載錳單原子納米酶和驅蛔素的殼聚糖水凝膠制備及其抗幽門螺桿菌活性

張丁丁，郭 榮，趙松峰，段 飛，丁 波，韓冰潔，荊自偉*

1.鄭州大學第一附屬醫(yī)院 藥學部，河南 鄭州 450052

2.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 消化科，河南 鄭州 450099

3.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 藥學部，河南 鄭州 450099

4.鄭州大學第一附屬醫(yī)院 轉化醫(yī)學中心，河南 鄭州 450052

幽門螺桿菌Helicobacterpylori是導致胃炎、消化性潰瘍的主要誘因，同時也是胃癌的第1 類致癌因素[1]。流行病學調查顯示，我國自然人群的幽門螺桿菌感染率高達56.22%[2]。2017 年《ACG 臨床指南：幽門螺桿菌感染的治療》推薦標準三聯(lián)或含鉍劑四聯(lián)療法作為抗幽門螺桿菌感染的一線治療方案[3]。然而《第五次全國幽門螺桿菌感染處理共識報告》指出，我國幽門螺桿菌對甲硝唑、克拉霉素和氟喹諾酮類等傳統(tǒng)抗菌藥物的耐藥率逐漸上升，并且二重、三重甚至更多重耐藥現(xiàn)象也已出現(xiàn)，使幽門螺桿菌根除率呈下降趨勢，感染者存在嚴重疾病風險[4-5]。

納米酶（nanozyme）是一類既有納米材料的獨特性能，又有催化功能的模擬酶，目前，納米酶已被認為是一類有前途的抗菌劑[6-7]?；谶^氧化物酶（peroxidase，POD）和氧化物酶（oxidase，OXD）等多酶催化活性，納米酶觸發(fā)的化學動力治療可以催化內源性過氧化氫（H2O2），產生活性氧［如羥基自由基和超氧陰離子等］，實現(xiàn)廣譜的抗菌治療，同時避免常規(guī)藥物的耐藥性[8]。受天然酶結構啟發(fā)，研究人員通過模擬其金屬-Nx活性單元，陸續(xù)開發(fā)出錳、鈷、鉑、鐵單原子納米酶等[9]。單原子納米酶具有可設計的幾何結構和電子配位、獨特的量子尺寸效應和最大限度的原子利用效率[9-10]。Zhu 等[11]采用PEG 修飾中空的錳單原子納米酶（manganese single-atom nanozymes，MnSAE），呈現(xiàn)出高度分散的錳原子位點、無定形結構、自然價態(tài)Mnδ，同時具有類過氧化氫酶（catalase，CAT）、OXD 和POD活性，可發(fā)生級聯(lián)催化反應，產生豐富的活性氧，用于殺傷腫瘤細胞[11]。

中醫(yī)藥在根除幽門螺桿菌感染方面具有不良反應少、耐藥性低、不易引起腸道菌群失調、與化學藥聯(lián)用能夠提高根除率并降低復發(fā)、改善臨床癥狀等優(yōu)勢[12]。土荊芥ChenopodiumambrosioidesL.是中成藥荊花胃康膠丸的一味主藥，用于治療幽門螺桿菌感染所致的胃炎、胃潰瘍等，對胃食管返流病、功能性消化不良等也有較好的療效[12]。張學智課題組[13-14]發(fā)現(xiàn)荊花胃康膠丸原料藥和土荊芥具有顯著的體外抗幽門螺桿菌作用，與抗菌藥物聯(lián)用后，抗菌效果顯著增強。聶小妮等[15]研究證實，我國9 省12 個產區(qū)的土荊芥揮發(fā)油的化學成分主要為驅蛔素（ascaridole，Asc）、α-松油烯、p-傘花烴和冰片烯等。采用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS 技術對土荊芥甲醇提取物進行定量，發(fā)現(xiàn)驅蛔素在土荊芥中質量分數(shù)為25.7%。

