合成生物學表型測試生物反應器及其裝備化研究進展

郭肖杰，剪興金，王立言，張翀，4，邢新會，4，5

（1 清華大學化學工程系，生物化工研究所，北京 100084； 2 工業(yè)生物催化教育部重點實驗室，北京 100084； 3 清華大學無錫應用技術研究院生物育種中心，無錫 214000； 4 清華大學合成與系統(tǒng)生物學中心，北京 100084； 5 清華大學深圳國際研究生院生物醫(yī)藥與健康工程研究院，深圳 518055）

合成生物學是一門綜合多種學科的新興交叉學科，包括生物學、化學、物理學、數(shù)學、信息科學和工程科學等。它以工程化理念為指導，對生物體進行有目標的設計、改造乃至重新合成，被譽為繼DNA雙螺旋結(jié)構發(fā)現(xiàn)和“人類基因組計劃”后的第三次生物技術革命。合成生物學的概念最早在20世紀初被提出，隨著基因“讀-改-寫”技術的不斷進步，近年來合成生物學得到了快速發(fā)展［1-2］。目前，合成生物學的研究過程通常遵循“設計-構建-測試-學習”（design-build-test-learn，DBTL）的循環(huán)［3-4］，設計高效細胞工廠：在設計階段，科研人員根據(jù)目標產(chǎn)物，利用先驗知識、經(jīng)驗和計算機模型等進行合成生物學的路徑設計，包括選擇底盤細胞、設計基因回路、調(diào)控代謝通路和利用底物等；構建階段則主要利用基因合成技術、基因編輯技術、基因擴增技術等，構建所需的基因系統(tǒng)、分子表達系統(tǒng)和代謝網(wǎng)絡，最終將設計好的合成生物學路徑構建成為實現(xiàn)預期目標的生物體系；測試階段則對所構建的生物體系進行表型測試表征，包括基因型數(shù)據(jù)和表型數(shù)據(jù)的測定，以及目標產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量的表征等；學習階段則利用大數(shù)據(jù)、機器學習、深度學習、人工智能等方法對測試結(jié)果進行綜合評估分析和預測，用以進一步改進和優(yōu)化設計。通過不斷迭代優(yōu)化的方式，可以逐步提高合成生物學的設計性能，加速生物制造項目的開發(fā)速度，提高目標產(chǎn)物的生產(chǎn)效率和質(zhì)量。

在DBTL循環(huán)中，由于細胞代謝網(wǎng)絡和調(diào)控機制的復雜性，以及基因型和表型之間的高度復雜關聯(lián)，目前還缺乏充分的理性設計方法，細胞工廠設計構建仍需要進行長期的反復人工試錯實驗。因此，將理性合成途徑的設計與非理性的進化相結(jié)合，建立一套高效的細胞工廠設計和構建策略，成為合成生物學的重要研究方向［5］。同時，隨著細胞設計構建方法的持續(xù)創(chuàng)新和發(fā)展，構建的細胞突變庫規(guī)模不斷增加，對細胞的測試和篩選效率提出了更大的挑戰(zhàn)。因此，表型測試成為DBTL循環(huán)的關鍵環(huán)節(jié)。

在DBTL循環(huán)的表型測試環(huán)節(jié)中，針對不同應用目標和不同通量需求的測試，生物反應器成為主要的表型研究工具，比如單細胞檢測篩選技術、基于多孔板的高通量篩選技術以及基于微流控的高通量篩選技術。雖然表型測試相關研究工作已有大量的文獻綜述報道，但仍缺乏全面系統(tǒng)的生物反應器與裝備化研究進展總結(jié)，無法為合成生物學廣大科研人員和工程技術人員提供參考依據(jù)。因此，本文從單細胞檢測與分選到不同尺度生物反應器的細胞分析和篩選技術角度系統(tǒng)綜述了各種用于表型測試的生物反應器及其裝備化研究進展和相關特性，包括皮納升級生物反應器、微升級生物反應器、毫升級生物反應器以及升級生物反應器，為合成生物學表型測試提供重要參考。

1 單細胞檢測與分選

在本文中，單細胞篩選是指根據(jù)細胞自身的特征，如細胞的形狀、密度、大小、光信號、圖像特征等進行篩選。自20世紀80年代固體平板培養(yǎng)法被用于篩選微生物單克隆以來［6］，科學家們一直在不斷探索從細胞突變庫中獲得目標單細胞的高通量方法，發(fā)展出了多種單細胞表型測試和篩選技術和裝備。這些單細胞測試技術及其裝備主要包括單細胞檢測和單細胞分選兩個模塊。

單細胞檢測模塊主要包括細胞熒光（熒光蛋白代謝或表面標記的熒光分子）［7-8］、散射光（細胞和亞細胞結(jié)構和大小）［7，9-10］、拉曼光譜［11-13］（揭示單個細胞的內(nèi)在化學信息）、圖像［14-16］（明場圖像、熒光圖像以及三維圖像）、磁信號［17-19］（抗體或鏈霉親和素包被磁珠識別的細胞表面抗原）、阻抗信號［20-22］等。其中，光散射信號、拉曼光譜、明場圖像和阻抗信號在細胞自身受照射或激發(fā)時即可產(chǎn)生，無需進行標記，但單細胞的這些非標記信號強度往往較弱，導致檢測誤差較大、精度低、背景噪聲大、抗干擾能力弱。而熒光強度、熒光成像和磁信號通常需要對細胞進行復雜的標記，這些標記為單細胞檢測提供了較強的信號強度和較高的信號質(zhì)量，以提高檢測的準確性。同時，對于熒光信號而言，還可以通過基因工程技術向細胞內(nèi)嵌入特定熒光蛋白基因，用于表達產(chǎn)生對應的熒光蛋白，如GFP、YFP、RFP等［23-24］。質(zhì)譜也被廣泛用于細胞分析，且具有較高的普適性［25-27］，但該方式常需要對細胞進行裂解破碎，無法獲得活細胞，此外，如需對細胞外分泌物進行檢測則往往需要特定的微型生物反應器對其代謝產(chǎn)物進行富集才能實現(xiàn)檢測。

