多籽五層龍中1 個新的木栓烷型三萜

牛 琦，許浩楠，王浩鑫，陳 林，謝紅茜，丁祖霄，左愛學(xué)，江志勇*

1.云南中醫(yī)藥大學(xué) 云南省傣醫(yī)藥彝醫(yī)藥重點實驗室 云南省高校民族藥現(xiàn)代研究重點實驗室 云南 昆明 650500

2.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 云南 昆明 650500

五層龍屬SalaciaL.植物為翅子藤科（Hippocrateaceae）多年生灌木或小喬木。該屬植物目前報道約有200 余種，主要分布于泰國、越南、斯里南卡、印度等東南亞熱帶地區(qū)。我國約有10余種，廣泛分布于廣東、廣西、海南、云南等地[1]。由于該屬植物多具有顯著的降糖活性[1-3]，本研究組開展了系列關(guān)于該屬植物的化學(xué)成分及降糖活性研究[4-8]，并發(fā)現(xiàn)柳葉五層龍中的部分化合物如salaciacochinoside A[4]具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制作用。多籽五層龍S.polyspermaHu 主要分布于云南西雙版納，目前沒有關(guān)于該植物的化學(xué)成分及生物活性研究報道。本研究組前期開展了多籽五層龍枝葉90%乙醇提取物氯仿萃取部分的化學(xué)成分研究[9]，為了明確該藥用植物的化學(xué)成分及生物活性，進(jìn)一步對其石油醚萃取部分的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，從中分離得到了7 個化合物（圖1）。經(jīng)波譜學(xué)分析，結(jié)合文獻(xiàn)比較，將該7 個化合物分別鑒定為3α,27,28- 三羥基木栓烷（ 3α,27,28-trihydroxy friedelane，1）、kokoonol（2）、28-hydroxyfriedelan-3-one-29-oic acid（3）、maytenfolone（4）、黑蔓醇酯乙（regelindiol B，5）、α-香樹脂素（α-amyrin，6）、赤桐甾醇（clerosterol，7）。其中化合物1 為1 個新的木栓烷型三萜，命名為多籽五層龍醇。所有化合物均為首次從該植物中分離得到。

圖1 化合物1～7 的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compounds 1—7

1 儀器與材料

Agilent 6030 Q-TOF 型質(zhì)譜儀（美國Agilent 公司）；Bruker AM-600/400 型核磁共振儀（瑞士Bruker公司）；柱色譜硅膠（100～200、200～300 目）、薄層色譜硅膠GF254（青島美高化工有限公司）；MCI（日本三菱化工），Sephadex LH-20（Pharmacia 公司）。Aglilent 1260 半制備液相色譜儀（美國安捷倫科技公司），DAD 檢測器。Shimadza shim-pack GIS色譜柱（日本島津公司）；C18柱色譜硅膠（德國默克公司）；高效液相色譜儀使用色譜純甲醇（德國默克公司）和娃哈哈純凈水，其余試劑為工業(yè)純二次重蒸試劑。α?葡萄糖苷酶（上海寶曼生物科技有限公司）；阿卡波糖（acarbose，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%，Sigma公司）。

多籽五層龍枝葉于2019 年9 月采集于西雙版納，經(jīng)中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園周仕順高級工程師鑒定為S.polyspermaHu 的枝葉，標(biāo)本（YMU-2019027）保存于云南中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院。

2 提取和分離

室溫風(fēng)干的多籽五層龍枝葉13.2 kg，粉碎后用8 倍量的90%乙醇提取3 次（每次室溫浸泡24 h）。合并3 次乙醇提取液后減壓濃縮，得到1.7 kg 浸膏。將浸膏混懸于適量的水中，依次用石油醚、氯仿和正丁醇萃取，得到石油醚部分浸膏232 g、氯仿部分浸膏180 g，正丁醇部分浸膏120 g。石油醚部分用100～200 目硅膠600 g 拌樣進(jìn)行柱色譜，石油醚-丙酮系統(tǒng)（100∶0、98∶2、95∶5、90∶10、80∶20、70∶30、60∶40）梯度洗脫，經(jīng)TLC 檢測合并相同組分，得到6 個組分（Fr.1～6）。

