基于UPLC-Q-TOF/MS 鑒定健脾益腸散大鼠體內(nèi)外源物成分

孔心雨，李 璐，商 晶，劉文君，錢夢(mèng)雨，王振中，肖 偉,3*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210000

2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001

3.中藥過(guò)程控制與智能制造技術(shù)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 連云港 222001

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種炎癥性腸道疾病，臨床表現(xiàn)為腹痛、排便頻率增加、血性腹瀉或有黏液分泌物、體質(zhì)量下降、疲勞，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)發(fā)燒和嘔吐，極大影響患者的生活質(zhì)量[1]。健脾益腸散（Jianpi Yichang Powder，JPYCS）是出自貴州省名老中醫(yī)董菲洛教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方，對(duì)UC 有確切的治療效果[2]。方中黃芪為君藥，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、托毒生肌的功效；太子參補(bǔ)氣生津、補(bǔ)脾益肺，白術(shù)健脾益氣、燥濕利水，白豆蔻溫中行氣、化濕消疲，敗醬草清熱解毒、消癰排膿，木香健脾消食、行氣止痛，共為臣藥；芡實(shí)益腎補(bǔ)脾，補(bǔ)骨脂補(bǔ)腎止瀉，茯苓健脾滲濕，共為佐藥；炙甘草益氣和中，調(diào)和諸藥為使。諸藥合用，重在健脾胃之氣，滲補(bǔ)澀濁，清熱解毒[3]。目前對(duì)JPYCS 的研究主要集中在藥效學(xué)方面，已有研究證實(shí)該方能夠調(diào)節(jié)結(jié)腸組織中Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）、核因子-κB p65（nuclear factor kappa B p65，NF-κB p65）、共刺激分子CD40、CD86、CD80、和細(xì)胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)分子1（lymphocyte function-associated antigen-1，LFA-1）、熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）的表達(dá)水平[4-7]，發(fā)揮免疫炎癥抑制作用，促進(jìn)腸黏膜修復(fù)。其發(fā)揮藥效的機(jī)制可能還與調(diào)控核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）、TLR4/髓樣分化因子 88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）/NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)，具體的分子機(jī)制仍需繼續(xù)研究[8]。本實(shí)驗(yàn)室前期基于葡聚糖硫酸鹽（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)建立UC 小鼠模型[9-10]，再次驗(yàn)證了JPYCS 對(duì)UC 的治療作用。

藥物有效性是指“物質(zhì)清晰、機(jī)制明確、量效精準(zhǔn)”，解析復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)功效機(jī)制是體現(xiàn)中成藥原創(chuàng)優(yōu)勢(shì)的核心之一，是建立功效成分群保證中藥有效、安全、質(zhì)量可控的關(guān)鍵一步[11]。實(shí)驗(yàn)前期采用UPLC-QTOF/MS 技術(shù)對(duì)JPYCS 全方的化學(xué)成分進(jìn)行表征，總結(jié)了不同結(jié)構(gòu)類型化學(xué)成分的裂解規(guī)律，以便后續(xù)的物質(zhì)基礎(chǔ)研究。大多數(shù)中藥口服給藥后，在體內(nèi)經(jīng)過(guò)吸收、分布、代謝、排泄過(guò)程，進(jìn)入血液的原型成分、代謝成分或發(fā)生變化的內(nèi)源性成分是中藥復(fù)方發(fā)揮藥效的直接物質(zhì)[12]。本實(shí)驗(yàn)基于UPLC-Q-TOF/MS 技術(shù)，通過(guò)對(duì)比空白組和給藥組血漿、尿液、糞便樣品質(zhì)譜數(shù)據(jù)的差異，對(duì)JPYCS 給藥后在大鼠血漿、尿液、糞便中的原型成分和代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HSC-24A 氮吹儀（武漢愛(ài)佩斯科學(xué)儀器有限公司）；Agilent 1290 型超高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；Agilent 6538 Q-TOF 質(zhì)譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；Milli-Q 型純水儀（上海密理博有限公司）；Mettle Toledo XS205DU 型電子天平（梅特勒托利多儀器有限公司），Centrifugue 5424R 型高速離心機(jī)（德國(guó)艾本德股份公司）；KH2200B 型超聲清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；Vortex-5 型渦旋混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 試劑與材料