單細胞的分選則是在對細胞目標特性進行檢測識別的條件下獲取目標細胞的方法和技術，分選過程中驅(qū)動細胞向特定方向運動的推動力可來源于電場、磁場、光場、聲場、流體力場、重力場等作用。電場可以直接將帶特定電荷的細胞分選到收集容器中［7］，也可以基于介電電泳技術對不帶電細胞分選［17，28］，為細胞分選提供了一種超高通量方式，但前者細胞充電的過程往往會對細胞造成損傷，降低細胞活性。采用抗原-抗體特異性結(jié)合方法標記的細胞，可以使用磁性顆粒進行特異性偶聯(lián)進而利用磁場進行分選［29］，但其操作相對煩瑣，整體效率低?；诠忤嚨膯渭毎Y選技術是由強會聚的激光束形成的光學勢阱，通過光場梯度所產(chǎn)生的光力將細胞拉入光束軸，輻射壓力（散射）分量推動細胞沿光束傳播軸運動，完成對細胞運動的操控［11，16，30-31］，但光鑷的通量較低，且可能因其發(fā)熱效應而損壞細胞，導致細胞活力下降或死亡。在聲場方面，表面聲波（surface acoustic wave，SAW）和駐波（standing surface acoustic wave，SSAW）驅(qū)動細胞分選是利用“聲場”的物理原理，驅(qū)動連續(xù)流動中目標顆?；蚣毎虿煌较蜻\動，實現(xiàn)高通量、低損傷的細胞分選［8，32］。該方法通常在微流控芯片底部構建電機陣列，用以產(chǎn)生特定頻率和幅度的聲場，但芯片加工工藝較為復雜、成本高。流體力場則可以通過泵和閥來控制和改變，實現(xiàn)驅(qū)動目標細胞向特定方向運動，由于部件之間的通訊和響應時間較長，該方式的分選速率比較低，且往往需要自動化整體控制［14-15，33-34］。單細胞懸滴法則是根據(jù)液滴重力或微泵將包含單個細胞的液滴分配到目標基板（如微孔板）上，而非目標液滴則被轉(zhuǎn)移至廢液收集瓶中［35］，分選過程溫和，但速度受限。

通過上述兩類模塊的集成，可以開發(fā)多種單細胞檢測與篩選平臺，應用于不同場景。如傳統(tǒng)的熒光激活細胞分選（fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）裝備集成了單細胞的熒光檢測、散射光檢測的光學檢測模塊和高壓電場分選模塊，細胞被檢測后，設備對細胞及其周圍液體進行充電，使其帶上特定電荷，然后再在下游的高壓電場中，受電場力遷移至特定位置，進入收集容器，完成單細胞的檢測分選［圖1（a）］。目前該裝置已經(jīng)在合成生物學中廣泛應用，并已有相關綜述詳細報道［5］。磁激活細胞分選（magnetic activated cell sorting，MACS）則是使用抗體、酶、凝集素或鏈親和素結(jié)合到磁珠上，這些物質(zhì)可以與靶細胞上的特定蛋白質(zhì)相關聯(lián)，然后將細胞懸浮液置于磁場中，標記的細胞被吸引，而未標記的細胞被沖走，關閉磁場會釋放剩余被捕獲的細胞［圖1（b）］，MACS常用于動物細胞的分離，如Uosaki等［38］以血管細胞黏附分子作為心肌細胞表面標記物，基于MACS裝置將從誘導多能干細胞中分離心肌細胞，獲得了產(chǎn)心肌肌鈣蛋白-t心肌細胞，所獲得細胞的陽性率大于95%。中國科學院青島生物能源與過程研究所徐健和馬波團隊［39］所開發(fā)的拉曼激活細胞分選裝置（Raman activated cell sorting，RACS）則是對細胞進行拉曼光譜檢測，然后通過電磁閥的開關驅(qū)動流體流動實現(xiàn)目標細胞分選，同時，借助介電泳方式實現(xiàn)細胞在拉曼檢測窗口位置的捕獲和釋放，提高所獲得的拉曼信號質(zhì)量［圖1（c）］。該裝置用于產(chǎn)生類胡蘿卜素酵母的篩選，在含有產(chǎn)生類胡蘿卜素的酵母（9%）和不產(chǎn)生類胡蘿卜素的釀酒酵母（91%）兩種細胞株的混合物中進行了分選，前者的平均富集率為73%。Faenza等［20］開發(fā)了一種細胞阻抗信號檢測和分選的裝置，該裝置通過集成了阻抗檢測微陣列電極和壓電式流體驅(qū)動器，細胞流經(jīng)電極陣列時檢測阻抗信號，如果是目標細胞，則觸發(fā)壓電開關，所產(chǎn)生的一定體積流體進入微流體通道，將目標細胞推動至下方壓電噴頭處，進而被噴射至多孔板中，完成細胞的檢測和分選［圖1（d）］。該裝置成功地監(jiān)測了分離K562白血病細胞至多孔板的過程，且所分選細胞無假陽性。Ren等［40］將駐波驅(qū)動技術和熒光檢測技術（SSAW）進行整合，結(jié)合微流控芯片實現(xiàn)細胞的熒光檢測和聲場驅(qū)動分選，首先使用駐波技術使細胞顆粒在流體中聚焦成“線”，流經(jīng)熒光檢測區(qū)，獲得高質(zhì)量熒光信號，然后再次利用駐波驅(qū)動技術，將細胞從聚焦流中偏轉(zhuǎn)至收集通道，從而實現(xiàn)高通量分選［圖1（e）］，該裝置用于哺乳動物細胞（HeLa細胞）的檢測分選，實現(xiàn)了2500個/s的高效分選，所分選細胞純度大于90%。Nitta等［15］將三維成像技術和薄膜微閥流體驅(qū)動技術結(jié)合，通過獲取高質(zhì)量的細胞三維圖像，結(jié)合深度學習算法，對細胞進行高內(nèi)涵分析，并針對感興趣的目標細胞，在下游流動過程中通過薄膜閥所驅(qū)動的微量流體流動，將目標細胞推動至收集管路中，以此完成細胞的圖像分析和分選［圖1（f）］，該裝置可以對聚苯乙烯微球?qū)崿F(xiàn)100個/s的篩選速度，且純度高達99%。

圖1 單細胞檢測與分選裝置工作原理圖Fig. 1 Single cell detection and sorting

此外，近年來有許多研究在微流控芯片上設計了許多微結(jié)構以實現(xiàn)細胞或粒子的主動分選，包括微井結(jié)構陣列單細胞捕獲［41］、確定性橫向位移（deterministic lateral displacement，DLD）［42-43］和慣性流系統(tǒng)（inertial microfluidic）［44-45］，可基于單個細胞的直徑大小和彈性對大量細胞進行快速高通量分選，且無需對細胞進行標記檢測即可實現(xiàn)目標細胞分離。

