等動態(tài)DNA回路，對蛋白酪氨酸激酶7（protein tyrosine kinase 7， PTK 7）、Met、CD20、TCR等多種細(xì)胞表面受體聚集進(jìn)行了調(diào)控。因此，DNA鏈取代反應(yīng)為受體聚集提供大量動態(tài)控制模塊，實(shí)現(xiàn)了可逆受體聚集的精準(zhǔn)控制。

1.3.3 時空分辨控制的物理操控方法

為了將細(xì)胞受體激活相關(guān)的形態(tài)變化與復(fù)雜的生物過程聯(lián)系起來，通常需要使用高時空分辨率的動態(tài)納米工具來控制所涉及的生物分子。由于非侵入性、高時空分辨率和低毒副作用的優(yōu)勢，近年來，物理操控方法（如光、電、超聲波或磁場）在受體聚集調(diào)控方面取得了蓬勃發(fā)展。這些方法可以通過控制外部物理場的強(qiáng)度、頻率、位置和時間等參數(shù)，實(shí)現(xiàn)對受體的精確調(diào)控，從而探索細(xì)胞信號傳遞和生物學(xué)過程的機(jī)制。

基于光的化學(xué)反應(yīng)可在極短時間內(nèi)發(fā)生，并且可以以劑量依賴的方式實(shí)現(xiàn)時間和空間的精確調(diào)節(jié)。近年來，基于光反應(yīng)的工具已經(jīng)成為實(shí)時調(diào)節(jié)細(xì)胞過程的有效手段，催生了光遺傳學(xué)和光化學(xué)系統(tǒng)等光學(xué)技術(shù)。光遺傳學(xué)通過蛋白質(zhì)工程將基因編碼的光敏蛋白定向地表達(dá)在特定的細(xì)胞類型或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。改造后的光傳感器和光開關(guān)能夠吸收300～800 nm范圍內(nèi)發(fā)射的光子，使相關(guān)的發(fā)色團(tuán)異構(gòu)化并誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的整體構(gòu)象變化，從而將用戶定義的光刺激轉(zhuǎn)換為定制的功能輸出［86］。最經(jīng)典的光敏蛋白是微生物通道視紫紅質(zhì)蛋白-2（channelrhodopsin-2， ChR2），研究人員在2005年首次將其用于控制神經(jīng)元活動［87］。此外，研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)越來越多基因編碼的光敏蛋白，并將相關(guān)光遺傳學(xué)工具模塊詳細(xì)歸納在OptoBase網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中［88］。隨著光敏蛋白工具包的不斷拓展，光遺傳學(xué)技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于對感興趣的蛋白質(zhì)進(jìn)行可編程的操作，包括光誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)多聚化、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)異源二聚化、蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)換和蛋白靶標(biāo)解離等［89］。

光化學(xué)方法具有體積小、對反應(yīng)改動需求小以及適配不同生物系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于寡核苷酸［90］、蛋白質(zhì)/多肽［91］，小分子（如細(xì)胞信號分子［92］、熒光劑［93］和二聚體化學(xué)誘導(dǎo)劑［94］）等各種生物分子的光調(diào)控。這種技術(shù)的關(guān)鍵元件是籠狀基團(tuán)［95-96］。這些基團(tuán)能夠暫時阻斷活性分子與生物伴侶的相互作用，并且以非常高的時空分辨率進(jìn)行光解，從而局部釋放生物活性分子。此外，光活化工具已經(jīng)與細(xì)胞器靶向結(jié)合，有助于在預(yù)先確定的位置研究各類細(xì)胞信號事件。使用模塊化的“點(diǎn)擊”方法還能直接將籠狀基團(tuán)組連接到靶向支架，克服了為每個細(xì)胞器合成特定的籠狀化合物的局限性［97-98］。利用光化學(xué)策略，生物學(xué)家們已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵受體分子的精準(zhǔn)調(diào)控［99］［圖4（c）］。

磁場近年來已經(jīng)成為一種新型的具有時空分辨率的細(xì)胞受體調(diào)控工具。磁場可以對順磁性粒子施加力的作用，但在其他方面卻是生物惰性的。同時，磁刺激能夠穿透深處的組織，進(jìn)而對生物體內(nèi)各種過程實(shí)現(xiàn)非侵入式的動態(tài)探測?；诖判圆牧系募?xì)胞功能遠(yuǎn)程激活需要三個主要組成部分：磁場、磁性致動器［例如，磁納米粒子（單核或簇）或鐵蛋白］以及在細(xì)胞水平激活的靶分子［100］。在控制細(xì)胞功能方面，磁性致動器通常以機(jī)械激活或熱刺激兩種方式發(fā)揮作用。例如許多研究都使用了磁性微粒子和技術(shù)（如磁鑷子或牽引力顯微鏡）探究機(jī)械線索對生物過程的影響［101］。磁性致動器也能用于磁熱刺激，激活與溫度敏感蛋白相連的細(xì)胞內(nèi)通路［102］。通過精確地調(diào)制磁刺激的各種參數(shù)，可以對樣品施加廣泛的力，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞和組織的非接觸式時空控制?？偟膩碚f，磁刺激可以通過遠(yuǎn)程的、無創(chuàng)的方式刺激生物體內(nèi)的目標(biāo)區(qū)域，從而為動態(tài)控制細(xì)胞表面受體聚集狀態(tài)提供了新的途徑。