黃芪（批號(hào)Y221012）、太子參（批號(hào)Y221014）、白術(shù)（批號(hào)Y220305）、木香（批號(hào)Y221016）、白豆蔻（批號(hào)Y221013）、茯苓（批號(hào)Y220701）、芡實(shí)（批號(hào)Y220306）、敗醬草（批號(hào)Y221015）、補(bǔ)骨脂（批號(hào)Y221011）、炙甘草（批號(hào)Y220303），均購(gòu)自亳州市萬(wàn)珍中藥飲片廠。由康濟(jì)大藥房中藥執(zhí)業(yè)藥師吳舟鑒定，黃芪為膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根，太子參為石竹科植物孩兒參Pseudostellariaheterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根，白術(shù)為菊科植物AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖，木香為菊科植物木香AucklandialappaDecne.的干燥根，白豆蔻為姜科植物白豆蔻AmomumkravanhPierre ex Gagnep.的干燥成熟果實(shí)，茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf 的干燥菌核，芡實(shí)為睡蓮科植物芡EuryaleferoxSalisb.的干燥成熟種仁，敗醬草為敗醬科植物黃花敗醬Patrinia scabiosaefoliaFisch.的干燥全草的加工炮制品，補(bǔ)骨脂為為豆科植物補(bǔ)骨脂PsoraleacorylifoliaL.的干燥成熟果實(shí)，炙甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖的炮制加工，均符合《中國(guó)藥典》2020 年版各項(xiàng)要求。

芹菜素（批號(hào)7366）、芒柄花苷（批號(hào)3811）、黃芪皂苷IV（批號(hào)2779）、甘草苷（批號(hào)7306）、芹糖甘草苷（批號(hào)6969），購(gòu)自上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司；補(bǔ)骨脂素（批號(hào)110739-201918）、異補(bǔ)骨脂素（批號(hào) 110738-202016）、木香烴內(nèi)酯（批號(hào)111524-201711 ）、去氫木香烴內(nèi)酯（ 批號(hào)111525-201711），購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；補(bǔ)骨脂苷（批號(hào)Y3J11S20168）、異補(bǔ)骨脂苷（批號(hào)Y3J11S20168）、甘草酸（批號(hào)P18A11F111597），購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；夏佛塔苷（批號(hào)20191228）、甘草素（批號(hào)200708）、芒柄花素（批號(hào)200713），購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司。以上對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于 98%。肝素鈉（批號(hào)B805BA0008，BBI Life Science）；甲酸（質(zhì)譜級(jí)，美國(guó)西格瑪奧德里奇公司）；甲醇（質(zhì)譜級(jí)，美國(guó)賽默飛世爾科技公司）。

1.3 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自杭州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào)：20230427Aazz0100000734，許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0002。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫（22±2）℃，相對(duì)濕度50%～60%，自然光暗周期，自由飲水進(jìn)食。大鼠分籠飼養(yǎng)，2 只/籠，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理批準(zhǔn)號(hào)：2023042905。

2 方法

2.1 JPYCS 供試品溶液及對(duì)照品溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 稱取黃芪15 g、太子參15 g、白術(shù)12 g、白豆蔻6 g、木香6 g、敗醬草30 g、補(bǔ)骨脂20 g、芡實(shí)12 g、茯苓12 g、炙甘草6 g，混合藥材，浸泡1 h 后加入10 倍量水，加熱回流提取1.5 h，濾渣加入8 倍量水繼續(xù)提取1.5 h，合并藥液，減壓濃縮干燥得到干膏，得膏率為20.4%。取0.5 g干膏，加入25 mL 50%甲醇，超聲提取30 min，冷卻至室溫，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，得到待測(cè)樣品。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 稱取對(duì)照品芹菜素、芒柄花苷、黃芪皂苷IV、甘草苷、芹糖甘草苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、木香烴內(nèi)酯、去氫木香烴內(nèi)酯、補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、甘草酸、夏佛塔苷、甘草素、芒柄花素少量，加入50%甲醇溶解，配制成各成分質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及生物樣品采集