2 皮納升級微型生物反應器及裝備化

本文中皮納升級生物反應器體積范圍1 pL～100 nL，主要包括兩種類型［46-47］：一種是采用微加工技術在基板上制作微孔陣列，微孔直徑常小于500 μm，細胞裝入微孔中進行培養(yǎng)和檢測，基于微孔的單細胞篩選的通量約為102～103個［48］；另一種是基于微液滴的生物反應器，它是由液滴微流控技術產(chǎn)生的，將細胞封裝在液滴中進行培養(yǎng)和檢測，液滴直徑常小于200 μm，基于微液滴的單細胞篩選技術的通量為105～108個［49］。這些皮納升規(guī)模的生物反應器相對于大型生物反應器可以有效提高細胞生長的初始濃度，為單細胞提供非競爭性的生長空間，更有利于細胞的生長和代謝［50-52］。皮納升級生物反應器通常用于單細胞或單克隆篩選，與本文第一部分所描述的依賴于單細胞形態(tài)特征或標記物進行檢測和篩選的方法不同的是，基于皮納升級生物反應器的單細胞檢測篩選技術，可以滿足對有機小分子、代謝物、酶、蛋白質(zhì)等類型的胞外代謝分泌物進行高通量檢測的需求［53-54］。為了快速測量特定的底物或代謝物，許多生物和化學傳感器被應用到皮納升級別的微反應器中，這些傳感器通過與目標底物或代謝物進行特異性反應而產(chǎn)生強烈的熒光信號，使得從大規(guī)模的細胞文庫中篩選目標細胞的工作變得容易和快速［55-56］。

微孔陣列生物反應器的發(fā)展得益于微加工技術和聚合物材料的快速進步。自20世紀80年代以來，微加工領域不斷引入新的制造方法和先進材料［57-58］，作為半導體工業(yè)中最常見的材質(zhì)，硅和玻璃是第一批被研究的材料［58］。近些年，使用聚合物材料的軟光刻技術可以在標準的分子生物學實驗室中快速廉價地生產(chǎn)微結(jié)構［59-61］。用于生物分析的微孔有一定的要求，包括工作溫度、無菌性、黏結(jié)性、透氣性、透明性、低毒性等，其中聚合物聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）目前是軟光刻制造中最常用的材料，具有疏松多孔、易于加工、結(jié)構可控性強、生物兼容性好、透明性高的優(yōu)點［47］，單細胞可在該類型微孔中進行長期的生長代謝（數(shù)天到一周）和狀態(tài)觀察。微孔陣列生物反應器中單細胞培養(yǎng)和檢測方式如圖2所示，通過有限稀釋法［62］或單細胞分選的方式［7］將細胞分散至微孔中，并對微孔陣列周圍環(huán)境進行適宜的溫度控制和氧氣供應，滿足細胞在微孔陣列中生長和代謝的環(huán)境條件需求，并結(jié)合熒光顯微技術，對細胞的生長代謝狀態(tài)進行連續(xù)觀察分析，進而挑選出合適的目標細胞［48］。

圖2 基于微孔陣列的單細胞分選策略［48］Fig. 2 Workflow for single cell screening based with microwells[48]

液滴微流控是指通過油相和水相在微流控芯片中進行相互剪切，形成大規(guī)模的均勻液滴群，這些液滴直徑常小于300 μm，在微生物學高通量單細胞培養(yǎng)和分析方面已顯示出其獨特優(yōu)勢［63-66］。微液滴具有通量高、體積小、易操作、傳質(zhì)傳熱迅速等特點，已日益成為單細胞分析的重要工具，其應用包括聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）、細胞培養(yǎng)、分選、分離、克隆形成、細胞裂解、基因和蛋白質(zhì)表達、抗體分泌以及細胞毒性分析研究［53-54，65-67］。在微生物學領域，液滴通常是指油包水（Water-in-Oil， W/O）結(jié)構的微液滴，可以很容易地通過主動和被動的液滴生成技術制備［68］。單細胞培養(yǎng)的液滴大小從皮升到納升不等，由于細胞在生成液滴過程中是隨機分配到液滴內(nèi)的，被包裹在液滴中的細胞數(shù)量及其分布概率服從泊松分布統(tǒng)計學規(guī)律［69-70］，這與有限稀釋方法類似。為了提高單細胞包封率，研究人員利用慣性流體技術［71］或介電泳技術［72］對芯片上液滴生成單元上游的細胞進行排序，并控制其逐一進入液滴，使得單細胞包封率可提高至80%以上。液滴形成后，可將液滴群儲存在小容器中，如離心管、微管或其他自制容器中，然后放置在合適的溫度、濕度和氣體環(huán)境中進行孵育，微生物可在液滴中進行增殖和代謝?？紤]到不同微生物種類需要不同的氧氣濃度，研究人員采用高透氣性微管路來儲存液滴，氧氣和二氧化碳可以通過管壁不斷滲透到油相中［73-75］，或者對油相進行反復充氧，使其給液滴供氧［76］。