1.4 細(xì)胞選擇性受體聚集元件

針對復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境，有必要開發(fā)細(xì)胞選擇性受體激活元件，縮小目標(biāo)細(xì)胞亞群的范圍，從而提高細(xì)胞靶向控制的精度。近年來，多種新穎的分子工程元件已經(jīng)被開發(fā)出來用于提高受體激活的細(xì)胞選擇性?；诩?xì)胞膜表面多抗原識別的選擇性策略通過識別特定的細(xì)胞標(biāo)志物組合來實(shí)現(xiàn)特異性識別和響應(yīng)?；谶B續(xù)DNA鏈取代反應(yīng)的邏輯門控回路則通過精確的DNA分子序列，在細(xì)胞膜表面實(shí)現(xiàn)特定的邏輯運(yùn)算，從而定制細(xì)胞受體信號響應(yīng)，提高選擇性。

1.4.1 基于細(xì)胞膜表面多抗原識別的選擇性策略

（1）多特異性嵌合人工配體策略

通過抗體將免疫調(diào)節(jié)有效載荷精準(zhǔn)輸送到腫瘤部位是增加細(xì)胞因子治療效用的常用方法之一?；诳贵w的特異性結(jié)合，這種方法可以將免疫調(diào)節(jié)劑針對性地運(yùn)輸?shù)侥[瘤組織，從而減少對健康組織的不良影響。為了提高配體的靶向選擇性，研究者們開發(fā)了抗體-細(xì)胞因子融合策略。該策略通過蛋白質(zhì)工程將信號配體與細(xì)胞特異性表面抗原相融合，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞特異性調(diào)控。Reisfeld等的研究開發(fā)了抗體與白細(xì)胞介素、干擾素和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor， TNF）等多種有效載荷的融合策略［103］。這些融合構(gòu)建體在體內(nèi)全身給藥后，可以選擇性靶向人腫瘤部位。此外，Neri等［104］還報道了雙細(xì)胞因子-抗體融合策略。他們將協(xié)同細(xì)胞因子組合白細(xì)胞介素-2/白細(xì)胞介素-12（IL-2/IL-12）以多種構(gòu)型與抗體（或抗體的Fc部分）進(jìn)行連接，成功實(shí)現(xiàn)更高的腫瘤特異性靶向。

近期，Garcia等［105］報道了一種用于生成雙特異性抗體激動劑的模塊化策略。該方法首先使用靶向不同受體或靶向同一受體不同表位的小型抗體結(jié)構(gòu)域模塊化“混合和匹配”創(chuàng)建二聚體配體庫，隨后，通過高通量篩選得到多樣化的細(xì)胞因子替代激動劑。由于配體庫僅限于與靶標(biāo)受體有生物化學(xué)驗(yàn)證結(jié)合的模塊，該方法可以得到具有明確活性歸屬的配體，并且，該方法還可以人為定制自然界不存在的異二聚體。這使得它有望成為生成多特異性配體的通用化學(xué)平臺，提高受體聚集工程的細(xì)胞選擇性。

（2）蛋白質(zhì)邏輯門控回路

多特異性嵌合人工配體策略旨在通過同時接觸多個目標(biāo)實(shí)現(xiàn)選擇性，但該方法需要微調(diào)單個受體結(jié)合的親和力，以減少背景信號。蛋白質(zhì)從頭設(shè)計和蛋白質(zhì)工程的快速發(fā)展允許人們在細(xì)胞表面構(gòu)建調(diào)節(jié)任意蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的邏輯門，從而通過表面標(biāo)志物的組合直接對細(xì)胞通路進(jìn)行選擇性控制。

Baker等［106］從頭構(gòu)建了氫鍵網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)的特異性蛋白質(zhì)異二聚體，并通過競爭性結(jié)合的方式成功設(shè)計了兩輸入和三輸入的蛋白質(zhì)邏輯門。進(jìn)一步，該研究小組從頭設(shè)計了一種名為Co-LOCKR（colocalization-dependent protein switches）的共定位依賴性蛋白質(zhì)開關(guān)［107］［圖5（a）］。該開關(guān)由“籠”蛋白、“鎖”蛋白和效應(yīng)器蛋白三部分組成。最初，“籠”蛋白通過“閂”結(jié)構(gòu)域?qū)⒐δ茈母綦x，只有配套的“籠”蛋白與“鎖”蛋白通過靶向結(jié)構(gòu)域共定位在表面上時才會產(chǎn)生相互作用，引起構(gòu)象變化，激活Co-LOCKR并結(jié)合相關(guān)效應(yīng)器蛋白。該方法能夠在細(xì)胞表面執(zhí)行與門、或門、非門邏輯運(yùn)算，從而通過不同的結(jié)合相互作用進(jìn)行細(xì)胞選擇。近期，他們報道了一種新設(shè)計的IL-2模擬物（Neo-2/15），該模擬物可分裂成兩個片段，組合后通過激活I(lǐng)L-2Rβ和IL-2Rγ來實(shí)現(xiàn)免疫刺激功能［108］。將這些片段分別融合到靶向HER2和EGFR受體的相關(guān)抗原上時，分裂片段能夠表現(xiàn)出共定位依賴性的激活，并將IL-2Rβγ高選擇性地募集到雙陽性HER2+/EGFR+細(xì)胞表面。