因此，將納米生物醫(yī)學和土荊芥的現(xiàn)代化研究相結合，能夠成為治療幽門螺桿菌感染可行的策略之一。幽門螺桿菌表達一類尿素膜通道蛋白（urea membrane channel protein，Ure I），能夠選擇性地將宿主代謝產生的尿素（urea）轉運到胞內，被胞質中的脲酶（urease）分解為氨和二氧化碳，中和胃酸，從而保護細菌免受胃酸的破壞?；凇癠rea-Ure I”理論，本課題組前期構建一系列以脲基（urea-）為靶頭、Ure I 為受體的殼聚糖靶向納米粒，用于幽門螺桿菌感染的靶向治療，顯示出良好的pH 敏感性、胃黏附性、Ure I 靶向性和抗菌活性[16-18]。進一步地，本課題首先制備脲基修飾的殼聚糖（chitosan，Cs）靶向材料，然后構建具有靶向作用和胃黏附特性的水凝膠，共載單原子納米酶和驅蛔素，通過化學動力和化學治療的協(xié)同作用，發(fā)揮優(yōu)異的抗菌活性。本研究為幽門螺桿菌的根除治療提供一種新的思路，具有重要的研究價值和臨床意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器

OTF-1200X 型管式爐，沈陽科晶自動化設備有限公司；AL104 型萬分之一分析天平，瑞士Mettler Toledo 公司；AVANCE NEO 400M 型核磁共振波譜儀，德國Bruker 公司；Nicolet iS20 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀、Multiskan SkyHigh 型多功能酶標儀，美國Thermo Fisher Scientific 公司；Gemini SEM 300 型掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM），德國ZEISS 公司；Tecnai F20 型透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM），美國FEI 公司；TMS-PRO 型質構儀，北京盈盛恒泰科技有限責任公司；F98 型熒光分光光度計，上海精密儀器有限公司；UV-1800PC 型紫外-可見分光光度計，上海美西樂儀器有限公司；LSM 980 激光共聚焦掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM），德國ZEISS 公司。

1.2 材料與試劑

殼聚糖，95%脫乙酰度，黏度100～200 mPa·s，分析純，上海阿拉丁生化試劑公司；NH2-PEGCOOH，相對分子質量2 000，上海炎怡生物技術有限公司；尿素、2-甲基咪唑、鄰苯二甲酸酐、十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、四水合氯化錳（MnCl2·4H2O）、對苯二甲酸（TA）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽［1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDCI］，分析純，上海麥克林生化科技有限公司；Zn(NO3)2·6H2O，分析純，鄭州派尼化學試劑廠；驅蛔素，分析純，美國City Chemical LLC公司；鄰苯二甲酸酐，化學純，上海薩恩化學技術有限公司；水合肼，化學純，天津富宇精細化工有限公司；3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、1,3-二苯基異苯并呋喃（DPBF），分析純，北京索萊寶科技有限公司。

幽門螺桿菌SS1 菌株，由西安交通大學曹永孝教授惠贈；人正常胃黏膜上皮GES-1 細胞，美國ATCC 細胞庫。

2 方法與結果

2.1 脲基PEG 殼聚糖材料（Urea-PEG-Cs，UPCs）的合成與表征

2.1.1 UPCs 的合成 由圖1 可知，UPCs 的合成包括2 部分。第1 步，尿素與NH2-PEG-COOH 通過取代反應合成中間體化合物Urea-PEG-COOH；第2步，首先采用鄰苯二甲酸酐對殼聚糖的C2-氨基進行保護合成PACs，之后其C6-羥基和Urea-PEGCOOH 發(fā)生酯化反應生成Urea-PEG-PACs，最后利用水合肼脫去鄰苯二甲酸酐，得到UPCs。

圖1 UPCs 的合成路線Fig.1 Synthetic route of UPCs

將9.29 mmol 的NH2-PEG-COOH 溶于15 mL無水吡啶中，再加入9.75 mmol 的尿素連續(xù)攪拌，回流反應24 h，冷卻后析出結晶產物，經濾過、蒸餾水洗滌，乙醇重結晶，得到Urea-PEG-COOH。