在皮納升級微液滴系統(tǒng)中，開發(fā)和整合有效的細胞快速實時檢測技術是微生物分選的關鍵步驟。微流控系統(tǒng)中樣品體積的微量化和液滴的快速流動對檢測的速度和靈敏度提出了重大挑戰(zhàn)，液滴微流控的檢測技術需要具備簡單、快速響應、高靈敏度、緊湊、靈活和低成本等特點［54］。液滴的檢測與流式細胞術類似，其檢測信號包括熒光［77-78］、拉曼［72，79-80］、圖像［81-83］、光散射［84］、阻抗［85］、核磁［86-87］、電化學［88-89］、質(zhì)譜［90-91］和光吸收度［92-93］等。對于液滴分選，與單細胞分選方式類似，仍然可以利用電場［94］、磁場［95-96］、光場［97］、聲場［98-99］、重力場［100］、流體動力場［101］所產(chǎn)生的力來驅(qū)動液滴到收集或廢液通道。通過上述檢測方式和分選方式的組合集成，可以實現(xiàn)高通量、高效率的微生物檢測與篩選。在皮納升微液滴反應器中，較為廣泛使用的裝置是熒光激活液滴分選系統(tǒng)（fluorescence activated droplet sorting，F(xiàn)ADS）。其是將液滴熒光檢測和介電泳分選方式進行集成設計，檢測到液滴熒光信號后，如果是感興趣的目標液滴，則在微流控芯片下游用介電泳所產(chǎn)生的驅(qū)動力推動至收集通道中，完成液滴的檢測分選［圖3（a）］，該技術平臺在微生物高通量篩選和酶進化領域已經(jīng)獲得了廣泛應用，有較多的相關文獻綜述報道［5，103-104］?；贔ADS技術，天木生物公司推出了商業(yè)化的超高通量單細胞篩選平臺DREM cell，實現(xiàn)了每天超百萬液滴的篩選通量，顯著提升表型測試效率，并使試劑消耗成本降低至傳統(tǒng)方法的百萬分之一。Wang等［79］將拉曼檢測技術和介電泳分選技術結(jié)合，成功搭建了拉曼激活液滴分選裝置（Raman activated droplet sorting，RADS）［圖3（b）］，并將其應用于產(chǎn)蝦青素的雨生紅球藻篩選，所獲得細胞陽性率約98.3%，分選速率為260個/s。Holland-Moritz等［91］將質(zhì)譜檢測與介電泳分選技術結(jié)合，將樣品液滴在微流控芯片上游進行分割，產(chǎn)生兩個相同子液滴，其中一個液滴進入電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）中進行檢測，獲得相關檢測數(shù)據(jù)，另一個液滴則根據(jù)檢測數(shù)據(jù)結(jié)果通過介電泳方式驅(qū)動進入收集通道或者廢液通道，完成液滴的質(zhì)譜檢測和分選［圖3（c）］，該裝置用于含有體外表達轉(zhuǎn)氨酶的液滴篩選，實現(xiàn)了0.7個/s的液滴篩選速率，準確率為98%。Hasan等［94］則將時間分辨熒光檢測技術與介電泳分選技術結(jié)合，實現(xiàn)了時間分辨熒光激活液滴分選系統(tǒng)，可根據(jù)不同熒光壽命對液滴進行分類［圖3（d）］。Zang等［81］通過對液滴成像，檢測液滴內(nèi)微生物的生長量，并結(jié)合液滴介電泳分選方式，實現(xiàn)對目標液滴的分選［圖3（e）］，該裝置應用于放線菌的生長情況檢測，可以實現(xiàn)100個/s的液滴分選速率，在篩選未知物種及其未被發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物方面有很大潛力。Gielen等［92］將光譜吸收檢測方法和介電泳分選技術集合，通過在液滴流路兩側(cè)放置光纖，兩側(cè)光纖分別連接光源和檢測器，用以測試液滴經(jīng)過檢測窗口時其光譜吸收變化，并根據(jù)光吸收變化對感興趣的目標液滴進行分選，實現(xiàn)光吸收激活液滴分選裝置（absorbance-activated droplet sorter，AADS）［圖3（f）］。該裝置用于苯丙氨酸脫氫酶的進化研究中，通過兩輪的定向進化，酶活性增加了2.7倍。

圖3 基于皮納升微液滴的單細胞表型測試與篩選Fig. 3 Single cell sorting based on droplet bioreactor with a volume of pico or nano liters

此外，采用雙乳化液滴［105-107］或凝膠液滴［108］的方式包裹微生物細胞，培養(yǎng)完成后可以在成熟的商用流式細胞儀中直接篩選，無需重新搭建新的液滴分選裝置。

然而，皮納升級生物反應器目前仍然存在一些問題和挑戰(zhàn)。由于皮納升級生物反應器體積很小，蒸發(fā)會對其產(chǎn)生很大的影響。皮納升級的微孔陣列生物反應器，往往需要覆蓋一層透氣性膜，以減少蒸發(fā)問題和交叉污染。相對于微孔陣列反應器而言，皮納升級液滴的蒸發(fā)速度較為緩慢，這得益于油包水的物理結(jié)構和表面活性劑的綜合作用［109-110］，這種作用也使得液滴之間相互隔絕，使液滴成為獨立的微型生物反應器［111-112］。但這種油包水液滴結(jié)構帶來了一些問題：第一，液滴操作性能嚴格受到油相和水相界面的約束［109］，對機械擾動和靜電非常敏感，機械振動會造成液滴之間的激烈碰撞，破壞液滴之間的油膜層而引起液滴之間相互融合，靜電則通過引起液滴界面的電荷分布發(fā)生變化而導致液滴融合，這些為液滴的操作和裝備化開發(fā)帶來了極大的技術挑戰(zhàn)。第二，液滴穩(wěn)定性與液滴內(nèi)部的生物過程有較大關系，微生物在液滴中可能消耗或產(chǎn)生一些化學物質(zhì)，這些化學物質(zhì)反過來可以改變液滴界面張力，從而影響液滴穩(wěn)定性，比如枯草芽孢桿菌代謝所產(chǎn)生的表面活性肽會進一步降低液滴界面張力。第三，對于難溶于水相的物質(zhì)，比如脂溶性分子，可能會“泄漏”到載體油相中而被油相萃取，而在水相和油相中都有一定溶解度的物質(zhì)則可能通過油相穿梭至鄰近的液滴，從而導致交叉污染［111，113-114］。這個問題最常見的處理方式是更換油相為HFE-7500油或FC-40氟碳油［115］，減少表面活性劑濃度［113，116］，添加牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）［113］，使用皮克林乳化劑［117］或在水相中增加糖含量［118］。

3 微升級生物反應器及其裝備化

傳統(tǒng)的微升級規(guī)模的微型生物反應器通常為多孔板，如96孔板、384孔板和1548孔板［119］。此外，還有單個液滴體積為0.1～4 μL、直徑小于2 mm的微升級液滴反應器［74，120-121］。與皮納升級別的生物反應器相比，微升級生物反應器可以為細胞的生長和代謝提供更多的營養(yǎng)物質(zhì)和生長空間，且細胞的光密度（optical density，OD）和熒光檢測方法更簡單。微升級生物反應器主要應用于單細胞培養(yǎng)和篩選，單批次通量約為102～103個。

微升級多孔板中，96孔板是最常用的多孔板。由于表面張力的影響，384孔板和1536孔板中的培養(yǎng)基不能被搖床產(chǎn)生的離心力顯著驅(qū)動，以致缺乏充分的混合而使細胞下沉到底部，并導致氧氣傳遞困難，使得氧氣傳遞速率（oxygen transfer rate，OTR）保持相對較低的水平，因此，384孔板和1536孔板的應用主要局限于厭氧菌株或類似于PCR的生化反應［122］。目前，96孔板已成為各種自動化設備的標準物理接口，包括平板挑單克隆儀、自動移液工作站、酶標儀、自動封板設備、培養(yǎng)箱等，用于微生物的高通量培養(yǎng)、分析和篩選［123］。同樣受制于表面張力，96孔板內(nèi)氧氣傳遞和混合受到限制，這經(jīng)常導致需要充分氧氣供應的微生物（例如酵母）生長不良［124］。而通過提高轉(zhuǎn)速來改善溶解氧和流體的混合，會導致剪切力的增加損傷微生物細胞，尤其是對剪切力較為敏感的細胞［125］。為了增加反應器內(nèi)溶氧（dissolve oxygen，DO）和混合程度，研究人員設計了不同材料、不同形狀和結(jié)構的微孔，包括方形、圓形、V形底部、U形底部等（圖4）［124，126-127］，并添加了全氟辛烷、全氟三丁胺、全氟萘等試劑作為氧載體增加供氧［128-130］。因此，科研人員需要根據(jù)實驗考慮單孔體積、形狀、材料等因素來選擇最合適的多孔板生物反應器。