將14 只大鼠隨機(jī)分為2 組，空白組（n＝4）和給藥組（n＝10）。以0.5%羧甲基纖維素鈉作為給藥溶劑，給藥組大鼠按照70.245 g/(kg·d)（以JPYCS生藥量計(jì)算）劑量連續(xù)ig 給藥3 d，空白組同時(shí)給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。

大鼠最后1 次給藥前禁食12 h，不禁水。收集大鼠給藥后0～12 h 內(nèi)的糞便和尿液。給藥后0.25、0.5、1、2、4、6 h，麻醉大鼠，股動(dòng)脈取血，置于預(yù)先涂有1%肝素鈉的EP 管中，3 500 r/min 離心10 min 取上清液。以上樣品均置于?80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 生物樣品供試液的處理

2.3.1 血漿樣品制備 給藥組各時(shí)間點(diǎn)采集的血漿樣品混合均勻。分別取空白組和給藥組的血漿樣品各2 mL 置于EP 管中，加入6 mL 的甲醇溶液，渦旋混合，12 000 r/min 離心10 min 取上清液，37 ℃氮吹至干，殘留物加200 μL 50%甲醇復(fù)溶，12 000 r/min 離心10 min，取上清，得到血漿樣品的供試樣品。

2.3.2 尿液樣品制備 與上述血漿樣品供試樣品的制備方法相同。

2.3.3 糞便樣品制備 將各組糞便樣品混合均勻。分別取空白組和給藥組的糞便樣品0.5 g 置于EP 管中，加入3 倍量50%甲醇溶解，超聲30 min，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，37 ℃氮吹至干，殘留物加200 μL 50%甲醇復(fù)溶，12 000 r/min 離心10 min，取上清，得到糞便樣品的供試樣。

2.4 色譜與質(zhì)譜條件

2.4.1 色譜條件 色譜柱為 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%甲酸水（B），洗脫梯度（0～10 min，5%～25% A；10～20 min，25% A；20～24 min，25%～35% A；24～36 min，35%～65% A；36～48 min，65%～100% A。體積流量0.4 mL/min，進(jìn)樣量2 μL，柱溫30 ℃。

2.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正、負(fù)離子模式檢測(cè)。離子掃描范圍設(shè)置為m/z50～1 500；霧化氣壓力270 kPa；錐孔電壓65 V；OctopoleRFPeak 750 V；毛細(xì)管電壓正離子模式4 000 V、負(fù)離子模式3 500 V，裂解電壓135 V；干燥氣體積流量10.0 L/min；干燥氣溫度350 ℃；碰撞能量10、20、40 V；圖譜采集頻率：1.5 spectra/s。

2.5 數(shù)據(jù)處理

UPLC-Q-TOF/MS 采集的數(shù)據(jù)由 Agilent MassHunter 軟件（Qualification Analysis10.0）處理分析。通過(guò)提取各生物樣品中目標(biāo)化合物的EIC 離子流圖，質(zhì)量偏差設(shè)置為±2×10?5，對(duì)比化合物與對(duì)照品保留時(shí)間、二級(jí)特征碎片離子，并根據(jù)測(cè)得的精確相對(duì)分子質(zhì)量參考文獻(xiàn)中二級(jí)特征碎片離子，推測(cè)各成分代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及分子式。

3 結(jié)果

3.1 原型成分的鑒定

比對(duì)給藥樣品與空白樣品色譜峰的保留時(shí)間與峰面積，結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，對(duì)JPYCS 在體內(nèi)的原型成分進(jìn)行了檢識(shí)，其各樣品的EIC 離子峰疊加圖如圖1 所示。在給藥組生物樣品中共檢測(cè)到原型成分34個(gè)，包括黃酮類成分17 個(gè)、香豆素類成分6 個(gè)、萜類成分4 個(gè)、皂苷類4 個(gè)、有機(jī)酸類成分2 個(gè)、其他成分1 個(gè)。其中從血漿中檢測(cè)到31 個(gè)、尿液中檢測(cè)到30 個(gè)、糞便中檢測(cè)到14 個(gè)。具體信息見(jiàn)表1。