取Fr.4 部分的樣品（10 g），以MCI 柱色譜脫色，甲醇-水（60∶40→100∶0）梯度洗脫，得到4個流分（Fr.4.1～4.4）。Fr.4.1（1.7 g）經(jīng)硅膠柱色譜（石油醚-醋酸乙酯98∶2→70∶30）進(jìn)行梯度洗脫分離得到3 個流分（Fr.4.1.1～4.1.3），其中Fr.4.1.1 經(jīng)硅膠柱色譜（石油醚-丙酮90∶10）分離得到化合物7 （135 mg），F(xiàn)r.4.1.2 經(jīng)Sephadex LH-20（甲醇- 氯仿1∶1），再進(jìn)一步經(jīng)硅膠柱色譜（石油醚-丙酮80∶20）得化合物4（37 mg）。Fr.4.2（0.9 g）經(jīng)硅膠柱色譜（石油醚-醋酸乙酯90∶10→80∶20）得到2 個流分（Fr.4.2.1～4.2.2），其中Fr.4.2.2經(jīng)反相C18柱色譜（甲醇-水85∶15）分離純化得化合物2（28 mg）和6（19 mg）。Fr.4.3（2.1 g）經(jīng)硅膠柱色譜（石油醚-醋酸乙酯90∶10→60∶40）梯度分離得到4 個流分（Fr.4.3.1～4.3.4）。Fr.4.3.2經(jīng)半制備HPLC 分離純化（甲醇-水83∶17）得到化合物3（tR＝20.5 min，21 mg）和5（tR＝24.1 min，16 mg）。Fr.4.3.3 經(jīng)硅膠柱色譜（氯仿-甲醇95∶5）反復(fù)分離純化得化合物1（9.8 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色無定型粉末。其HR-ESI-MS 在m/z505.390 9 [M＋COOH]?（計算值505.389 8，C31H53O5）處給出-COOH 的加合離子峰，提示其分子式為C30H52O3，不飽和度為5。化合物1 的紅外（IR）光譜在3 428 cm?1處給出強的吸收峰，提示分子中存在羥基官能團(tuán)。其13C-NMR (150 MHz,CDCl3) 譜（表1）中給出30 個碳原子信號，包括6 個季碳，5 次甲基，13 個亞甲基和6 個甲基。其中δC72.8 (CH) 為1 個與氧相連的次甲基，δC66.9(CH2)，63.4 (CH2) 為2 個與氧相連的亞甲基。化合物1 的1H-NMR (600 MHz, CDCl3) 譜（表1）在δH4.04 (1H, d,J= 11.9 Hz), 3.95 (1H, d,J= 11.9 Hz)和δH3.73 (1H, d,J= 11.0 Hz), 3.52 (1H, d,J= 11.0 Hz) 處給出2 組特征的與氧相連的偕偶亞甲基質(zhì)子信號，與碳譜中觀察到的2 個連氧亞甲基信號δC66.9 (CH2), 63.4 (CH2)相吻合。同時還在δH1.02 (3H,s), 0.98 (3H, s), 0.98 (3H, s), 0.89 (3H, s), 0.81 (3H, s)處給出5 個單峰甲基質(zhì)子信號，δH0.88 (3H, d,J=6.2 Hz) 處給出1 個雙峰甲基質(zhì)子信號。以上波譜數(shù)據(jù)和五層龍屬植物分離得到的木栓烷型三萜較為相似，提示化合物1 為1 個木栓烷型三萜。將化合物1 的波譜數(shù)據(jù)與fridelane-3α,28,29-triol[10]相比較，發(fā)現(xiàn)兩者的A 環(huán)和B 環(huán)的數(shù)據(jù)極為相近，提示化合物1 的C-3 位含有α 連接的羥基。為了進(jìn)一步明確化合物1 的另外2 個連氧亞甲基連接位置，測試了化合物1 的2D NMR 相關(guān)圖譜。如圖2 所示，其HMBC 譜中清楚地觀察到C-18 (δC40.8) 和δH4.04(1H, d,J= 11.9 Hz, H-27a), 3.95 (1H, d,J= 11.9 Hz,H-27b) 及δH3.73 (1H, d,J= 11.0 Hz), 3.52 (1H, d,J= 11.0 Hz) 相關(guān)，提示另2 個連氧亞甲基分別位于C-27 和C-28 位。同時其HMBC 的遠(yuǎn)程相關(guān)譜中還觀察到δH4.04, 3.95 分別與C-12 (δC25.1), C-13 (δC46.3), C-14 (δC38.9) 相關(guān)，δH3.73, 3.52 分別與C-16(δC29.5), C-17 (δC37.0), C-22 (δC33.1) 相關(guān)，進(jìn)一步證實了C-27 和C-28 位連有羥基?；衔? 的C-3位連有羥基還通過HMBC 譜中的δH3.26 (1H, dt,J= 4.8, 10.8 Hz, H-3) 與C-23 (δC10.6)，C-5 (δC39.3) 相關(guān)，以及1H-1H COSY（圖2）中的H-3/H-2(δH2.02, 1.20-1.24) 和H-3/H-4 (δH1.02-1.05) 相關(guān)得到證實。其他HMBC 和1H-1H COSY（圖2）相關(guān)進(jìn)一步確定化合物1 為3,27,28-三羥基木栓烷三萜。