圖4 多孔板中不同形狀的微孔［126］Fig. 4 Different well geometries in microwell plates[126]

標準96孔板的引入，不僅大大提高細胞的研究通量，同時實現(xiàn)了較大程度的自動化，通過整合機械臂、移液工作站、酶標儀、孔板覆膜機、培養(yǎng)箱等多種裝備，可以實現(xiàn)實驗過程的自動化和標準化，解放人力，顯著提升篩選通量。但96孔板系統(tǒng)同樣存在較多挑戰(zhàn)：①自動化的孔板系統(tǒng)所需要的設備數(shù)量多且價格昂貴，耗材和試劑消耗量大，運行費用高，操作復雜，且占用空間大，這些問題嚴重地限制了其廣泛應用；②孔板“邊緣效應”導致孔板培養(yǎng)結(jié)果的一致性相對較差［131］，影響了實驗結(jié)果的一致性；③96孔板的微孔之間距離過小，操作過程容易出現(xiàn)孔間交叉污染；④為了防止樣品在振動時飛濺，轉(zhuǎn)速對多孔板單孔細胞懸浮液的裝載量有所限制，轉(zhuǎn)速低會降低培養(yǎng)體系混合效果，而轉(zhuǎn)速越高，裝載量就越少，此時受蒸發(fā)的影響就越大。

微升級微液滴指的是體積在微升級別的油包水結(jié)構的微液滴，通常也被定義為“分段流”“柱塞流”等，可以包裹單個細胞或細胞群體進行細胞培養(yǎng)和檢測［132-134］。相較于皮納升級別的微液滴，微升級液滴可以為細胞生長提供更多的營養(yǎng)物質(zhì)和更長的培養(yǎng)時間，微生物濃度可以高達106～107CFU/mL，有利于代謝產(chǎn)物的充分生產(chǎn)，特別是需要充分生長才能產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物［135］。同樣地，為了保證微升級液滴生物反應器充足的氧氣供應，研究人員將液滴儲存在高透氣性材質(zhì)的微管路中，氧氣和二氧化碳可以通過微管路的管壁滲透到液滴和周圍環(huán)境中，完成氣體交換［35，135］。微升液滴的檢測方法簡單多樣，與皮納升級別的微液滴類似，但由于微升液滴體積大，對檢測的靈敏度和精度要求較皮納升級別液滴低，從而簡化了裝備設計，降低了儀器成本。而對于微升級液滴的分選，普通的聲場、電場、光場等無法產(chǎn)生足夠大的驅(qū)動力使液滴移動到收集通道或廢液通道，因此主要依靠流體力場和重力場將液滴驅(qū)動至收集容器中［35，136］。微升級液滴內(nèi)封裝的細胞數(shù)量同樣符合泊松分布統(tǒng)計學規(guī)律，因此，可以用于單細胞高通量篩選，如中國天木生物科技有限公司開發(fā)的商業(yè)化MISS cell系統(tǒng)、法國的Millidrop公司推出的Millidrop系統(tǒng)［35，137］。另外，微生物細胞接種懸浮液可以直接產(chǎn)生微升級液滴，以評價其在不同培養(yǎng)條件下的生長和代謝，如生長曲線測定、單因素多水平優(yōu)化實驗、適應性進化，不僅節(jié)省常規(guī)篩選方法需要的大量試劑和耗材，而且極大提高了自動化程度和實驗效率，獲得更豐富的微生物表型數(shù)據(jù)［120，135］。Jian等［135］和Jakiela等［120］以2μL液滴作為反應器，分別采用不同方式進行液滴生成、識別、檢測、分割、融合、分選等操作，實現(xiàn)微液滴微生物的培養(yǎng)、傳代、檢測和分選，提供了全自動化微生物微液滴適應性進化平臺［圖5（a）和（b）］，并分別成功應用于大腸桿菌對甲醇和抗生素的適應性進化實驗。Cao等［138］通過設計多通道流體混合流路實現(xiàn)了高維度濃度空間的液滴快速自動化制備，一次實現(xiàn)多達5000個不同種類和濃度的毒性物質(zhì)組合，可接種細胞進行細胞毒性測試［圖5（c）］，該系統(tǒng)應用于抗生素氨芐西林和氯霉素對大腸桿菌培養(yǎng)的干擾測試，并新發(fā)現(xiàn)了一種復雜的反應模式（包括協(xié)同效應和補償效應）。Baraban等［132］基于微升級液滴提出了一種新型的微流體液滴分析儀，該裝置前端可以將培養(yǎng)基、抗生素溶液、菌懸液等在微流道中進行混合并生成液滴，通過控制抗生素和培養(yǎng)基的流速，可以實現(xiàn)連續(xù)濃度梯度的抗生素液滴制備，并接入菌種進行生長，培養(yǎng)一段時間后，通過下游的熒光檢測裝置對微生物的生長量進行檢測和數(shù)據(jù)處理，從而完成菌株的藥敏測定［圖5（d）］。Boedicker等［133］采用類似的方式，在裝置前端生成不同抗生素濃度微液滴，接著，每個液滴與細菌活性指示劑和細菌懸液混合后重新生成液滴，并進行培養(yǎng)和檢測，分析菌株對不同抗生素的抗性情況，該方法可顯著縮短檢測時間，降低細菌樣品濃度要求，提高結(jié)果的準確性［圖5（e）］。Jian等［35］基于微升級液滴設計了全自動的單克隆挑取裝置［圖5（f）］，該裝置包含微升級液滴的發(fā)生、培養(yǎng)、檢測、分選至96孔板等多個模塊，可以實現(xiàn)單個微生物的液滴包裹生成、培養(yǎng)、OD檢測和分選目標液滴至孔板，具有微型化、自動化、高通量特點，并應用于大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌的單克隆挑選。

圖5 基于微升級微液滴的微生物培養(yǎng)和分析裝置Fig. 5 Microliter droplet-based microbial culture and analysis systems