將6.14 mmol 的殼聚糖加入到50 mL 的95%DMF/H2O 混合溶劑。加熱攪拌下加入18.42 mmol的鄰苯二甲酸酐?；亓鞣磻? h 后停止，將反應液倒入冰水中，充分析出沉淀后抽濾，60 ℃真空干燥箱中干燥，得到鄰苯二甲酸酐修飾的殼聚糖（PACs）。稱取1.69 mmol 的Urea-PEG-COOH 加入25 mL 的DMF。室溫攪拌后加入1.69 mmol 的NHS和1.69 mmol 的EDCI。反應2 h 后加入16.9 mmol的PACs。繼續(xù)攪拌72 h 后停止反應，抽濾，用甲醇洗滌濾餅。放入60 ℃真空干燥箱中干燥，得到Urea-PEG-PACs。將上述Urea-PEG-PACs放入15 mL的DMF 中，之后加入45 mL 的水合肼，加熱回流7 h 后停止，將反應液倒入冰水中析出沉淀，抽濾，用蒸餾水和乙醇洗滌濾餅。放入60 ℃真空干燥箱干燥，得到產物UPCs。

2.1.2 UPCs 的1H-NMR 和FTIR 表征

（1）1H-NMR：使用400 MHz 核磁共振波譜儀對Urea-PEG-COOH 進行核磁共振氫譜（1H-NMR）分析。取5 mg 的UPCs 用CF3COOD/D2O 溶解，于25 ℃下進行1H-NMR 分析。1H-NMR 圖譜（圖2-a）顯示，殼聚糖骨架C1的H 出峰位置在δ4.32～4.52，Urea-PEG-COOH 連接臂的亞甲基的特征峰在δ1.53～1.71 處出現(xiàn)。

圖2 UPCs 的1H-NMR (a) 和FTIR (b) 表征Fig.2 1H-NMR (a) and FTIR (b) characterization of UPCs

（2）FTIR：使用FTIR 儀對UPCs 進行表征。取適量UPCs 與溴化鉀混合，使用研缽充分研磨至粉末狀，并進行壓片處理。用FTIR 儀對樣品進行掃描，掃描范圍為400～4 000 cm?1。由FTIR 圖譜（圖2-b）可見，在1 636～1 655 cm?1可觀察到脲基（urea-）的特征吸收峰。由此推斷，靶向的脲基頭部成功地連接到殼聚糖骨架上，其結構與目標物結構一致。

2.2 共載錳單原子納米酶（Mn single-atom nanozyme，MnSAE）的制備

MnSAE 的制備方法見文獻報道[11]。將60 mg 的ZnNO3·6H2O 和2 mg 的CTAB 溶于適量水溶液，然后加入到含有908 mg 的2-甲基咪唑的水溶液中，室溫條件下劇烈攪拌2 h，制備ZIF-8 立方體結構。取上述得到的20 mg 的ZIF-8 加入適量去離子水中，超聲10 min 得到均一分散的溶液，加入2 mL 的25 mg/mL 的鞣酸溶液，室溫條件下繼續(xù)攪拌2 h，經13 000 r/min 離心10 min，水洗3 次后冷凍干燥，得到空心的ZIF-8 納米立方體。取20 mg 空心的ZIF-8 分散于10 mL 去離子水中，超聲10 min 形成均一分散的溶液，緩慢加入10 mg/mL 的MnCl2·4H2O 水溶液，室溫條件下繼續(xù)攪拌3 h。將反應液13 000 r/min 離心10 min，水洗后冷凍干燥，得到Mn-ZIF-8。上述產物放入管式爐中，以5 ℃/min 的速度升溫至900 ℃并在氬氣保護下維持2 h，后自然降至室溫，得到MnSAE。

2.3 殼聚糖靶向水凝膠的制備

稱取120 mg 的UPCs 加入到4 mL 的1%鹽酸溶液中，充分溶解，使其質量濃度為30 mg/mL。將5 mg 的MnSAE＋5 mg 的驅蛔素分散到UPCs 溶液中，震蕩混勻。即得到Asc/MnSAE@UPCs 水凝膠，冷凍干燥，放入4 ℃冰箱中，備用。