表1 化合物1 的1H- 和13C-NMR (600/150 MHz, CDCl3) 數(shù)據(jù)Table 1 1H- and 13C-NMR (600/150 MHz, CDCl3) data of compound 1

圖2 化合物1 的關(guān)鍵HMBC 和COSY 相關(guān)Fig.2 Key HMBC and COSY correlations of compound 1

為了更準(zhǔn)確的確定化合物1 中C-3 位羥基的構(gòu)型，測定了其NOESY 相關(guān)譜。如圖3 所示，其NOESY 譜中給出H-3/CH3-23 以及H-3/CH3-24 相關(guān)，表明H-3 處于β 位（即豎立的a 鍵）。H-3 處于a 鍵也從其氫譜中存在較大的偶合常數(shù)δH3.26 (1H,dt,J= 4.8, 10.8 Hz) 得到證實。綜合以上分析，最終將化合物1 的結(jié)構(gòu)鑒定為3α,27,28-三羥基木栓烷，命名為多籽五層龍醇（polysperol），為1 個新的三萜。

圖3 化合物1 的關(guān)鍵NOESY 相關(guān)Fig.3 Key NOESY correlations of compound 1

化合物 2：白色無定型粉末。ESI-MSm/z:465.371 7 [M＋Na]+（計算值465.370 9，C30H50O2Na+）。1H-NMR (400 MHz, C5D5N)δ: 4.34 (1H, d,J= 11.2 Hz, H-27a), 4.24 (1H, d,J= 11.0 Hz, H-27b), 0.95(3H, d,J= 6.4 Hz, H-23), 1.41, 1.39, 1.17, 0.98, 0.86,0.81 (各3H, s, H-28, 26, 30, 29, 25, 24)；13C-NMR(100 MHz, C5D5N)δ: 22.8 (C-1), 41.9 (C-2), 212.2(C-3), 58.3 (C-4), 42.4 (C-5), 41.6 (C-6), 19.0 (C-7),54.0 (C-8), 37.8 (C-9), 59.8 (C-10), 38.1 (C-11), 24.9(C-12), 45.9 (C-13), 38.6 (C-14), 32.8 (C-15), 37.0(C-16), 30.7 (C-17), 43.9 (C-18), 37.2 (C-19), 28.7(C-20), 33.2 (C-21), 40.6 (C-22), 7.6 (C-23), 15.0(C-24), 18.5 (C-25), 22.7 (C-26), 62.9 (C-27), 33.1(C-28), 36.3 (C-29), 31.2 (C-30)。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[11]，鑒定該化合物為kokoonol。