圖5 受體簇的細(xì)胞選擇性人工激活Fig. 5 Cell-selective artificial activation of the receptor clusters

基于蛋白質(zhì)從頭設(shè)計的邏輯門回路往往涉及到復(fù)雜的多蛋白質(zhì)系統(tǒng)。相比之下，直接設(shè)計單個蛋白質(zhì)能夠?qū)崿F(xiàn)更簡單、更嚴(yán)密的邏輯調(diào)節(jié)和靶向控制。Dokholyan等［109］開發(fā)了直接集成兩個正交、兩個輸入邏輯門作為調(diào)節(jié)開關(guān)的單個蛋白質(zhì)系統(tǒng)。通過結(jié)合化學(xué)遺傳學(xué)和光遺傳學(xué)方法，他們成功建立了一個雙輸入邏輯或門，用于控制黏著斑激酶的激活。這項(xiàng)工作揭示了通過兩個輸入和一個功能位點(diǎn)的變構(gòu)連接，單個蛋白質(zhì)可以直接被編程為以功能位點(diǎn)為輸出的蛋白質(zhì)邏輯門，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)功能的精細(xì)化調(diào)控。

1.4.2 基于連續(xù)DNA鏈取代反應(yīng)的邏輯門控回路

基于細(xì)胞膜表面多抗原識別的選擇性策略往往需要大量的蛋白質(zhì)工程。而DNA分子可以通過直接插入或結(jié)合細(xì)胞膜上的分子，方便地裝配到細(xì)胞表面，為設(shè)計細(xì)胞表面邏輯門控回路提供了更為便捷的途徑。DNA智能邏輯運(yùn)算基于嚴(yán)格的Watson-Crick堿基互補(bǔ)配對原理，通過連續(xù)DNA鏈取代反應(yīng)組合形成智能運(yùn)算電路來執(zhí)行各種算法和任務(wù)。將幾個邏輯門組合在一起還可以構(gòu)建執(zhí)行更高級別功能的多層數(shù)字電路，如平方根和1位全加法器電路［110］。近年來，已經(jīng)報道了許多基于DNA的邏輯系統(tǒng)，這些系統(tǒng)大多包含兩個獨(dú)立的組件：負(fù)責(zé)邏輯功能的寡核苷酸和負(fù)責(zé)監(jiān)測邏輯器件狀態(tài)的外在報告者。這些組件在系統(tǒng)中緊密結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的邏輯運(yùn)算和信息處理功能。2006年，Seelig等［111］使用單鏈DNA作為輸入和輸出成功構(gòu)建了基于鏈置換的各種DNA數(shù)字邏輯電路，如與門、或門、非門、信號復(fù)位操作、信號放大、反饋和級聯(lián)數(shù)字邏輯電路等，為DNA計算在生物技術(shù)和生物工程中的應(yīng)用開辟了道路。自此以后，基于DNA的邏輯門控回路已經(jīng)越來越多地用于控制生物相關(guān)過程。

通過利用DNA的智能邏輯運(yùn)算能力，研究者們已經(jīng)成功地構(gòu)建了各種核酸分子設(shè)備，用于選擇性調(diào)控細(xì)胞行為和功能。這些設(shè)備可以應(yīng)用于多個領(lǐng)域，例如癌細(xì)胞分離［112-113］、蛋白質(zhì)二聚化可視化［114］和探索細(xì)胞間相互作用［115］。本文作者課題組［116］基于細(xì)胞表面受體上的DNA邏輯門，成功構(gòu)建了一種能夠特異性識別多種蛋白組分的“掃描-解鎖”智能DNA分子自動機(jī)（“scan and unlock” DNA automaton system， SUDA）。該系統(tǒng)由一個DNA鎖定元件（用于保持蛋白質(zhì)配體不活躍），多個DNA識別元件（用于標(biāo)記特定細(xì)胞表面蛋白質(zhì)），以及一個基于DNA的“掃描和解鎖”動態(tài)元件組成。通過智能的布爾邏輯運(yùn)算，該機(jī)器能夠精確分析細(xì)胞膜表面的多種蛋白組分，最終實(shí)現(xiàn)從五種類型的細(xì)胞中精準(zhǔn)激活靶細(xì)胞的受體信號通路［圖5（b）］。