另外，分別用殼聚糖替代UPCs，驅蛔素、MnSAE 替代MnSAE＋驅蛔素，制備殼聚糖水凝膠、Asc@UPCs 水凝膠、MnSAE@UPCs 水凝膠、Asc/MnSAE@Cs 水凝膠作為后續(xù)實驗對照。

2.4 MnSAE 和殼聚糖靶向水凝膠的形態(tài)學表征

2.4.1 SEM 觀察 通過SEM 觀察水凝膠的內部形貌。將凍干后的水凝膠切片制樣，用導電膠固定在銅片上，真空條件下將其表面均勻噴金，在加速電壓為20 kV 條件下用SEM 觀察并拍照。

2.4.2 TEM 觀察 利用TEM 觀察MnSAE 和水凝膠的形貌和主要元素分布。將Asc/MnSAE@UPCs水凝膠重分散在水溶液中，之后滴到400 目銅網上，靜置一段時間，樣品用2%磷鎢酸鈉負染5 min，自然風干，置于TEM 下觀察MnSAE 和水凝膠形態(tài)，并用X 射線能譜儀進行元素分布（energy dispersive X-ray spectroscopy mapping，EDS-mapping）分析。

2.4.3 MnSAE 和Asc/MnSAE@UPCs 水凝膠的形態(tài)學表征結果 TEM 結果提示，MnSAE 為空心的立方體結構，能夠更好地吸附錳元素，保證錳單原子的最大利用效率（圖3-a）。SEM 和TEM 結果表明，Asc/MnSAE@UPCs 水凝膠為多層大孔結構（圖3-b、c）。

圖3 MnSAE 的TEM 圖 (a) 及Asc/MnSAE@UPCs 水凝膠的SEM 圖 (b)、TEM 圖 (c) 和元素分布結果 (d～i)Fig.3 TEM image of MnSAE (a), and SEM image (b), TEM image (c), and EDS mapping results (d?i) of Asc/MnSAE@UPCs hydrogels

通過元素分布結果可知，水凝膠中主要含有C、N、O、Mn 和Zn 元素，5 種元素均勻分布在水凝膠中，此外，經計算Mn 元素質量分數(shù)為0.36%，證實MnSAE 成功結合到水凝膠中（圖3-d～i）。

2.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 進行數(shù)據分析。所有數(shù)據均表示為±s。應用單因素方差分析比較各組水凝膠溶脹度、黏附強度、對GES-1 細胞增殖影響和體外抗菌活性。P＜0.05 時，表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2.6 Asc/MnSAE@UPCs 水凝膠的體外釋藥研究

取經冷凍干燥的Asc/MnSAE@UPCs 水凝膠30 mg，放入預先處理過的透析袋（截留相對分子質量7 000），分別放于含有100 mL 不同pH 值的溶液（pH 1.2 醋酸溶液和pH 6.0、pH 7.4 PBS 緩沖液）中。設置恒溫水浴振蕩器的水浴溫度為（37.0±0.5）℃，振蕩頻率為100 r/min，分別于0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、18.0、24.0 h 取樣2 mL 并補充等量同溫度的溶出介質。采用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS 定量分析驅蛔素含量并計算累積釋放率。

Asc/MnSAE@UPCs 水凝膠在不同pH 值緩沖液中的釋放曲線見圖4?？芍狝sc/MnSAE@UPCs 水凝膠對驅蛔素的釋放具有緩釋作用。與pH 6.0 和pH 7.4 的PBS 緩沖液相比，驅蛔素在pH 1.2 的醋酸溶液中的釋放更快，提示其具有pH 敏感性，說明殼聚糖靶向材料/β-甘油磷酸鈉水凝膠在酸性環(huán)境中具有更為疏松的凝膠網絡結構，有利于驅蛔素從水凝膠中釋放到酸性的幽門螺桿菌感染部位，從而發(fā)揮治療作用。

圖4 Asc/MnSAE@UPCs 水凝膠的釋藥曲線 (±s , n = 3)Fig.4 Release curves of ascaridole from Asc/MnSAE@UPCs hydrogels (±s , n = 3)