化合物 3：白色無定型粉末。ESI-MSm/z:495.345 1 [M ＋Na]+（ 計算值 495.345 0，C30H48O4Na+）。1H-NMR (400 MHz, C5D5N)δ: 3.93(1H, d,J= 10.4 Hz, H-28a), 3.89 (1H, m, H-28b),2.12 (1H, m, H-4), 1.43 (3H, s, H-30), 1.42 (3H, s,H-27), 1.04 (3H, s, H-26), 0.93 (1H, d,J= 6.7 Hz,H-23), 0.79 (3H, s, H-25), 0.65 (3H, s, H-24)；13C-NMR (100 MHz, C5D5N)δ: 22.7 (C-1), 41.8(C-2), 212.2 (C-3), 58.2 (C-4), 42.5 (C-5), 41.5 (C-6),18.8 (C-7), 51.4 (C-8), 38.1 (C-9), 59.6 (C-10), 35.7(C-11), 30.1 (C-12), 39.8 (C-13), 39.7 (C-14), 29.5(C-15), 31.8 (C-16), 35.8 (C-17), 40.6 (C-18), 30.6(C-19), 41.1 (C-20), 31.4 (C-21), 32.5 (C-22), 7.6(C-23), 15.0 (C-24), 18.9 (C-25), 16.1 (C-26), 19.0(C-27), 69.8 (C-28), 181.8 (C-29), 33.3 (C-30)。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[12]，鑒定該化合物3 為28-hydroxyfriedelan-3-one-29-oic acid。

化合物 4：白色無定型粉末。ESI-MSm/z:477.334 7 [M ＋Na]+（ 計算值 477.334 5，C30H46O3Na+）。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 3.89(1H, d,J= 10.9 Hz, H-28a), 3.95 (1H, d,J= 11.0 Hz,H-28b), 2.21 (1H, q,J= 6.3 Hz, H-4), 0.82 (3H, d,J=6.2 Hz, H-23), 1.17 (3H, s, H-27), 1.01 (3H, s, H-29),0.88 (3H, s, H-26), 0.81 (3H, s, H-25), 0.69 (3H, s,H-24)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δ: 22.4 (C-1),41.3 (C-2), 213.0 (C-3), 58.2 (C-4), 42.1 (C-5), 41.2(C-6), 18.2 (C-7), 50.7 (C-8), 37.8 (C-9), 59.4 (C-10),34.8 (C-11), 28.5 (C-12), 39.1 (C-13), 38.4 (C-14),29.1 (C-15), 29.6 (C-16), 34.7 (C-17), 39.4 (C-18),33.1 (C-19), 33.4 (C-20), 30.2 (C-21), 41.5 (C-22), 7.0(C-23), 14.8 (C-24), 18.2 (C-25), 16.8 (C-26), 15.3(C-27), 84.0 (C-28), 180.1 (C-29), 27.8 (C-30)。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[13]，鑒定化合物4 為maytenfolone。

化合物5：無色針狀晶體（氯仿）。ESI-MSm/z:509.360 7 [M ＋Na]+（ 計算值 509.360 7，C31H50O4Na+）。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 5.22(1H, brs, H-12), 3.65 (3H, s, OCH3), 3.55 (1H, dd,J=4.6, 12.1 Hz, H-22), 3.20 (1H, dd,J= 4.2, 10.7 Hz,H-3), 1.23 (3H, s, H-30), 1.13 (3H, s, H-27), 0.97 (6H,s, H-25, 26), 0.94 (3H, s, H-28), 0.91 (3H, s, H-23),0.76 (3H, s, H-24)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ:38.7 (C-1), 27.4 (C-2), 79.1 (C-3), 39.0 (C-4), 55.3(C-5), 18.5 (C-6), 32.6 (C-7), 40.1 (C-8), 47.7 (C-9),37.0 (C-10), 23.7 (C-11), 123.7 (C-12), 143.1 (C-13),42.9 (C-14), 25.6 (C-15), 19.3 (C-16), 38.5 (C-17),46.5 (C-18), 42.5 (C-19), 39.0 (C-20), 37.0 (C-21),75.6 (C-22), 28.3 (C-23), 15.7 (C-24), 15.8 (C-25),16.9 (C-26), 26.4 (C-27), 24.6 (C-28), 178.5 (C-29),20.8 (C-30), 52.1 (29-OCH3)。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[14]，故鑒定化合物5 為黑蔓醇酯乙。