2 受體聚集調(diào)控的工程策略

近年來，化學(xué)合成生物學(xué)的研究聚焦于構(gòu)建人工生物系統(tǒng)，并應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、生物工程、材料科學(xué)等多個領(lǐng)域。其中，人工操控受體聚集和信號激活是化學(xué)合成生物學(xué)中的重要研究方向之一。研究人員通過研究不同的功能模塊，已經(jīng)開發(fā)出多種可用于實(shí)現(xiàn)受體聚集和信號激活的元件。為了更好地實(shí)現(xiàn)受體調(diào)控，研究人員基于化學(xué)合成生物學(xué)原理提出了多種受體調(diào)控的元件工程策略。這些策略包括基于相分離的受體激活元件工程、空間組裝激活工程、響應(yīng)性聚集激活工程、時空分辨調(diào)控工程和細(xì)胞選擇性激活工程。通過整合多種優(yōu)勢功能元件，這些工程策略可以有效地實(shí)現(xiàn)受體調(diào)控，并為人工生物系統(tǒng)的構(gòu)建提供了重要的技術(shù)支持。

2.1 基于相分離的受體激活元件工程

研究表明，許多內(nèi)源性細(xì)胞膜受體通過多價驅(qū)動的液-液相分離（liquid-liquid phase separation，LLPS）進(jìn)行激活調(diào)節(jié)［5］。利用LLPS的穩(wěn)健性和多功能性，研究者們設(shè)計了基于LLPS的工具來精確操縱受體聚集。Li等［117］利用相分離在亞宏觀層面上實(shí)現(xiàn)了可視化的細(xì)胞膜蛋白與膜受體的時空調(diào)控。他們通過融合多價模塊化相分離支架蛋白對和受體結(jié)合劑構(gòu)建了膜錨定依賴的相分離系統(tǒng)。相分離支架蛋白對與受體結(jié)合劑結(jié)合后被拉到細(xì)胞膜表面，導(dǎo)致其局部濃度顯著提升，進(jìn)而通過多價相互作用形成相分離，介導(dǎo)細(xì)胞表面受體酪氨酸激酶、死亡受體和趨化因子受體多聚激活。近期，Veatch等［118］設(shè)計了膜相分離驅(qū)動的受體信號結(jié)構(gòu)域響應(yīng)性組裝的納米級信號平臺，并通過超分辨率納米顯微鏡定量測量聚集后B細(xì)胞受體（B cell receptor， BCR）出現(xiàn)的膜結(jié)構(gòu)域。結(jié)果顯示，這些結(jié)構(gòu)域根據(jù)它們對液體有序相的偏好來富集和保留膜蛋白，并且BCR簇處的膜組成可以通過簇中的蛋白質(zhì)成分和膜的整體組成進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響B(tài)CR活化的幅度。

2.2 受體空間組裝激活的元件工程

細(xì)胞表面受體聚集本質(zhì)上是一個受體動態(tài)組裝的過程。因此，通過在分子層面上精確地控制受體的組裝，可以有效控制細(xì)胞內(nèi)信號傳遞。Suga等［119］構(gòu)建了大環(huán)肽二聚策略。他們通過RaPID系統(tǒng)篩選得到了對Met具有強(qiáng)親和力的大環(huán)化合物。這些大環(huán)化合物通過適當(dāng)?shù)慕宦?lián)劑進(jìn)行二聚化后，成為了有效的受體寡聚激動劑，能夠特異性地激活Met相關(guān)的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。最近，Baker等［120］報道了一種有生物活性的二元蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的計算方法。該方法可以設(shè)計出剛性接口，將兩個二面角形的蛋白質(zhì)單元相互連接，并自組裝為微米級二維p6m晶格陣列（六邊形蜂窩狀）。通過對蛋白質(zhì)組件功能化，并重新配置它們的對稱性，陣列能夠形成表面可控的配體結(jié)構(gòu)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞表面受體空間組裝。類似地，本文作者課題組［59］報道了一種基于DNA折紙的受體控制策略，成功構(gòu)建了DOTA。該技術(shù)通過在納米尺度上排列單價適配體或二價適配體來精確編程RTK受體的寡聚反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了可定義的化學(xué)計量、化合價和細(xì)胞行為切換間距的控制［圖3（b）］。

2.3 受體響應(yīng)性聚集激活元件工程

響應(yīng)性受體聚集激活元件工程是一種強(qiáng)大的開關(guān)工具，可在人為定義的條件下操控細(xì)胞受體以實(shí)現(xiàn)所需功能。通過化學(xué)誘導(dǎo)二聚，研究者們構(gòu)建了許多具有獨(dú)特響應(yīng)激活特性的基因工程嵌合受體。例如：Lim等［77］開發(fā)了一種小分子誘導(dǎo)的CAR用于T細(xì)胞行為調(diào)控。該方法將傳統(tǒng)CAR分成兩個物理分離的多肽，只有當(dāng)存在異二聚小分子試劑時，這些多肽才能重新組裝，激活T細(xì)胞［圖4（a）］。近期，Wang等［121］構(gòu)建了對pH和ATP等多種環(huán)境輸入具有響應(yīng)性的DNA納米器件。該器件使用pH響應(yīng)的i基序和ATP結(jié)合適配體作為響應(yīng)單元，通過在細(xì)胞表面構(gòu)建與門來選擇性地組裝Met和CD71受體，從而調(diào)節(jié)HGF/Met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