2.7 水凝膠的體外溶脹研究

通過測定水凝膠的平衡溶脹度來評價其溶脹性能。首先，稱取20 mg 的凍干水凝膠（Wdry），置于含有30 mL PBS 的燒杯中，達到溶脹平衡。然后用濾紙除去溶脹的水凝膠表面的水分，并稱定質量（Wswollen），每組水凝膠重復測量3 次，計算水凝膠的溶脹度。

溶脹度＝(Wswollen－Wdry)/Wdry

殼聚糖水凝膠浸泡在液體環(huán)境中會不斷吸水溶脹，直至達到溶脹平衡，這是水凝膠的一個重要特征，反映了水凝膠的含水量和保水能力，也有利于所載藥物的緩慢釋放。從表1 水凝膠的溶脹度結果可知，未經修飾和載藥的殼聚糖水凝膠的平衡溶脹度較高，達到14.89%。采用Urea-PEG-COOH 修飾殼聚糖、載MnSAE 和/或驅蛔素，均會使水凝膠的溶脹度輕度降低至10%左右，這可能與其內部交聯(lián)結構有關。

表1 水凝膠的溶脹度 (±s, n = 3)Table 1 Swelling ratio of hydrogels (±s , n = 3)

表1 水凝膠的溶脹度 (±s, n = 3)Table 1 Swelling ratio of hydrogels (±s , n = 3)

組別 溶脹度/%殼聚糖水凝膠 14.89±1.98 Asc@UPCs 水凝膠 10.68±0.99 MnSAE@UPCs 水凝膠 9.53±2.31 Asc/MnSAE@Cs 水凝膠 11.14±1.53 Asc/MnSAE@UPCs 水凝膠 10.22±2.21

2.8 水凝膠的體外黏附研究

通過質構儀評價水凝膠的體外黏附性能。取6.0 cm×2.0 cm 長條狀的新鮮豬皮，將水凝膠放置在兩塊豬皮之間，使其重疊區(qū)域面積為2.0 cm×1.0 cm，并在室溫條件下放置1 h 完全成膠。然后使用質構儀測量其拉力，拉力傳感器量程為50 N，速率為10 mm/min，每組水凝膠重復測量3 次，計算水凝膠的黏附強度。實驗結果見表2。

表2 水凝膠的黏附強度 (±s, n = 3)Table 2 Adhesion strengths of hydrogels (±s , n = 3)

表2 水凝膠的黏附強度 (±s, n = 3)Table 2 Adhesion strengths of hydrogels (±s , n = 3)

組別 黏附強度/kPa Cs 水凝膠 14.63±0.55 Asc@UPCs 水凝膠 12.07±0.47 MnSAE@UPCs 水凝膠 11.53±0.65 Asc/MnSAE@Cs 水凝膠 14.37±0.90 Asc/MnSAE@UPCs 水凝膠 11.07±0.15

黏附強度＝最大拉力/最初接觸面積

殼聚糖水凝膠和Asc/MnSAE@Cs 水凝膠的黏附強度相對較高，分別為14.63、14.37 kPa。而Asc@UPCs 水凝膠、MnSAE@UPCs 水凝膠和Asc/MnSAE@UPCs 水凝膠的黏附強度輕度下降，分別為12.07、11.53、11.07 kPa。整體來看，制備的水凝膠含有豐富的羥基、氨基、羧基等基團，可以通過氫鍵黏附在皮膚上，展現(xiàn)出優(yōu)異的黏附性，可延長其在胃黏膜處的滯留時間，提高納米酶和驅蛔素在感染部位的濃度。

2.9 類酶活性評價

2.9.1 POD活性 采用TMB催化底物驗證MnSAE的POD 活性[19]。在室溫條件下，向200 μL 的pH 5.5 的緩沖液中加入MnSAE（Mn 終質量濃度為0、3.75、7.50、15.00、22.50、30.00 μg/mL），再加入10μL 的400 μg/mL 的TMB 的溶液，最后加入32 μL 1%的H2O2溶液，使用多功能酶標儀記錄20 min 內不同體系在652 nm 波長處的吸光度（A）值。