表1 大鼠生物樣品中JPYCS 原型成分的UPLC-Q/TOF-MS 數(shù)據(jù)Table 1 UPLC-Q/TOF-MS data of prototypes of JPYCS in rat biological samples

圖1 大鼠生物樣品中原型化合物提取離子色譜圖 (EICs)Fig.1 Extracted ion chromatograms (EICs) of prototypes in rat biological samples

3.2 代謝產(chǎn)物的鑒定

藥物代謝分為I 相反應(yīng)和II 相反應(yīng)，I 相反應(yīng)指氧化、還原、水解反應(yīng)，II 相反應(yīng)指藥物或經(jīng)I相反應(yīng)后的藥物代謝產(chǎn)物與內(nèi)源性結(jié)合劑的結(jié)合反應(yīng)。不同結(jié)構(gòu)類型的成分在體內(nèi)發(fā)生的代謝反應(yīng)不同，通過(guò)查閱文獻(xiàn)，對(duì)進(jìn)入體內(nèi)的原型成分進(jìn)行代謝產(chǎn)物的預(yù)測(cè)，提取預(yù)測(cè)代謝產(chǎn)物的EIC 離子流圖，比對(duì)質(zhì)譜二級(jí)碎片進(jìn)行人工檢識(shí)，各樣品的代謝產(chǎn)物EIC 離子峰疊加圖如圖2 所示。在給藥組生物樣品中共確定了79 個(gè)代謝產(chǎn)物，其中從血漿中檢測(cè)到37 個(gè)、尿液中檢測(cè)到73 個(gè)、糞便中檢測(cè)到16 個(gè)。具體信息見(jiàn)表2。

表2 大鼠生物樣品中JPYCS 代謝產(chǎn)物的UPLC-Q/TOF-MS 數(shù)據(jù)Table 2 UPLC-Q/TOF-MS data of metabolites of JPYCS in rat biological samples

圖2 大鼠生物樣品中代謝產(chǎn)物提取離子色譜圖 (EICs)Fig.2 Extracted ion chromatograms (EICs) of metabolites in rat biological samples

3.2.1 黃酮類成分的代謝產(chǎn)物及途徑分析 JPYCS進(jìn)入大鼠體內(nèi)的原型成分及代謝成分大多數(shù)為黃酮成分，這些黃酮成分按照母核結(jié)構(gòu)的特征分類可分為二氫黃酮類、黃酮類、異黃酮類。在I 相反應(yīng)中，黃酮類成分易發(fā)生氧化、還原反應(yīng)[13]。黃酮類成分的極性較小，進(jìn)入機(jī)體內(nèi)后多發(fā)生II 相反應(yīng)，與硫酸、葡糖醛酸、甲基結(jié)合以增大極性促進(jìn)其排出體外[14]。另外，黃酮類成分通常會(huì)通過(guò)逆狄爾斯-阿德?tīng)枺╮etro diels-alder reacition，RDA）裂解反應(yīng)，產(chǎn)生系列特征碎片，通過(guò)對(duì)比原型成分與代謝產(chǎn)物的RDA 裂解碎片可推測(cè)其代謝產(chǎn)物，此處以補(bǔ)骨脂二氫黃酮、夏佛塔苷、新補(bǔ)骨脂異黃酮為例，闡述黃酮類化合物的代謝途徑鑒定。