2.4 受體聚集時空分辨調(diào)控元件工程

時空分辨的受體聚集激活工程策略通過引入空間定位元件和/或時間響應(yīng)元件等手段，實(shí)現(xiàn)對受體聚集和激活的精確時空控制。其中，最具代表性的是光控受體聚集激活工程策略。Tampé等［99］開發(fā)了一種基于氨基三乙酸/組氨酸標(biāo)簽（trivalent nitrilotriacetic acid/His tag，trisNTA/His tag）光活化相互作用對，用于實(shí)現(xiàn)光誘導(dǎo)神經(jīng)肽Y2激素受體（neuropeptide Y2 receptor， Y2R）聚集。在這個方法中，多價螯合劑頭trisNTA首先被分子內(nèi)His6標(biāo)簽滅活。隨后，該系統(tǒng)在光活化時原位捕捉His標(biāo)記的受體，在細(xì)胞膜上快速產(chǎn)生不同大小、位置和密度的受體組裝［圖4（c）］。磁致動為時空分辨控制細(xì)胞受體提供了一種新的策略。近期，Cheon等［122］將磁性納米顆粒與靶向結(jié)直腸癌（deleted in colorectal cancer， DCC）受體的抗體共軛，利用非侵入性的外部磁刺激，實(shí)現(xiàn)了對目標(biāo)細(xì)胞受體在特定空間位置的精準(zhǔn)操控。

2.5 受體聚集的細(xì)胞選擇性激活元件工程

細(xì)胞選擇性的受體聚集激活工程策略可以針對特定類型的細(xì)胞或組織實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)激活控制。Rosenblum等［123］通過基因重組開發(fā)了TNF和識別人黑色素瘤細(xì)胞上gp240抗原的單鏈抗體的融合蛋白?；诳贵w的靶向性，融合蛋白可以在人黑色素瘤異種移植物中精確定位，實(shí)現(xiàn)選擇性的靶向治療。近期，Liu等［124］構(gòu)建了由細(xì)胞內(nèi)源性分泌物驅(qū)動的細(xì)胞選擇性受體簇調(diào)控（selective manipulation of receptor clustering， SMARC）策略。該策略由識別CD20受體的可伸縮DNA納米結(jié)構(gòu)“EDNS-CD20”和識別并結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）的“VEGF放大器”兩部分組成。當(dāng)“VEGF放大器”識別到細(xì)胞分泌的VEGF時，釋放出一條信號鏈驅(qū)動“EDNS-CD20”納米結(jié)構(gòu)中的重復(fù)發(fā)夾結(jié)構(gòu)單元收縮，并導(dǎo)致相應(yīng)CD20受體簇聚集。通過SMARC策略，能夠選擇性地誘導(dǎo)淋巴瘤Raji細(xì)胞上的受體聚集（圖6）。

圖6 人工調(diào)控受體聚集的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用Fig. 6 Biomedical applications for the artificial regulation of cell surface receptor clustering

3 人工調(diào)控受體聚集的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

細(xì)胞表面受體聚集在包括增殖和分化在內(nèi)的多種細(xì)胞活動中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，多種受體具有再生作用和免疫調(diào)節(jié)活性，控制其聚集在再生治療和免疫治療領(lǐng)域中也具有重要意義。因此，以用戶定義的方式操控細(xì)胞表面受體聚集不僅可以提高人們對細(xì)胞決策機(jī)制的理解，還能使細(xì)胞執(zhí)行期望的生物醫(yī)學(xué)功能（圖6）。

3.1 細(xì)胞行為調(diào)控

細(xì)胞表面受體的調(diào)節(jié)可以用于活化特定細(xì)胞信號通路，進(jìn)而影響下游細(xì)胞表型和命運(yùn)，如細(xì)胞增殖、遷移和分化。其中，RTK受體是介導(dǎo)細(xì)胞遷移行為的關(guān)鍵細(xì)胞表面受體家族。當(dāng)RTK受體發(fā)生聚集，其下游信號蛋白發(fā)生磷酸化轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)和功能，影響細(xì)胞的遷移和浸潤行為［4］。在2016年，Sando小組［125］創(chuàng)新性地提出二聚體RTK結(jié)合適配體能夠模擬誘導(dǎo)RTK二聚的天然配體，成功激活Met介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞遷移。進(jìn)一步，他們開發(fā)了基于雙特異性DNA適配體的RTK受體相互作用伴侶的重編程策略（DNA aptamer-mediated reprogramming of the interaction partner of receptor tyrosine kinases， DRIPaR）［126］和環(huán)狀DNA適配體激動劑（circular DNA aptamer-based agonists）策略［127］，用于重編程RTK受體介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，精細(xì)控制細(xì)胞的遷移行為。近期，本文作者課題組［128］首次報道了一種能驅(qū)動細(xì)胞微米級遷移的DNA分子機(jī)器人（圖7）。在DNA酶活性的驅(qū)動下，DNA機(jī)器人以細(xì)胞膜表面Met受體為立足點(diǎn)，隨機(jī)自主地在細(xì)胞膜表面行走，并連續(xù)觸發(fā)Met受體二聚化，將DNA機(jī)器人在納米尺度上的分子操作轉(zhuǎn)換為活細(xì)胞的微觀行為，實(shí)現(xiàn)了超高靈敏的細(xì)胞遷移行為控制。