2.9.2 OXD 活性 TMB 也可被OXD 氧化后產生藍色物質，在652 nm 處有最大吸收，用于評價MnSAE 的OXD 類酶活性。取不同質量濃度的MnSAE（Mn 終質量濃度為0、2.00、2.67、4.00、8.00、16.00 μg/mL）加入到pH 5.5 的緩沖液中，1 min 后加入10 μL 的400 μg/mL 的TMB 的溶液，室溫反應20 min，利用酶標儀測定652 nm 處的A值。

2.9.3 羥基自由基生成 使用TA 光致發(fā)光法檢測羥基自由基的生成[6]。0.1 mol/L 的H2O2、0.5 mmol/L對苯二甲酸和Asc/MnSAE@UPCs 水凝膠（MnSAE質量濃度為50 μg/mL）在室溫下于0.01 mol/L 的HAc-NaAc 緩沖液（pH 5.5）中培養(yǎng)30 min。采用熒光分光光度計來測量反應體系在410 nm 波長處的A值。

2.9.4 超氧陰離子生成 同時使用DPBF 作為捕獲劑檢測超氧陰離子的生成[20]。將Asc/MnSAE@UPCs 水凝膠（MnSAE 質量濃度為50 μg/mL）、0.1 mol/L 的H2O2和25 μg/mL 的DPBF 在0.01 mol/L的HAc-NaAc 緩沖液（pH 5.5）中室溫條件下孵育30 min。用紫外-可見分光光度計測量420 nm 波長處的A值。

2.9.5 酶催化活性結果 類酶催化活性是納米酶實現(xiàn)高效抗菌活性的前提。POD 酶可通過類Fenton 反應催化H2O2分解為羥基自由基，使TMB 轉化為藍色氧化物。由圖5-a 可知，TMB 氧化物的產生在一定范圍內隨著MnSAE 質量濃度和時間的增加而增加。OXD 也可直接將TMB 氧化為為藍色產物。同樣的，MnSAE 的OXD 產物在一定范圍內與其質量濃度也呈正相關性（圖5-b）。上述實驗證實了MnSAE的POD 和OXD 活性。進一步地，分別使用對苯二甲酸和DPBF 作為捕獲劑檢測Asc/MnSAE@UPCs水凝膠產生羥基自由基和超氧陰離子的能力。羥基自由基可以將非熒光的對苯二甲酸氧化為具有熒光的2-羥基對苯二甲酸，圖5-c 可看出隨著時間的增加，熒光強度逐漸增大，表明羥基自由基的生成。此外，超氧陰離子可漂白DPBF 在420 nm 波長處的熒光。與殼聚糖水凝膠相比，Asc/MnSAE @UPCs水凝膠的熒光劇烈下降（圖5-d）。上述結果證實了羥基自由基和超氧陰離子的生成。

圖5 Asc/MnSAE@UPCs 水凝膠的類酶催化活性Fig.5 Multienzyme-like catalytic activities of Asc/MnSAE@UPCs hydrogels

2.10 水凝膠的體外安全性評價研究

利用細胞增殖檢測試劑盒（CCK-8）檢測Asc/MnSAE@UPCs 水凝膠對人正常胃黏膜上皮細胞GES-1 細胞的影響。取對數(shù)生長期的GES-1 細胞，以5×104/孔的細胞密度接種于96 孔板，與不同質量濃度的Asc/MnSAE@UPCs 水凝膠共孵育24 h。除去96 孔板中舊的培養(yǎng)基，用PBS 洗1 遍，加入120 μL 培養(yǎng)基稀釋的CCK-8 試劑，37 ℃避光孵育2 h，使用酶標儀在450 nm 波長處檢測A值。每組設置6 個復孔，并將PBS 處理的細胞組作為空白對照組，計算細胞活力平均值。結果如表3 所示。與對照組相比，當殼聚糖水凝膠和UPCs 水凝膠的質量濃度達到200 μg/mL 時，對GES-1 細胞的活性影響沒有統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。經進一步計算，殼聚糖水凝膠和UPCs 水凝膠的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值均大于4.7×106μg/mL，證實制備的水凝膠在使用范圍內沒有明顯的毒性。殼聚糖、β-甘油磷酸鈉、PEG 等都是安全低毒的生物材料，因此制備的水凝膠表現(xiàn)出良好的生物相容性。