微升級液滴的工程化應用研究同樣面臨諸多技術挑戰(zhàn)。一是微液滴的穩(wěn)定性常依賴于使用的表面活性劑，以防止液滴相互接觸后融合，但常規(guī)油相和表面活性劑體系能夠支持的液滴大小直徑不超過300 μm，大于該體積后，液滴接觸后極易相互融合，導致實驗體系被破壞，因此通過表面活性劑作用來阻止液滴融合的方式顯然不適用于微升級液滴體系。二是在透氣性微管路中培養(yǎng)的微升級液滴，由于其黏度、界面張力和尺寸等特征的不同，使其在靜止或運動過程中，造成不同液滴與油相之間的滑移情況有所差異，進而導致初始狀態(tài)下分散的液滴之間逐漸相互靠近并融合。因此，解決微升級液滴之間融合問題的關鍵是防止液滴之間的接觸。為了避免液滴之間接觸，需要不斷調(diào)整間隔距離，或者在液滴之間插入與油相和水相互不相溶的第三種介質(zhì)作為液滴間的屏障，從而避免液滴融合［139-141］。即使如此，仍然需要添加適當?shù)谋砻婊钚詣﹣肀３忠旱斡退缑娴姆€(wěn)定性，以避免液滴破碎、過乳化而造成的液滴內(nèi)容物泄漏問題。三是微升級液滴具有與皮納升級液滴相同的局限性，比如，一些分泌或降解表面活性劑的菌株篩選不適用，因為它們會破壞油水界面的穩(wěn)定性。部分絲狀菌（如霉菌）需要控制其在液滴中的培養(yǎng)時間，以避免菌絲伸出油水界面破壞液滴，造成交叉污染。

4 毫升級生物反應器及其裝備化

本文中，應用于表型測試的毫升級生物反應器是指體積范圍在1～100 mL的生物反應器，包括常見的深孔板（96/48/24/12/6孔單元數(shù)量）、試管、搖瓶、攪拌釜［142］和近期報道的微型管式生物反應器［75］。毫升級生物反應器可以提供相對可控的液體混合和氧氣傳質(zhì)效果，因此可用于初期的菌株培養(yǎng)生物工藝開發(fā)［142-143］。同時，毫升生物反應器仍然具有并行化、自動化和低成本的優(yōu)點，因此可用于一定通量的微生物表型測試和篩選場景，單批次通量常在101個。由于毫升級的培養(yǎng)體積較大，除了對pH/OD/DO等簡單參數(shù)的在線測量外，研究人員還可以取樣進行離線分析，采用更復雜的方法對樣品進行檢測，如色譜法、質(zhì)譜法、滴定法等，以獲得更多的生物過程表型參數(shù)。因此，毫升級生物反應器在微生物高通量篩選和發(fā)酵過程工藝優(yōu)化之間起著重要的橋梁作用。

深孔板類型的毫升級微型生物反應器，單孔體積同樣包含多種不同材質(zhì)以及不同形狀的深孔板，相對微升級多孔板而言，其單孔直徑和深度更大，這使得液體表面張力在孔板振蕩混合過程中的阻礙作用很小，有利于保證微生物的培養(yǎng)效果。同時，深孔板允許更大的液體振蕩幅度和更高的振蕩頻率，使得細胞懸液的混合和氧傳質(zhì)可控性增大，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱的振蕩幅度和頻率即可實現(xiàn)［126，144］。與微升級多孔板相似，為了避免水相的蒸發(fā)以及相鄰微孔間的交叉污染，常用透氣性的封口膜或夾心蓋覆蓋孔板。這些封口膜一方面對氧氣和二氧化碳有著較高的透過性，可滿足培養(yǎng)液氣體交換的需求，另一方面水蒸氣透過阻力大，減少培養(yǎng)液蒸發(fā)量［122，124，145-146］。但即使如此，封口膜在使用過程中，尤其是水蒸氣或者菌懸液凝結(jié)在封口膜上或者培養(yǎng)基振蕩過程中飛濺到封口膜上，會顯著增加氣體交換阻力，降低供氧效率，導致微孔的差異性增大［144，147］。基于光學檢測的非侵入性方法常作為深孔板內(nèi)細胞懸液的檢測手段，微孔里的生物量（通常采用OD值表征）基于光散射（發(fā)酵液內(nèi)細胞的散射）進行測定，而對于pH或DO檢測，常需要在孔板底部固定對應的熒光膜傳感器，通過測定熒光信號變化來檢測pH值和DO值［148-150］。比如，德國m2p labs公司所推出的Biolector系列商業(yè)化孔板反應器裝備［圖6（a）］，它是基于毫升級孔板和非侵入式光學傳感器的高通量微型生物反應器，工作體積為0.8～2.4 mL。為了實現(xiàn)更高的氧氣傳質(zhì)效率，其微孔形采用“梅花型”結(jié)構，用以增加旋轉(zhuǎn)振蕩過程的氧氣傳遞能力，同時微孔底部分別貼附pH和DO熒光膜傳感器，實時在線監(jiān)控pH、DO等參數(shù)［127］。

圖6 不同類型的毫升級微型反應器及其裝備Fig. 6 Different types of millilitre-scale microreactors

搖瓶和試管作為常見的振蕩型毫升級生物反應器，因其操作方便、價格低廉，廣泛應用于微生物篩選實驗和過程工藝初步研究［151］。與微孔板相似，該類型生物反應器的混合和氧傳遞也依賴于搖床振蕩頻率和幅度、液體裝樣體積比和內(nèi)部物理結(jié)構。試管的液體體積約為2～25 mL，搖瓶的液體體積約為20～500 mL，兩者的裝液量一般不超過生物反應器標準體積的20%。該類生物反應器的開口處常裝有棉花或塑料泡沫塞，以保持生物反應器內(nèi)部不受雜菌污染，同時提供充足的氣體傳質(zhì)。同樣地，類似于毫升級深孔板，細胞懸液的蒸發(fā)和飛濺會致使瓶口棉花或塑料泡沫等產(chǎn)生潤濕和污染，降低氣體交換速率［152］。對于毫升級試管和搖瓶的檢測，可利用的在線測量方法很少，基于搖瓶和試管的集成化微型生物反應器裝備仍比較稀缺［150，153-154］。美國頗爾（Pall）公司的Micro-24系統(tǒng)［圖6（b）］，有24個試管組作為反應器，每個反應器工作體積為5～7 mL，可獨立控制pH、溫度、DO等參數(shù)，且獲得的結(jié)果具有可放大性［156］。但該反應器的取樣和補料需要手動操作，這不僅中斷氧氣供應，而且增加樣品污染的風險。