圖7 驅(qū)動細(xì)胞遷移的可行走DNA分子機(jī)器人［128］Fig. 7 A DNA molecular robot that autonomously walks on the cell membrane to drive its migration[128]

細(xì)胞與基質(zhì)的黏附主要是通過整合素受體介導(dǎo)的，整合素可識別細(xì)胞外基質(zhì)蛋白中的RGD三肽基序，進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架動力學(xué)［129］。因此，RGD基序是一個可用于定量調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、細(xì)胞定向和遷移的關(guān)鍵受體識別模塊。相關(guān)研究證明，整合素聚集和信號活化的通用間距尺寸在58～73 nm之間［130-131］。而且，RGD配體的空間組織形式，例如排列、定位、密度等，對于細(xì)胞黏附遷移行為具有重要的調(diào)節(jié)作用［132］。近期，Ding等［133］構(gòu)建了一種具有納米間距梯度的RGD納米陣列，能夠選擇性誘導(dǎo)細(xì)胞沿納米空間梯度定向遷移。此外，整合素受體功能還可以通過DNA鏈取代控制的動態(tài)模塊可逆調(diào)節(jié)。Li等［134］通過滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA）生成了DNA納米彈簧支架，然后在表面連接多價RGD配體。加入外部互補(bǔ)DNA鏈可以調(diào)節(jié)納米彈簧上RGD之間的伸展收縮運(yùn)動，從而可逆調(diào)節(jié)整合素受體的聚集和去聚集，影響下游PI3K/Rac1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞形態(tài)改變。

3.2 免疫功能調(diào)節(jié)

免疫細(xì)胞是分布在全身的半自主細(xì)胞，能夠穿過多種組織，以不同的細(xì)胞行為模式檢測和應(yīng)對多種病理性損傷［135］。免疫細(xì)胞的功能由免疫受體的集體信號決定。這些免疫受體的表達(dá)和活性取決于細(xì)胞的發(fā)育階段及其環(huán)境背景。因此，研究人員非常希望設(shè)計具有增強(qiáng)功能的或新疾病“感知和應(yīng)答”行為的免疫細(xì)胞，操控其精確檢測疾病，并治療自然免疫系統(tǒng)無法處理的各種潛在挑戰(zhàn)性疾病。

巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等先天性免疫細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的第一道防線，通過模式識別受體（pattern recognition receptors， PRR）識別微生物物種中保守的結(jié)構(gòu)形狀和死亡細(xì)胞分泌的各種“危險信號”［49］?；罨南忍烀庖呒?xì)胞會產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，觸發(fā)急性炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)后續(xù)其他免疫細(xì)胞的募集和活化。先天性免疫細(xì)胞膜上的Fc受體（Fc receptor， FcR）、C型凝集素受體（C-type lectin receptor， CLR）和Toll樣受體（tolllike receptors， TLR）能夠形成大規(guī)模簇［136］，發(fā)揮著重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。Yu等［137］創(chuàng)建了四個不同納米間距的TLR1-TLR2異源二聚體配體陣列Pam3CSK4，揭示了TLR1/2觸發(fā)的免疫反應(yīng)與配體簇間距之間的定量關(guān)系。結(jié)果表明巨噬細(xì)胞的促炎反應(yīng)，包括腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）的分泌和核因子-κB（Nuclear factor kappa-B， NF-κB）的激活與配體納米簇的間距有關(guān)。TLR1-TLR2納米簇在細(xì)胞膜上越接近，細(xì)胞免疫反應(yīng)就越強(qiáng)烈。

T細(xì)胞是一種適應(yīng)性免疫細(xì)胞，它通過與抗原呈遞細(xì)胞和TCR上負(fù)載的肽結(jié)合的主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，pMHC）之間的相互作用識別外來抗原。當(dāng)TCR與pMHC相互作用并聚集時，能夠轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)信號，啟動T細(xì)胞的免疫反應(yīng)［138］。為了研究這個過程，Vale小組［83］開發(fā)了一種基于DNA的合成信號系統(tǒng)（DNA-CARζ），其中TCR和pMHC的胞外域分別被互補(bǔ)的DNA鏈取代，通過單門控DNA結(jié)合可以啟動T受體的聚集和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。進(jìn)一步，他們組近期將DNA-CARζ與DNA折紙技術(shù)結(jié)合，通過精確排列配體分布，揭示了TCR信號激活的敏感性和動力學(xué)的空間控制［139］。除了配體觸發(fā)的TCR空間重組外，TCR與配體相互作用所涉及的機(jī)械力也能調(diào)節(jié)T細(xì)胞中的免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究者已經(jīng)開發(fā)出一種光熱響應(yīng)聚合物致動器來操控TCR聚集［140］。在這個系統(tǒng)中，固定在表面上的金納米棒被涂上一種熱響應(yīng)性聚合物，并且聚合物的另一端用TCR配體功能化。當(dāng)金納米棒被近紅外光照射時，誘導(dǎo)的局域加熱導(dǎo)致聚合物坍塌。這種構(gòu)象變化產(chǎn)生皮牛頓范圍內(nèi)的拉力并控制配體結(jié)合的TCR聚集。為了研究通過TCR配體結(jié)合產(chǎn)生的細(xì)胞力，Salaita小組開發(fā)了一種基于DNA的納米顆粒張力傳感器［141］，該傳感器模擬了TCR-pMHC的特征相互作用，以測量T細(xì)胞活化過程中通過TCR-配體力學(xué)傳遞的皮牛頓力。他們后續(xù)還設(shè)計了類似的基于DNA的比率張力探針，用于在激活期間同時監(jiān)測TCR的力和聚集［142-143］，揭示了T細(xì)胞可以調(diào)整其機(jī)械機(jī)制以優(yōu)化免疫識別反應(yīng)的特異性。