表3 水凝膠對GES-1 細胞增殖的影響 (±s, n = 6)Table 3 Effect of hydrogel on proliferation of GES-1 cells(±s , n = 6)

表3 水凝膠對GES-1 細胞增殖的影響 (±s, n = 6)Table 3 Effect of hydrogel on proliferation of GES-1 cells(±s , n = 6)

水凝膠質量濃度/(μg?mL?1)細胞存活率/%殼聚糖水凝膠 UPCs 水凝膠0 100.00±5.48 100.00±3.79 5 97.57±3.72 96.32±4.38 10 94.21±1.21 92.36±2.20 50 92.88±2.12 89.74±3.60 100 90.92±6.05 86.91±1.48 200 85.54±7.55 83.95±1.80

2.11 水凝膠的抗幽門螺桿菌活性研究

利用平板計數(shù)法檢測水凝膠的體外抗菌活性[21]。取對數(shù)生長期的幽門螺桿菌調節(jié)600 nm 波長處A值為0.1（1×106cfu/mL）。取稀釋好的600 μL 幽門螺桿菌混懸液，分別加入600 μL 樣品（殼聚糖水凝膠、Asc@UPCs 水凝膠、MnSAE@UPCs 水凝膠、Asc/MnSAE@Cs 水凝膠、Asc/MnSAE@UPCs 水凝膠），在37 ℃恒溫搖床中60 r/min 搖動，每組樣品3 次重復。分別孵育12、24、36 h 后，將各樣品均稀釋10 000 倍，接種到幽門螺桿菌選擇性固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成菌落并計數(shù)。水凝膠的抗菌活性如表4所示。制備的載藥水凝膠的抗幽門螺桿菌活性具有時間相關性。此外，與對照組相比，殼聚糖水凝膠幾乎沒有抗菌活性。然而，Asc@UPCs 水凝膠和MnSAE@UPCs 水凝膠組的幽門螺桿菌菌落數(shù)明顯降低（P＜0.05）。尤其需要指出的是，共載MnSAE和驅蛔素的Asc/MnSAE@UPCs 水凝膠顯示出最優(yōu)異的抗菌活性，顯示出化學動力治療和化學治療的協(xié)同抗菌作用。并且，該組抗菌活性顯著高于未經Urea-PEG-COOH 修飾的Asc/MnSAE@Cs 水凝膠組（P＜0.05），進一步證實了脲基修飾的殼聚糖水凝膠的靶向遞送和抗菌效果。

表4 水凝膠的體外抗幽門螺桿菌活性 (±s, n = 3)Table 4 In vitro anti-H.pylori activities of hydrogels(±s , n = 3)

表4 水凝膠的體外抗幽門螺桿菌活性 (±s, n = 3)Table 4 In vitro anti-H.pylori activities of hydrogels(±s , n = 3)

組別 幽門螺桿菌菌落數(shù)/cfu 12 h 24 h 36 h對照 1 032±75 1 094±86 1 107±69殼聚糖水凝膠 1 023±58 1 039±79 1 052±75 Asc@UPCs 水凝膠 797±81## 643±55## 573±85##MnSAE@UPCs 水凝膠 622±54## 537±42## 429±52##Asc/MnSAE@Cs 水凝膠 461±63## 298±63## 256±49##Asc/MnSAE@UPCs 水凝膠 293±36##** 92±46##** 77±67##*

與對照組比較：##P＜0.05；與Asc/MnSAE@Cs 水凝膠組比較：*P＜0.05 **P＜0.01。##P < 0.05 vs control group; *P < 0.05 **P < 0.01 vs Asc/MnSAE@Cs hydrogels group.

