電針不同特定穴對慢性結(jié)腸炎大鼠的效應(yīng)差異性研究

唐坤鵬,呂嘉琪,文 壇,張春青,馬夢娜,高 婷,閆麗萍

(山西中醫(yī)藥大學(xué),山西 晉中 030619)

炎癥性腸病(IBD)是腸道慢性非特異性炎癥性疾病,過去數(shù)十年來西歐及北美等發(fā)達(dá)國家的發(fā)病率高于中國等發(fā)展中國家,但近年來在我國的發(fā)病率升高,且青少年多見[1]。目前研究認(rèn)為腸道炎癥、免疫反應(yīng)失調(diào)和上皮屏障受損等因素與IBD的發(fā)病密切相關(guān)[2-3],但具體病因不明,無特異性治療方法,西醫(yī)主要采用5-氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑或生物制劑等治療[4],短期療效確切,但長期應(yīng)用有明顯不良反應(yīng),且復(fù)發(fā)率較高[5]。諸多臨床研究證實(shí),針灸具有減少疾病活動(dòng)、減輕腸炎反應(yīng)、改善腸道免疫屏障功能、修復(fù)腸黏膜損傷等作用,并且在降低復(fù)發(fā)率、減少不良反應(yīng)、維持長期療效等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢[6-7]。臨床腧穴的選取多以與大腸腑聯(lián)系密切的特定穴為主,但由于不同腧穴間存在相對效應(yīng)特異性,因此針對同一疾病不同特定穴位間的療效也存在差異[8-9]。基于此,本研究制備大鼠慢性結(jié)腸炎模型,觀察電針4個(gè)不同特定穴的療效差異,以為研究經(jīng)穴效應(yīng)特異性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1動(dòng)物 60只SPF級SD大鼠,雌雄各半,體重(200±20)g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0006。大鼠分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)于山西中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心SPF級動(dòng)物房,溫度22～26 ℃,相對濕度50%～60%,自由攝食飲水,1周后用于實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2018DW181),嚴(yán)格遵循《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.2主要試劑與儀器 完全弗氏佐劑(CFA,F5881,Sigma),PMSF蛋白酶抑制劑、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液5×(武漢Bosterbio,批號分別為AR1179和AR1112),基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)抗體(索萊寶生物科技有限公司,貨號:K109533P),基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)抗體(武漢Bosterbio,貨號:BM4075),羊抗兔IgG-HRP(武漢Bosterbio,貨號:BA1056),β-actin鼠抗(北京博奧生物技術(shù)有限公司),BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海Beyotime,批號:P0012S),彩色PAGE快速凝膠試劑盒(上海absin公司,貨號:abs9367)。高速冷凍離心機(jī)(曦瑪離心機(jī)有限公司),Tanon5200成像儀(美國Bio Tek公司),DYY-6C型電泳儀(北京六一)。

1.3分組、造模及干預(yù) 將60只大鼠隨機(jī)分為6組,每組10只。模型組和天樞組、大腸俞組、足三里組、上巨虛組大鼠均采用免疫復(fù)合致敏法[10]制備慢性結(jié)腸炎模型:采用抗原上清液(家兔結(jié)腸黏膜中加入適量生理鹽水勻漿制成)與CFA同等比例混合制備抗原乳化液,然后分別在大鼠足跖(第3天)、足趾(第10天)、背部皮下(第17天)、腹股溝(第24天)、腹腔內(nèi)(第31天)注射抗原乳化液8 mg,至大鼠血清抗兔結(jié)腸抗體達(dá)到一定效價(jià)時(shí),大鼠禁食不禁水24 h后采用2%戊巴比妥鈉(3 mL/kg)行腹腔麻醉,給予2%福爾馬林液灌腸并留置60 min,用生理鹽水沖洗后,采用不加CFA的抗原液再次灌腸并留置2 h,隨后用生理鹽水沖洗,完成造模。參考李盼盼等[11]實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證造模是否成功。正常組用生理鹽水替代造模試劑并按上述方法平行操作。于造模成功后,參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[12]及大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜[13]對穴位定位,天樞組、大腸俞組、足三里組、上巨虛組分別采用華佗牌SDZ-Ⅱ型電子針療儀電針雙側(cè)天樞(ST25)、大腸俞(BL25)、足三里(ST36)、上巨虛(ST37)腧穴,均使用規(guī)格為0.18 mm×25 mm毫針(北京中研太和)直刺5 mm,同側(cè)穴位連接同對電極,頻率為2 Hz/50 Hz,強(qiáng)度2 mA,以大鼠肌肉或針柄微顫為宜,20 min/次,1次/d,連續(xù)干預(yù)10 d。正常組、模型組只在相同時(shí)間以相同方式進(jìn)行固定。

1.4檢測指標(biāo)及方法

1.4.1大鼠一般狀態(tài)及疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI) 觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、體重、毛發(fā)光澤度、飲食、糞便性狀、腹瀉程度及血便狀況,按照以下標(biāo)準(zhǔn)評分:大便性狀正常,無便血,體重?zé)o下降為0分;體重下降1%～5%,大便松散、半成型,便血陽性為1分;體重下降6%～10%,大便松散、不成型,便血強(qiáng)陽性為2分;體重下降11%～15%,稀水樣便,肉眼血便為3分;體重下降≥16%,稀水樣便更清長,肉眼血便更顯著為4分。