M9～M16 為補(bǔ)骨脂二氫黃酮（P23）的代謝產(chǎn)物。M9、M10 的準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+均為m/z341.138 7，相較 P23 高 16，確定其分子式為C20H20O5。其保留時(shí)間分別為34.271、33.305 min，并結(jié)合文獻(xiàn)中報(bào)道的出峰順序[15]，分別鑒定為補(bǔ)骨脂二氫黃酮的羥 基化和環(huán)氧化代謝物。M11 的準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+為m/z501.176 2，相較P23 高176，并存在碎片m/z325.143 3 [M＋H－GlcUA]+、269.081 2 [M＋H－GlcUA－C4H8]+、149.023 4 [M＋H－GlcUA－C4H8－C8H8O]+，與P23 經(jīng)RDA 裂解產(chǎn)生的特征碎片m/z269.081 4 [M＋H－C4H8]+、149.023 0 [M＋H－C4H8－C8H8O]+一致，鑒定其為補(bǔ)骨脂二氫黃酮與葡糖醛酸結(jié)合后的代謝產(chǎn)物。同理，M12 的準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+為m/z421.071 7，相較M9 高80，確定其分子式為C20H20O8S，特征碎片與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]，鑒定其為M9 與硫酸結(jié)合后的產(chǎn)物。M14、M15 的準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+均為m/z323.128 7，相較M10 低18，提示其為M10碳骨架重排后脫去1 分子H2O 形成的產(chǎn)物。其保留時(shí)間分別為39.824、40.465 min，在反相色譜柱中，二氫黃酮類化合物保留時(shí)間先于查耳酮類化合物，因此推測(cè)二者結(jié)構(gòu)如圖3 所示。

圖3 補(bǔ)骨脂二氫黃酮可能的代謝途徑Fig.3 Metabolic pathways of bavachin

M17、M18 為夏佛塔苷（P10）的代謝產(chǎn)物。M17 的準(zhǔn)分子離子峰 [M－H]?為m/z561.126 0，相較P10 低2，存在碎片m/z517.135 9 [M－HC2H4O]?，鑒定其為夏佛塔苷糖環(huán)脫氫后的代謝產(chǎn)物。M18的準(zhǔn)分子離子峰 [M－H]?為m/z531.150 7，相較P10 低32，存在碎片m/z355.119 0 [M－HC6H8O6]?，鑒定其為夏佛塔苷糖環(huán)脫氧后的代謝產(chǎn)物。夏佛塔苷屬于黃酮苷類成分，進(jìn)入體內(nèi)后可經(jīng)糖苷酶水解，脫去葡萄糖基和阿拉伯糖基轉(zhuǎn)化為芹菜素。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[16-17]，芹菜素可在腸道內(nèi)吸收，經(jīng)歷I 相反應(yīng)后，在Ⅱ相酶作用下，發(fā)生葡萄糖醛酸化和硫酸化反應(yīng)。M19～M24 為芹菜素（P18）的代謝產(chǎn)物，與文獻(xiàn)中的代謝規(guī)律相符。夏佛塔苷、芹菜素在體內(nèi)的代謝途徑見(jiàn)圖4。

M35～M43 為新補(bǔ)骨脂異黃酮（P27）的代謝產(chǎn)物。新補(bǔ)骨脂異黃酮與補(bǔ)骨脂二氫黃酮的結(jié)構(gòu)類似，側(cè)鏈都為直鏈異戊烯基，因此代謝途徑上有一定的相似性。M35、M36 的準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+為m/z339.125 7，與P28 相比，相差16，確定分子式為C20H18O5。二者均有特征碎片m/z137.020 7 [M＋HC13H14O2]+，因此推測(cè)羥基連接在異戊烯基上，查閱文獻(xiàn)報(bào)道[15,18-19]可知，直鏈異戊烯基可在體內(nèi)肝微粒體酶的作用下發(fā)生環(huán)氧化反應(yīng)，也可在體內(nèi)代謝成2-羥基-3-甲基-3-丁烯基片段，因此推測(cè)M35、M36 的結(jié)構(gòu)如圖5 所示。新補(bǔ)骨脂異黃酮的主要代謝途徑與補(bǔ)骨脂二氫黃酮類似，主要的代謝包括氧化、還原、環(huán)合、脫氧、硫酸結(jié)合、葡糖醛酸結(jié)合。