攪拌生物反應器是一種帶有葉輪的反應器，廣泛用于發(fā)酵研究和生產(chǎn)。微型攪拌生物反應器與傳統(tǒng)的生產(chǎn)型攪拌生物反應器結(jié)構相似，且體積規(guī)模較小（小于100 mL），因此常用于早期發(fā)酵過程工藝開發(fā)［142，151］。微型攪拌式生物反應器由于體積限制，常規(guī)的pH檢測電極和DO檢測電極無法插入反應器內(nèi)部，因此常采用相應的熒光膜傳感器貼附于反應器內(nèi)壁，通過熒光檢測裝備讀取熒光信號值從而獲得pH值和DO等參數(shù)［157-158］。攪拌生物反應器中可采用多種不同結(jié)構的葉輪，提供不同的氧傳遞、剪切速率和流體混合的效果［159-161］。相對于毫升級搖瓶和試管而言，攪拌釜反應器可以支持長期連續(xù)培養(yǎng)，并持續(xù)獲取生物發(fā)酵過程參數(shù)，為后期菌株的發(fā)酵放大提供重要依據(jù)。但與其他小型生物反應器相比，毫升級攪拌式生物反應器具有較高的成本和復雜的操作，限制了其在高通量篩選中的應用。近年基于攪拌釜結(jié)構的生物反應器裝備研發(fā)進展較快，比如德國美諾公司研制的bioreactor 48反應系統(tǒng)，反應器容積8～15 mL，通量高達48個。其反應器由一次性的聚苯乙烯塑料器皿和磁力攪拌器構成，而攪拌器中集成了可通氣的管路來顯著提高供氧能力，可檢測參數(shù)包含pH、DO、OD，其中pH 和DO通過熒光膜進行實時檢測［162-163］。但由于采用了磁力攪拌方式，在發(fā)酵液黏度過大時，有可能造成攪拌減速或停止而無法繼續(xù)培養(yǎng)的問題。德國賽多利斯推出的Ambr 15微型反應器［164］［圖6（c）］，其主體結(jié)構為攪拌結(jié)構，可裝載體積為10～15 mL，單次可運行24～48個單元。溶氧的調(diào)控依賴于攪拌和通氣，每個單元具備獨立的通氣管路，因此可獨立控制溶氧，同時每個單元的取樣和補料通過機械臂實現(xiàn)獨立。該反應器裝備具有DO、pH的檢測功能，但由于采用特制的一次性微型攪拌槳，單個單元成本較高。

近年來，作者團隊利用高透氣性材質(zhì)（Teflon AF-2400）的微管路作為表型測試生物反應器，并進行裝備研制（EVOL cell）［圖6（d）］，用于微生物的毫升級規(guī)模培養(yǎng)［73，75］。毫升級微型管式生物反應器中，氧氣主要通過微管路管壁滲透到細胞培養(yǎng)基中，流體通過管內(nèi)介質(zhì)的連續(xù)流動進行混合，并進一步增強氧傳質(zhì)效果［165］。微管路內(nèi)細胞懸液的流動為典型的層流狀態(tài)，因此剪切力小，特別有利于流體力學敏感的細胞培養(yǎng)。在微型管式生物反應器中，由于流體的比表面積和流速穩(wěn)定，保證了氧傳遞速率和過程參數(shù)穩(wěn)定性，因此通過改變微型管式反應器的管路長度和并行數(shù)量，可以一定程度上實現(xiàn)微生物培養(yǎng)的“線性放大”。微型管式生物反應器由于采用特定的無泡供氧方式，使得反應器無需振蕩和攪拌，即可實現(xiàn)高效的氧氣傳遞，這使得培養(yǎng)液的在線檢測變得簡單。筆者團隊基于該反應器原理，在微型管路的兩側(cè)集成了用于OD實時監(jiān)測的光電傳感器，利用微管路的短光程檢測優(yōu)勢，實現(xiàn)了實時在線且超大量程（OD值檢測范圍0～20）的微生物生長監(jiān)測［75］。毫升級微型管式反應器有著巨大的發(fā)展?jié)摿?，但目前存在一定的問題和挑戰(zhàn)。第一，受微管路內(nèi)徑的限制，大粒徑、絮狀或高黏度的培養(yǎng)基可能造成管材堵塞，嚴重制約了其在微生物研究領域的應用。第二，管式反應器內(nèi)部流體剪切力低，貼近管壁附近的流速幾乎為零，這容易造成微生物的聚集吸附。雖然特氟龍管具有優(yōu)異的表面性能，能夠有效阻止吸附的產(chǎn)生，但對于一些產(chǎn)生表面活性劑、膠原物質(zhì)的微生物而言，仍然可能附著在管壁上形成生物膜。第三，微管路的內(nèi)徑較小，其內(nèi)部存在的氣泡對流動造成較大阻力，對反應器內(nèi)溶液的運動產(chǎn)生較大影響，表現(xiàn)為流動不順暢、連續(xù)流體被截斷，從而導致混合效果和溶氧一定程度上的變化，該類問題需要在工程化開發(fā)和應用過程中進一步優(yōu)化解決。

5 升級生物反應器及其裝備化

本文中，用于表型測試的升級生物反應器主要是指0.1～5 L的生物反應器，用于對高通量篩選得到的微生物進行進一步表型發(fā)酵驗證和放大。該生物反應器的主要類型為攪拌式生物反應器，具有pH、DO、溫度等檢測探頭，通過曝氣和攪拌實現(xiàn)溶氧控制，可進行分批或連續(xù)發(fā)酵（圖7）。改造高產(chǎn)菌種為了實現(xiàn)工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)，通常需要通過小型攪拌釜進行過程工藝初步開發(fā)，提供必要的發(fā)酵過程工程參數(shù)，如功率參數(shù)（功率/體積，P/V）、溶氧濃度或氧傳遞系數(shù)［143，167-168］、呼吸熵［169-170］等，再通過特定的放大系數(shù)和標準，對后期的放大生產(chǎn)進行指導［171-172］。為了提高反應器通量，研究人員將多個攪拌釜生物反應器進行并聯(lián)運行，并進一步集成裝備化，如上海國強生化的多聯(lián)罐生物反應器系統(tǒng)、迪必爾生物的平行反應器系統(tǒng)等。

圖7 典型攪拌式生物反應器結(jié)構示意圖［166］Fig. 7 Diagram for typical configurations of stirred bioreactors[166]