化合物 6：白色無定型粉末。ESI-MSm/z:449.376 2 [M ＋Na]+（ 計算值 449.375 9，C30H50ONa+）。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 5.10(1H, brs, H-12), 3.20 (1H, m, H-3), 1.56 (3H, s, H-24),1.55 (3H, s, H-28), 1.05 (3H, s, H-23), 0.99 (3H, s,H-27), 0.98 (3H, s, H-26), 0.93 (3H.s, H-25), 0.89(3H, d,J= 6.5 Hz, H-29), 0.87 (3H, d,J= 6.4 Hz,H-30)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δ: 38.9 (C-1),27.5 (C-2), 79.3 (C-3), 38.8 (C-4), 55.4 (C-5), 18.6(C-6), 33.1 (C-7), 40.2 (C-8), 47.9 (C-9), 37.1 (C-10),23.6 (C-11), 124.6 (C-12), 139.8 (C-13), 42.3 (C-14),28.3 (C-15), 26.8 (C-16), 34.0 (C-17), 59.2 (C-18),39.8 (C-19), 40.2 (C-20), 31.5 (C-21), 41.7 (C-22),28.3 (C-23), 15.8 (C-24), 15.9 (C-25), 17.1 (C-26),23.5 (C-27), 28.9 (C-28), 17.7 (C-29), 21.6 (C-30)。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[15-16]，鑒定該化合物6為α-香樹脂素。

化合物 7：白色無定型粉末。ESI-MSm/z:435.380 5 [M＋Na]+（計算值435.380 2，C29H48ONa+）。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 5.33 (1H, m, H-6),4.70 (1H, s, H-26a), 4.61 (1H, s, H-26b), 3.49 (1H, m,H-3), 1.53 (3H, s, H-27), 0.98 (3H, s, H-19), 0.64 (3H,s, H-18), 0.87 (3H, d,J= 6.5 Hz, H-21), 0.77 (3H, t,J= 7.4 Hz, H-29)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ:37.5 (C-1), 31.8 (C-2), 72.0 (C-3), 42.8 (C-4), 141.0(C-5), 121.9 (C-6), 32.1 (C-7), 32.0 (C-8), 50.3 (C-9),36.7 (C-10), 21.3 (C-11), 40.0 (C-12), 42.5 (C-13),57.0 (C-14), 24.5 (C-15), 28.4 (C-16), 56.2 (C-17),12.0 (C-18), 19.6 (C-19), 35.7 (C-20), 18.8 (C-21),33.9 (C-22), 29.6 (C-23), 49.7 (C-24), 147.8 (C-25),111.6 (C-26), 18.0 (C-27), 26.7 (C-28), 12.3 (C-29)。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[17]，鑒定化合物7為赤桐甾醇。

4 α?葡萄糖苷酶抑制活性

采用本研究組前期報道[4]的分光光度法，以阿卡波糖（IC500.75 μmol/L）為陽性對照，對本實驗中分離得到的所有化合物等進(jìn)行了α-葡萄糖苷酶抑制活性的篩選。結(jié)果顯示，化合物3 對α-葡萄糖苷酶有較好的抑制作用，IC50達(dá)到（15.1±1.7）μmol/L，化合物1、2 和4 也有一定活性，其抑制α-葡萄糖苷酶的IC50分別為（57.8±3.5）、（39.4±2.9）、（27.6±3.0）μmol/L。其余化合物在100 μmol/L 的較高濃度下未顯示出對α-葡萄糖苷酶的抑制作用。

5 討論

本研究從多籽五層龍枝葉90%乙醇提取物的石油醚萃取部分分離得到的化合物多為三萜，其中木栓烷型三萜多具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制作用，表明木栓烷型三萜可能為該屬植物降糖的主要活性成分之一。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突