3.2.2 香豆素類成分的代謝產(chǎn)物及途徑分析 大鼠血漿、尿液、糞便中檢測(cè)到的香豆素類成分均源于補(bǔ)骨脂，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素及其苷為補(bǔ)骨脂藥材的主要功效成分，補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷在體內(nèi)可經(jīng)腸道菌群的作用脫葡萄糖基化轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的苷元補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素[20]，進(jìn)而發(fā)生氧化、還原、葡萄糖醛酸化等一系列反應(yīng)。M51～M60 為補(bǔ)骨脂素（P14）的代謝產(chǎn)物。M51 的準(zhǔn)分子離子峰[M＋H]+為m/z203.034 0，相較P14 高16，確定分子式為C11H6O4，存在碎片m/z175.038 2 [M＋HCO]+, 147.043 6 [M＋H－2CO]+，與P14 的裂解規(guī)律一致，鑒定其為補(bǔ)骨脂素羥基化代謝物。M56 的準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+為m/z221.044 0，相較M51 高18，存在碎片m/z203.033 4 [M＋H－H2O]+、175.039 6[M＋H－H2O－CO]+，鑒定M56 是M51 水合反應(yīng)后的代謝產(chǎn)物。M56 進(jìn)一步在體內(nèi)發(fā)生還原反應(yīng)則產(chǎn)生代謝產(chǎn)物M57，發(fā)生羥基化反應(yīng)則產(chǎn)生代謝產(chǎn)物M58。根據(jù)上述代謝規(guī)律，推測(cè)補(bǔ)骨脂素在體內(nèi)的代謝途徑如圖6 所示。

圖6 補(bǔ)骨脂素可能的代謝途徑Fig.6 Metabolic pathways of psoralen

3.2.3 萜類成分的代謝產(chǎn)物及途徑分析 大鼠血漿、尿液、糞便中檢測(cè)到的萜類成分主要源于木香，去氫木香內(nèi)酯和木香烴內(nèi)酯都是倍半萜類成分，但是其在體內(nèi)發(fā)生的代謝反應(yīng)并不相同，M64-M74 為去氫木香內(nèi)酯（P24）的代謝產(chǎn)物，M75-M79 為木香烴內(nèi)酯（P25）的代謝產(chǎn)物。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[21]，去氫木香內(nèi)酯在大鼠體內(nèi)主要發(fā)生I 相反應(yīng)，包括羥基化、水合、脫氫、脫水。P24 進(jìn)入大鼠體內(nèi)后連續(xù)2 次羥基化形成M64、M66，連續(xù)發(fā)生2 次水合反應(yīng)形成M67、M69，連續(xù)發(fā)生2 次脫氫形成M70、M72。M74 的準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+為m/z392.153 4，確定其分子式為 C20H25NO5S，且存在碎片m/z185.132 4 [M＋H－NAC－H2O]+、157.099 8 [M＋H－NAC－H2O－CO]+，與P24 的裂解規(guī)律一致，鑒定M74 為去氫木香內(nèi)酯與乙酰半胱氨酸結(jié)合的代謝產(chǎn)物。根據(jù)上述代謝規(guī)律，推測(cè)去氫木香內(nèi)酯在體內(nèi)的代謝途徑見(jiàn)圖7。木香烴內(nèi)酯主要發(fā)生II 相反應(yīng)，包括半胱氨酸結(jié)合形成M76、乙酰半胱氨酸結(jié)合形成M77、谷胱甘肽結(jié)合形成M79，與文獻(xiàn)報(bào)道的木香烴內(nèi)酯在體內(nèi)可能發(fā)生的代謝途徑相同[22]。

圖7 去氫木香內(nèi)酯可能的代謝途徑Fig.7 Metabolic pathways of dehydrocostuslactone

4 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)UPLC-Q-TOF/MS 技術(shù)對(duì)JPYCS給藥后進(jìn)入體內(nèi)的原型成分和代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢識(shí)，共檢識(shí)出34 個(gè)原型成分和79 個(gè)代謝產(chǎn)物，包括黃酮類、香豆素、萜類和皂苷類成分，在體內(nèi)的代謝反應(yīng)主要為氧化、還原、甲基化、葡糖醛酸結(jié)合、硫酸結(jié)合等。