2.12 水凝膠的體外活性氧檢測

取600 μL 的600 nm 波長處A值為0.1 的幽門螺桿菌混懸液，與600 μL 樣品（殼聚糖水凝膠、Asc@UPCs 水凝膠、MnSAE@UPCs 水凝膠、Asc/MnSAE@Cs 水凝膠、Asc/MnSAE@UPCs 水凝膠）在37 ℃恒溫搖床中孵育24 h。離心后棄去上層培養(yǎng)液，用PBS 沖洗3 遍后加入1 mL 的2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA），37 ℃避光孵育30 min。之后用PBS 洗3 遍，重新分散到100 μL 的PBS 中，滴加到載玻片上，甘油封片，用CLSM 觀察活性氧的生成。利用CLSM觀察水凝膠生成活性氧的能力。DCFH-DA 探針進入幽門螺桿菌后，可被酯酶水解生成DCFH，活性氧能夠氧化非熒光的DCFH 產生具有綠色熒光的DCF。DCF 的熒光強度與細菌內活性氧水平成比。如圖6 所示，加入MnSAE 的水凝膠組均產生活性氧，尤其是Asc/MnSAE@UPCs 水凝膠的活性氧含量最高，與前述抗菌活性結果保持一致。

圖6 水凝膠治療后幽門螺桿菌生成活性氧的結果Fig.6 Reactive oxygen species generation results of H.pylori after treatment with hydrogels

3 討論

具有黏附性和高生物相容性的殼聚糖水凝膠在制備抗幽門螺桿菌遞藥系統(tǒng)方面具有廣闊的應用前景。本課題將納米生物醫(yī)學和中藥材土荊芥的現(xiàn)代化研究相結合，制備共載MnSAE 和驅蛔素的殼聚糖水凝膠。通過表征證實了水凝膠的形態(tài)和元素組成，并對其體外釋藥、溶脹度和黏附性和體外安全性、抗菌活性進行評價，以期為幽門螺桿菌感染的根除治療提供一種新的思路。

尿素是幽門螺桿菌胃內定植和生存的關鍵外源物質。幽門螺桿菌細胞膜表面的尿素通道蛋白Ure I 能夠特異性地將宿主氨基酸代謝產生的尿素分解為氨和二氧化碳，中和胃酸，使細菌周圍的pH 值升高，從而保護細菌免受胃酸的破壞[22]?；凇癠rea-Ure I”理論設計抗幽門螺桿菌遞藥系統(tǒng)已經得到證實，展示出良好的Ure I 靶向性和抗菌活性[16-18,23]。眾所周知，殼聚糖骨架上具有高反應活性的C2-氨基和C6-羥基，易于進行各種修飾到殼聚糖，且C2-氨基活性高于C6-羥基。從增加成膠性能和維持遞藥系統(tǒng)表面電荷角度出發(fā)，本課題選擇將Urea-PEG-COOH 修飾到殼聚糖的C6-羥基。經過1H-NMR和FTIR 證實，所得UPCs 結構與目標化合物一致。此外，體外抗菌活性和細菌內活性氧檢測實驗也證實了經 Urea-PEG-COOH 修飾的 Asc/MnSAE@UPCs 水凝膠具有更好的幽門螺桿菌靶向抗菌效果。

在MnSAE 的制備過程中，選擇金屬有機骨架ZIF-8 作為前驅體，采用鞣酸刻蝕其內核，使其成為中空的立方體結構，有利于Mn2+最大程度的均勻分布在ZIF-8 框架的外層。然后采用高溫熱解的方式破壞其晶體結構，使其成為無定型的C-N 結構，Mn2+變?yōu)樽匀粌r態(tài)，錨定在C-N 結構上，成為MnSAE。通過類酶活性表征，結果證實包載MnSAE的水凝膠具有POD 和OXD 活性，能夠產生羥基自由基和超氧陰離子，和土荊芥的中藥單體成分驅蛔素協(xié)同發(fā)揮優(yōu)異的化學動力、化學治療的協(xié)同抗菌作用。下一步，擬開展相關動物實驗評價其體內抗菌活性，并通過體內活體成像、蛋白組學、16S rRNA等技術研究水凝膠的胃黏附特性、抗菌機制和對腸道菌群的影響，證實其在抗幽門螺桿菌治療方面的科學價值和臨床意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突