在生物發(fā)酵過程中，攪拌葉輪持續(xù)對反應器內(nèi)溶液進行攪拌增強混合和溶氧，但隨著發(fā)酵罐體積的增大，局部范圍內(nèi)溫度、pH、營養(yǎng)物質(zhì)濃度和DO仍然存在不均勻性，甚至對微生物生長產(chǎn)生抑制作用。在攪拌式生物反應器中，常規(guī)的DO、pH和溫度等參數(shù)可以在生物反應器中配備電極進行檢測，以及部分代謝參數(shù)可通過紅外光譜［173-174］、拉曼光譜［175-177］等光學手段進行檢測。除此之外，其他發(fā)酵過程參數(shù)的測量通常需要從反應器中取樣和處理，再利用特定的分析儀器進行分析，該過程操作煩瑣、所需時間較長，難以保證檢測的及時性。另外，很多發(fā)酵過程持續(xù)時間在數(shù)天至數(shù)周，常常需要不同操作人員輪流值班，給工程技術人員帶來了繁重的工作量。近年來，隨著采樣分析設備的出現(xiàn)，發(fā)酵參數(shù)的測量可以自動、在線、高頻、準確地進行。同時，根據(jù)發(fā)酵罐的在線檢測數(shù)據(jù)，還可以通過排料和補料，對發(fā)酵過程進行及時的反饋調(diào)整，如尹孚森生物技術公司（INFORS）的YSI-2980系統(tǒng)（德國）、迪必爾生物的Quiklfow系統(tǒng)（中國）、西爾曼科技的AP-100系統(tǒng)（中國）、天木生物科技有限公司的BODS系統(tǒng)（中國）等，這些集成化在線檢測裝備極大地提高了發(fā)酵罐的運行監(jiān)測和發(fā)酵過程控制效率，解放了人力，同時保證了數(shù)據(jù)的及時性、準確性和一致性，顯著提升發(fā)酵效率，對于細胞工廠表型測試和發(fā)酵放大具有重要的應用價值。此外，部分在線檢測設備具有留樣功能，可將發(fā)酵罐樣品保存至4 ℃環(huán)境，方便研究人員對數(shù)據(jù)進行回溯和重復測量，或?qū)⑺Ａ魳悠愤M行更復雜的離線檢測，如采用色譜法、質(zhì)譜法、滴定法等方式，以獲取更加全面、詳細的發(fā)酵過程參數(shù)。

6 總結(jié)與展望

不同尺度和不同通量的生物反應器為合成生物學DBTL循環(huán)過程的測試環(huán)節(jié)提供了重要的表型測試工具，根據(jù)不同的實驗目的和需求，選取合適類型的測試技術與裝備成為細胞工廠構建的關鍵環(huán)節(jié)，通常包括單細胞檢測與分選和皮納升級反應器、微升級反應器等進行細胞文庫的高通量測試和篩選，而毫升級生物反應器則兼顧細胞工廠的高通量篩選和初步發(fā)酵過程工藝開發(fā)，升級生物反應器則主要應用細胞的過程工藝開發(fā)，本文將上述不同測試裝備進行了歸納總結(jié)（表1）。

常規(guī)的合成生物學測試項目，往往包括聯(lián)合使用多種技術與裝備對細胞進行充分測試，以保證通量和過程工藝的一致性和合理性，提升測試效率。此外，當單細胞存在于皮納升級生物反應器和微升級生物反應器中時，這種極小的微空間隔離方式可以顯著增加細胞密度，體積越小其相對密度越大，且細胞分泌釋放的相關因子在細胞周圍環(huán)境聚集，濃度得到提升，極大地促進細胞生長和代謝，因此該類型生物反應器體積越小，細胞生長越迅速，這種方式稱為“隨機限域”（stochastic confinement）［133］。在限域空間內(nèi)，反應分子的擴散和相互作用均受到限制，分子間相互作用加強。同時，限域空間還可以促進反應物分子之間相互接近，從而增加反應的選擇性和特異性，這對酶催化反應極為重要。因此，相對于其他尺度較大的生物反應器，皮納升生物反應器和微升級生物反應器對于微生物的培養(yǎng)和代謝及酶催化反應有著顯著優(yōu)勢，日益成為合成生物學的重要研究平臺。

近些年作者團隊與天木生物科技有限公司緊密合作，研發(fā)了一系列用于合成生物學表型測試的高端裝備平臺，包括基于皮納升液滴高通量單細胞篩選平臺（DREM cell）、基于微升級液滴的單細胞高通篩選平臺（MISS cell）及微生物適應性進化系統(tǒng)（MMC）、基于微型管式反應器的毫升級微生物培養(yǎng)和馴化系統(tǒng)（EVOL cell）、基于升級以上規(guī)模發(fā)酵罐的生物發(fā)酵在線監(jiān)測系統(tǒng)（BODS）等，覆蓋了從皮納升到升級別的多種尺度和通量的生物反應器，構建了系列化的合成生物學表型測試平臺，在行業(yè)中得到了廣泛應用。

多孔板、搖瓶、攪拌釜發(fā)酵罐等不同類型的生物反應器發(fā)展由來已久，尤其是多孔板生物反應器和裝備，現(xiàn)階段已經(jīng)實現(xiàn)了自動化和集成化，但同時也遇到了技術升級瓶頸，例如，如何克服孔板氧氣傳遞受限、培養(yǎng)一致性差、通量低等問題，以及如何解決發(fā)酵過程的放大（scale-up）和縮小（scale-down）尺度差異等問題。同時全自動化微孔板操作平臺需要多套昂貴設備的聯(lián)動使用，搭建和維護成本高，需要空間大，限制了其推廣使用。液滴微流控技術具有操作容易、通量高、液滴培養(yǎng)數(shù)字化和易自動化等特點，是適于合成生物學高通量表型測試的頗具廣泛應用前景的方法。商業(yè)化的裝備系統(tǒng)體積小、運行成本低、使用和維護方便，越來越受到廣大科研人員和工程技術人員的關注，成為合成生物學發(fā)展的智慧平臺。目前，液滴微流控技術仍處于產(chǎn)業(yè)化上升期，雖然已有部分技術實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化推廣，但如何進一步實現(xiàn)微液滴的高度穩(wěn)定、提升液滴通量的精準可控性、實現(xiàn)微液滴裝備的創(chuàng)新定制化以及液滴操作的標準化和自動化等方面仍然存在大量的基礎科學和工程科學問題需要深入研究。另外，需要發(fā)展更多適用于不同尺度液滴體系的表型測試傳感器，顯著提升表型表征能力，構建更多維度的基因型-表型模型，為液滴微流控技術在DBTL循環(huán)中的應用提供更強大的使能工具，最終實現(xiàn)開發(fā)國產(chǎn)替代高通量自動化合成生物設施平臺，突破我國生物技術裝備研發(fā)能力弱、自主創(chuàng)新設備欠缺等“卡脖子”問題，加速我國合成生物技術原始創(chuàng)新步伐，支撐綠色生物經(jīng)濟的高質(zhì)量發(fā)展。