1.4.2大鼠結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(CMDI)評分 參考文獻(xiàn)[14],依據(jù)肉眼及鏡下結(jié)腸黏膜情況進(jìn)行評分。0分:結(jié)腸組織無損傷;1分:結(jié)腸黏膜輕度充血水腫,無潰瘍;2分:結(jié)腸黏膜充血,腸壁增厚,但無潰瘍;3分:腸壁增厚,結(jié)腸黏膜出現(xiàn)潰瘍;4分:結(jié)腸黏膜出現(xiàn)2個(gè)或多個(gè)潰瘍;5分:結(jié)腸黏膜出現(xiàn)2個(gè)或多個(gè)潰瘍,潰瘍直徑>1 cm;6～10分:結(jié)腸黏膜出現(xiàn)多個(gè)潰瘍,如果潰瘍直徑超過2 cm,則在此基礎(chǔ)上每增加1 cm,評分增加1分。

1.4.3大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài) 干預(yù)結(jié)束后,采用2%戊巴比妥鈉(3 mL/kg)腹腔麻醉大鼠后取結(jié)腸組織,沖洗干凈后加入4%甲醛組織固定液固定,制備石蠟切片,常規(guī)HE染色,漂洗、脫水后經(jīng)中性樹脂封片,40倍光鏡下觀察。

1.4.4大鼠血清IL-10和TNF-α水平 取大鼠腹主動(dòng)脈血,離心后嚴(yán)格按照白細(xì)胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(武漢BOSTER,批號分別為EK0417和EK0527)說明書的步驟,采用美國BioTek酶標(biāo)儀(型號:ELX808)進(jìn)行檢測。

1.4.5大鼠結(jié)腸組織中MMP-1、MMP-2蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測:取液氮速凍的結(jié)腸組織,提取蛋白,BCA法測其蛋白濃度。通過配膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂牛奶封閉,分別加入MMP-1、MMP-2及β-actin一抗(稀釋度1∶1 000,1∶500,1∶1 000)于4 ℃孵育過夜。次日在二抗溶液(1∶5 000)中室溫孵育2 h,洗膜后在條帶上滴入ECL發(fā)光液(北京索萊寶科技有限公司,MA0186-1)顯色曝光,運(yùn)用Image J軟件計(jì)算相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠DAI評分和CMDI評分比較 造模后,各造模組大鼠DAI評分均明顯高于正常組(P均<0.05),各造模組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。干預(yù)10 d后,模型組大鼠DAI評分、CMDI評分均明顯高于正常組(P均<0.05);各腧穴組大鼠DAI評分、CMDI評分均明顯低于模型組(P均<0.05),且上巨虛組大鼠DAI評分、CMDI評分均明顯低于天樞組、大腸俞組及足三里組(P均<0.05),其余組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 正常組和慢性結(jié)腸炎各組大鼠DAI評分和CMDI評分比較分)

2.2各組大鼠結(jié)腸組織HE染色病理形態(tài) 正常組大鼠結(jié)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整,無炎癥、壞死;模型組大鼠結(jié)腸黏膜明顯水腫、糜爛,黏膜下層、肌層有大量炎性細(xì)胞浸潤,黏膜各層界限不清,腸腺壞死、萎縮;各腧穴組肌層完整,杯狀細(xì)胞數(shù)量較模型組多,炎性細(xì)胞浸潤減少,其中上巨虛組較其余腧穴組改善明顯。見圖1。

圖1 正常組和慢性結(jié)腸炎各組大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)(HE染色,×100)

2.3各組大鼠血清IL-10和TNF-α水平比較與正常組比較,模型組大鼠血清IL-10水平明顯降低(P<0.05),血清TNF-α水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,各腧穴組大鼠血清IL-10水平均明顯升高(P均<0.05),血清TNF-α水平均明顯降低(P均<0.05);且上巨虛組大鼠血清IL-

10水平明顯高于天樞組、大腸俞組及足三里組(P均<0.05),血清TNF-α水平明顯低于天樞組、大腸俞組及足三里組(P均<0.05);其余組間血清IL-10、TNF-α水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 正常組和慢性結(jié)腸炎各組大鼠血清IL-10和TNF-α水平比較

2.4各組大鼠結(jié)腸組織中MMP-1、MMP-2蛋白表達(dá)情況比較 模型組大鼠結(jié)腸組織中MMP-1、MMP-2蛋白相對表達(dá)量均明顯高于正常組(P均<0.05);各腧穴組大鼠結(jié)腸組織中MMP-1、MMP-2蛋白相對表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05),且上巨虛組MMP-1、MMP-2蛋白相對表達(dá)量均明顯低于天樞組、大腸俞組及足三里組(P均<0.05),其余組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖2及表3。