3.3 組織再生修復(fù)

生長因子是一類活性多肽，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、增殖、分化和細(xì)胞外基質(zhì)合成。常用的生長因子包括堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor， bFGF）、肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor， HGF）和轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）等，這些生長因子已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于組織修復(fù)［144-145］。例如，TGF-β家族的生物活性是結(jié)合并促進(jìn)兩個Ⅰ型受體（TβRⅠ）和兩個Ⅱ型受體（TβRⅡ）的相互作用。TGF-β受體信號通路的激活在皮膚纖維化中發(fā)揮作用。Raines等［146］使用膠原蛋白結(jié)合物在小鼠傷口床固定結(jié)合TGF-β受體的多肽配體，從而促進(jìn)成纖維細(xì)胞表面TβRⅠ和TβRⅡ的多價聚集，進(jìn)一步提高細(xì)胞對TGF-β的敏感性，有效促進(jìn)小鼠皮膚膠原沉積和傷口愈合過程。

在骨骼肌再生過程中，肌肉前體成肌細(xì)胞需要遷移和分化為功能性肌細(xì)胞［147］。骨骼肌前體細(xì)胞定向遷移和增殖行為對傷口愈合過程至關(guān)重要。本文作者課題組［148］開發(fā)了一種近紅外光活化的DNA激動劑（near-infrared light-activated DNA agonis， NIR-DA）納米裝置，實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)細(xì)胞行為的非遺傳操控。該方法可誘導(dǎo)受體二聚活化的DNA激動配體功能化在金納米棒上。該納米裝置受近紅外光觸發(fā)下，通過局部表面等離子體共振引起的光熱效應(yīng)，進(jìn)而釋放和活化DNA激動配體。進(jìn)一步，DNA激動配體促進(jìn)細(xì)胞受體的二聚激活，加速骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞遷移和分化，最終促進(jìn)骨骼肌損傷的再生進(jìn)程。

HGF及Met受體是肝細(xì)胞最主要的有絲分裂原功能蛋白［149］。細(xì)胞膜的Met受體聚集激活對維護(hù)正常肝細(xì)胞功能和促進(jìn)肝臟再生至關(guān)重要。Yang等［150］使用T4 DNA連接酶密封Met的二價適配體的兩端缺口開發(fā)了一種環(huán)狀二價適配體（circular bivalent aptamer， CBA），不僅可以在體內(nèi)激活Met介導(dǎo)的再生信號通路，修復(fù)APAP誘導(dǎo)的肝損傷，并且表現(xiàn)出抗外切酶活性和對血清的高穩(wěn)定性。

3.4 活體行為操控

細(xì)胞表面受體聚集工程可以通過改變細(xì)胞外受體結(jié)構(gòu)的空間排列，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞行為的精準(zhǔn)調(diào)控。近年來，研究者們嘗試將人工受體操控推廣到高水平的活體行為控制應(yīng)用。Verkhusha等［151］設(shè)計了一種光控RTK工程的通用方法，通過基因工程將細(xì)菌光敏色素的光敏核心模塊融合到酪氨酸激酶B（tyrosine kinase receptor B， TrkB）受體的胞外結(jié)構(gòu)域，成功實(shí)現(xiàn)了光誘導(dǎo)的受體可控激活。該受體參與神經(jīng)系統(tǒng)包括睡眠、學(xué)習(xí)和神經(jīng)保護(hù)在內(nèi)的多個過程?；谏鲜鲈O(shè)計，將工程化高表達(dá)光控TrkB受體的小鼠神經(jīng)元細(xì)胞注射到小鼠的大腦皮層，通過顱骨遠(yuǎn)紅光的微創(chuàng)刺激，能夠誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)活動并影響小鼠的睡眠模式。該研究充分展示了光控受體聚集工程在活體行為調(diào)控的巨大潛力。盡管如此，該方法在臨床應(yīng)用中的可行性和安全性仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 總 結(jié)