JPYCS 是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)發(fā)揮治療UC 的作用?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類成分可以誘導(dǎo)保護(hù)性細(xì)胞因子和酶，通過(guò)調(diào)節(jié)芳香烴受體來(lái)增強(qiáng)抗炎作用[23]。毛蕊異黃酮、芒柄花素是黃芪中主要的黃酮類成分，可經(jīng)羥基化、脫羥基反應(yīng)進(jìn)行相互轉(zhuǎn)化[24]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，芒柄花素在體內(nèi)能夠發(fā)生硫酸結(jié)合、葡糖醛酸結(jié)合等反應(yīng)，繼而以尿液的形式排出體外。毛蕊異黃酮及其葡萄糖苷也是黃芪中的主要黃酮類成分之一，但其原型成分并未在本實(shí)驗(yàn)生物樣品檢測(cè)到，可能與毛蕊異黃酮及其葡萄糖苷在體內(nèi)代謝迅速有關(guān)[25]。

香豆素類成分主要來(lái)源于補(bǔ)骨脂，補(bǔ)骨脂在UC 的臨床治療中為高頻用藥，補(bǔ)骨脂素能減少肝臟膽汁酸合成及其在結(jié)腸處的聚集，從而改善膽汁酸對(duì)結(jié)腸的損傷[26]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂素主要發(fā)生的代謝反應(yīng)有氧化、還原、水合、硫酸結(jié)合、葡糖醛酸結(jié)合等，而補(bǔ)骨脂苷只以原型形式被檢測(cè)到，推測(cè)補(bǔ)骨脂苷在體內(nèi)脫糖基轉(zhuǎn)化為補(bǔ)骨脂素，對(duì)腸道損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

萜類成分主要來(lái)源于木香，有研究表明，大鼠給藥木香后，木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯會(huì)在結(jié)腸處積累，改善腸道菌群均勻性和多樣性，木香烴內(nèi)酯還可通過(guò)抑制HIF-1α 介導(dǎo)的糖酵解調(diào)節(jié)Th17 細(xì)胞的分化來(lái)緩解UC 的治療[27-28]。本實(shí)驗(yàn)中，在體內(nèi)不僅檢測(cè)到去氫木香內(nèi)酯和木香烴內(nèi)酯的原型成分，在血漿、尿液中也檢測(cè)到其多種形式的代謝產(chǎn)物。推測(cè)木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯可能是JPYCS 發(fā)揮UC 藥效的重要成分。

皂苷類成分是黃芪中的主要活性成分。其中，黃芪皂苷IV 能夠預(yù)防和改善DSS 誘導(dǎo)UC 發(fā)生的氧化應(yīng)激損傷[29]。本實(shí)驗(yàn)在給藥組血漿、尿液、糞便組中均檢測(cè)到了原型成分黃芪皂苷IV，但并未識(shí)別到相關(guān)代謝產(chǎn)物，黃芪中其他皂苷類原型成分也未被檢識(shí)到。有研究表明黃芪皂苷I～I(xiàn)II 和黃芪甲苷可在人源腸道菌群中代謝轉(zhuǎn)化[30]，推測(cè)是由于皂苷類化學(xué)成分的相對(duì)分子質(zhì)量較大，口服給藥后吸收率較低，導(dǎo)致在實(shí)驗(yàn)生物樣品中含量低，難以被檢測(cè)到；也可能與本實(shí)驗(yàn)的生物樣品前處理方法導(dǎo)致該類成分的回收率較低有關(guān)，應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化生物樣品的前處理方法；排泄途徑能有效反映藥物作用方式，藥物及其代謝產(chǎn)物主要經(jīng)腎臟從尿液中排出或經(jīng)膽汁從糞便排出，膽汁中的代謝產(chǎn)物易富集[31]，因此后續(xù)應(yīng)增加膽汁中代謝成分的鑒定。

本研究采用UPLC-Q/TOF-MS 技術(shù)，表征了JPYCS 給藥后在體內(nèi)的移行成分，后期可基于本實(shí)驗(yàn)提供的物質(zhì)基礎(chǔ)繼續(xù)研究JPYCS 體內(nèi)發(fā)揮藥理活性的作用機(jī)制，促進(jìn)其更廣泛的臨床應(yīng)用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突