圖2 正常組和慢性結(jié)腸炎各組大鼠結(jié)腸組織中MMP-1、MMP-2蛋白表達(dá)情況

表3 正常組和慢性結(jié)腸炎各組大鼠結(jié)腸組織中MMP-1、MMP-2蛋白相對表達(dá)量比較

3 討 論

中醫(yī)學(xué)中無IBD的病名,多將其歸于“泄瀉”“久痢”“腸澼”“便血”等病范疇[15],其病變部位在大腸,但脾胃運(yùn)化功能受阻是其發(fā)生的主要因素。

《景岳全書》中記載“泄瀉之本,無不由于脾胃”,因而治療腸腑病的特定穴又多分布于足陽明胃經(jīng)。本次實(shí)驗(yàn)選取腧穴中,天樞為大腸之募穴,位居腹部,具有通調(diào)腸腑、理氣活血、止瀉消導(dǎo)之效;上巨虛為大腸之下合穴,位于下肢,《靈樞經(jīng)》言“合治內(nèi)腑,治內(nèi)腑奈何?取之于合,大腸屬上廉。此以邪在大腸,故當(dāng)刺巨虛上廉”;足三里雖為胃之下合穴,但其主治病癥廣泛,且IBD與脾胃關(guān)系密切,因此也是治療大腸腑病的常用特定穴之一;大腸俞乃大腸背腧穴,屬于足太陽膀胱經(jīng),位于背部,是大腸之經(jīng)氣輸注之處,同時(shí)也是大腸病證反應(yīng)點(diǎn),主治病變位于大腸的相關(guān)疾患。本實(shí)驗(yàn)采用免疫復(fù)合致敏法構(gòu)建慢性結(jié)腸炎模型,造模后大鼠一般狀況較差,DAI評分、CMDI評分均顯著升高,結(jié)腸黏膜損傷嚴(yán)重,提示模型制備成功;各腧穴組給予電針干預(yù)后,大鼠一般情況均得到改善,DAI評分、CMDI評分顯著降低,結(jié)腸黏膜組織均有不同程度的修復(fù),其中上巨虛組改善最為顯著,說明電針不同特定穴均可減輕慢性結(jié)腸炎結(jié)腸黏膜損傷,且電針上巨虛的效果更明顯。

慢性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,其中促炎因子與抗炎因子失衡所致的免疫異常是關(guān)鍵機(jī)制之一,同時(shí)也是評價(jià)腸道炎癥輕重程度的敏感標(biāo)記物[16]。其中抗炎因子IL-10及促炎因子TNF-α在慢性結(jié)腸炎組織中扮演著重要角色。IL-10可抑制抗原遞呈及促炎細(xì)胞因子的釋放,起到阻止結(jié)腸炎癥發(fā)展的作用[17]。TNF-α由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和分化的T細(xì)胞所產(chǎn)生,可增加IL-1β和IL-6等促炎細(xì)胞的分泌、表達(dá),導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞凋亡,是參與介導(dǎo)腸道炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵[18-19]。相關(guān)研究表明,電針可通過下調(diào)結(jié)腸炎模型小鼠血清TNF-α含量和上調(diào)IL-10含量以維持細(xì)胞因子平衡,緩解腸道炎癥[20-22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,電針干預(yù)后各腧穴組大鼠血清IL-10水平顯著升高,血清TNF-α水平顯著降低,其中上巨虛組各指標(biāo)改善較其他組明顯,表明電針上巨虛、天樞、大腸俞及足三里均可有效抑制腸道慢性炎癥,且電針上巨虛抑制炎癥作用更為顯著。

基質(zhì)金屬蛋白酶是一種可以靶向裂解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的蛋白分解酶,由前肽、鋅金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)和C末端血紅素結(jié)構(gòu)域所組成[23]。MMP-1、MMP-2作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員分別屬于間質(zhì)膠原酶與Ⅳ型膠原酶。已有研究證實(shí),MMP-1、MMP-2對腸道上皮屏障功能有直接影響,并參與受損上皮組織的修復(fù),對細(xì)胞間緊密性造成破壞,從而加重結(jié)腸黏膜的損傷,是炎癥性腸病潰瘍發(fā)展的關(guān)鍵因素[24-26]。因此,MMP-1、MMP-2在結(jié)腸組織中的表達(dá)可作為衡量結(jié)腸炎嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[27]。本研究中各腧穴組大鼠結(jié)腸組織中MMP-1、MMP-2蛋白表達(dá)量均低于模型組,且上巨虛組較天樞組、足三里組、大腸俞組降低更為顯著。結(jié)合結(jié)腸組織病理改變,進(jìn)一步表明電針上巨虛對于腸道慢性炎癥損傷的修復(fù)具有相對特異性。

綜上所述,電針天樞、大腸俞、足三里、上巨虛可能是通過調(diào)節(jié)促炎因子與抗炎因子平衡,抑制結(jié)腸組織中MMP-1、MMP-2蛋白的表達(dá),從而改善慢性結(jié)腸炎腸道炎癥損傷,其中電針上巨虛的作用更明顯,提示上巨虛對慢性結(jié)腸炎的治療可能存在相對特異性,但對于產(chǎn)生這種效應(yīng)差異性的確切作用機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。