人工調(diào)控細(xì)胞表面受體聚集的工程策略為研究者們探究細(xì)胞功能、解析受體下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和細(xì)胞行為的精準(zhǔn)操縱提供了多樣化的選擇。特別是快速發(fā)展的化學(xué)合成生物學(xué)提供了豐富多樣的受體控制元件和操控原理，使得人們通過模塊化和定量化的工程設(shè)計來控制細(xì)胞表面受體聚集。研究人員已經(jīng)整合多種優(yōu)勢功能模塊，開發(fā)出具有空間組裝、特定響應(yīng)性、時空分辨和高細(xì)胞選擇性等特點(diǎn)的元件工程，并成功將其應(yīng)用于細(xì)胞行為和免疫功能調(diào)節(jié)。此外，這些基于理性設(shè)計的新方法被推廣到活體層面，例如活體組織修復(fù)和神經(jīng)行為調(diào)節(jié)等。這些工作充分展示了人工調(diào)控受體激活工程策略在調(diào)節(jié)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的巨大潛力，并為開發(fā)精準(zhǔn)細(xì)胞治療藥物提供了一種潛在的新方案。

盡管人工調(diào)控細(xì)胞表面受體聚集在腫瘤免疫治療、再生醫(yī)學(xué)和組織工程等領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊，目前仍面臨以下幾個重要挑戰(zhàn)：

①人工調(diào)控受體聚集策略的具體作用機(jī)理仍需要進(jìn)一步探究。雖然受體聚集的研究已經(jīng)取得了一些顯著的進(jìn)展，但我們?nèi)孕枰钊氲匮芯渴荏w聚集策略在不同細(xì)胞類型和不同病理狀態(tài)下的作用機(jī)制，以更好地指導(dǎo)其在治療和修復(fù)過程中的應(yīng)用。

②人工調(diào)控受體聚集策略的識別元件設(shè)計和制備過程需要進(jìn)一步優(yōu)化?，F(xiàn)有受體聚集調(diào)控方法十分依賴于特異性受體分子識別元件。然而，目前所報道的識別元件仍然有限，無法實(shí)現(xiàn)對所有受體家族的精準(zhǔn)識別和調(diào)控。同時，對多肽配體進(jìn)行工程改造和從頭設(shè)計是得到具有新功能和高特異性受體識別元件的有效策略。但需要注意的是，以上兩種方法非常依賴于配體分子的結(jié)構(gòu)設(shè)計。然而，目前大多數(shù)受體-配體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)仍未被確定，這給技術(shù)上的應(yīng)用帶來了困難。因此，未來需要更努力聚焦受體-配體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)解析以及高親和力和特異性的受體識別元件的設(shè)計與篩選，以進(jìn)一步推動該技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。

③人工調(diào)控受體聚集策略在臨床應(yīng)用中仍需面對嚴(yán)峻的安全性和有效性挑戰(zhàn)。盡管受體聚集激活功能元件的不斷擴(kuò)展為人們調(diào)控受體聚集提供了多樣的分子工具，但現(xiàn)有各個體系均存在固有局限性。目前，該領(lǐng)域還沒有獲得真正具有臨床應(yīng)用價值的工程化方案。例如：基于小分子響應(yīng)需要額外給藥，而且難以實(shí)現(xiàn)高度時空分辨的控制；光學(xué)修飾的受體系統(tǒng)受限于光的組織穿透性，而且過度依賴于在體內(nèi)持續(xù)傳遞光的光照設(shè)備；磁控技術(shù)本身具有極強(qiáng)的穿透能力，然而目前磁控工具和設(shè)備的開發(fā)仍處于早期階段，磁性執(zhí)行器和相關(guān)科學(xué)機(jī)制存在爭議且缺少可用的商業(yè)化設(shè)備。

④現(xiàn)有人工受體激活工程仍需解決在體內(nèi)的安全性和長期性問題。DNA、多肽和抗體等生物分子為人工受體激活提供了具有巨大潛力的元件。但是，這些大分子穩(wěn)定性較差，在血液循環(huán)中的滯留時間短，阻礙了其在復(fù)雜生理環(huán)境中的應(yīng)用。更高穩(wěn)定性和可長循環(huán)的生物大分子的改進(jìn)方法有望使人工受體激活元件工程的條件設(shè)計和變量調(diào)節(jié)更加多元合理。目前，研究人員已經(jīng)開發(fā)了多種化學(xué)生物學(xué)策略提高生物分子的體內(nèi)穩(wěn)定性［152-153］，有望在未來進(jìn)一步應(yīng)用于細(xì)胞受體聚集的體內(nèi)操控。

綜上，雖然人工控制細(xì)胞表面受體聚集的工程策略還存在一定的風(fēng)險和挑戰(zhàn)。然而，隨著化學(xué)合成生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程等學(xué)科的不斷發(fā)展，我們有理由相信未來將開發(fā)出更加精準(zhǔn)化和智能化的人工控制策略，為研究干細(xì)胞分化、T細(xì)胞活化、病原體感染和癌癥治療等生理和病理細(xì)胞過程帶來新的方法，從而推動以細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤治療和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。