可降解PLA/PBAT塑料的微生物菌群結(jié)構(gòu)研究

裴雯玉 江雨韓 李娜 陳怡 吳弘

摘要? 為探究PLA/PBAT 復(fù)合材料在菌群處理下的降解情況，加快該塑料的生物降解速率。通過富集培養(yǎng)法篩選獲得不同批次的可降解菌群，基于失重法評估不同批次菌群對于PLA/PBAT 復(fù)合材料的降解能力，并利用高通量測序分析批次間微生物的結(jié)構(gòu)特點。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過多輪富集后，在相同的處理周期內(nèi)，PLA/PBAT塑料的失重率由2.52%提高到4.93%。轉(zhuǎn)接多批次后在門分類水平上菌群豐度最高的 5 個菌門分別為擬桿菌門、浮霉菌門、變形菌門、裝甲菌門和綠彎菌門，占比超過95.00%；在屬水平上，豐度較高的分別為擬桿菌門OPB56屬和浮霉菌門SH-PL14屬。微生物群落結(jié)構(gòu)隨著不斷的轉(zhuǎn)接而趨于穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞? PLA/PBAT塑料；失重率；高通量測序；菌群結(jié)構(gòu)

中圖分類號? X172? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? A? 文章編號? 0517-6611（2024）04-0057-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.04.012

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on the Microbial Community Structure of Degradable PLA/PBAT Composites

PEI Wen.yu， JIANG Yu.han， LI Na et al

（College of? Life Sciences，Tianjin Normal University，Tianjin 300387）

Abstract? In order to explore the degradation of PLA/PBAT composites under the treatment of bacteria， we analyzed the characteristics of microbiome and accelerated the biodegradation rate.? In this study， different batches of bacteria were screened and their degradation ability were evaluated based on weightlessness method. The characteristics of microorganisms among different batches were analyzed by high.throughput sequencing. The results showed that the weight loss of PLA/PBAT plastics increased from 2.52% to 4.93%.The five highest abundance at phyla level were Bacteroidetes， Planctomycetes， Proteobacteria， Armatimonadetes and Chloroflexi， accounting for more than 95.00%. OPB56 and SH.PL14 were the highest abundance at genus level. The microbial community structure tended to be stable.

Key words? PLA/PBAT plastics;Weightlessness rate;High.throughput sequencing;Flora structure

基金項目? 天津市科學(xué)計劃項目（18ZLZXZF00220）；天津市級“大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃”（202210065167）；天津師范大學(xué)引進(jìn)人才基金項目（5RL147）。

作者簡介? 裴雯玉（2000—），女，山西長治人，碩士研究生，研究方向：微生物篩選。*通信作者，講師，博士，從事微生物功能研究。

收稿日期? 2023-02-24；修回日期? 2023-03-30

近年來，可生物降解塑料在全球的需求激增，其不僅具備傳統(tǒng)塑料的優(yōu)越性能，還具有良好的生物相容性和可降解性［1-2］，對于生態(tài)環(huán)境保護(hù)、經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展具有重要的研究價值［3-4］。聚乳酸（PLA）和聚對苯二甲酸-己二酸-丁二酯（PBAT）混合后形成的PLA/PBAT共聚物是目前可生物降解塑料中研究較多的材料之一［5-6］。然而越來越多關(guān)于生物降解型塑料膜的研究發(fā)現(xiàn)，如果在環(huán)境中降解不完全，形成的微塑料會造成比普通塑料還要大的環(huán)境隱患［7-8］。因此，深入研究生物降解型塑料的降解機(jī)制，發(fā)掘更高效的生物降解系統(tǒng)顯得尤為迫切。

目前，科研工作者一直通過努力篩選高效塑料降解菌來實現(xiàn)完全的微生物降解。據(jù)報告，Jia等［9］從農(nóng)田土壤中篩選分離了一種能夠降解PBAT的Stenotrophomonas sp.YCJ1，在pH 7.5時該菌的降解率最高，脂肪酶活性達(dá)到5.17 U/mL。Kasuya等［10］在自然條件下篩選了一株能夠單獨降解PBAT的真菌NKCM1712；Satti等［11］在30 ℃條件下篩選鑒定出3種菌株能高效降解PLA，包括Chryseobacterium sp.、Sphingobacterium sp.以及Pseudomonas aeruginosa。Urbanek等［12］從極端環(huán)境北極極地土壤樣品中分離篩選得到Rhodococcus sp.，可以降解包括PLA在內(nèi)的生物可降解塑料。但是單株菌的作用始終有限，尚未取得理想的效果，因此，開發(fā)和利用混合微生物體系來消除培養(yǎng)后期次級代謝產(chǎn)物對單一菌株的限制，提高塑料的降解效率成為了研究的新方向和新熱點［13-14］?；炀w系降解塑料的研究也有報道，Jia等［15］開發(fā)了假單胞菌與秀麗放線菌的共培養(yǎng)體系，協(xié)同作用下實現(xiàn)了對PLA/PBAT復(fù)合材料薄膜的高效降解。Auta等［16］發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌和紅球菌混合后對于聚乙烯的降解效果要比單獨菌株強(qiáng)。因此，進(jìn)一步挖掘可以高效降解PLA/PBAT復(fù)合材料的菌株，研究其組成特點和協(xié)同作用的關(guān)系，對于提高環(huán)境中塑料的降解效率具有重要意義［17-19］。

該研究從塑料污染嚴(yán)重地區(qū)采集土壤樣品，利用選擇性培養(yǎng)基篩選并富集PLA/PBAT塑料膜高效降解菌群，對塑料膜降解過程中各代菌群結(jié)構(gòu)的動態(tài)演替規(guī)律進(jìn)行了分析和對比研究，探索可降解PLA/PBAT塑料的核心微生物物種。以期為降解菌群的富集條件優(yōu)化和降解微生物特性研究奠定基礎(chǔ)，提高PLA/PBAT復(fù)合材料的生物降解效率。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料和土壤樣品

PLA/PBAT復(fù)合塑料膜采購自東莞市三燕塑膠原料有限公司。該研究所使用的土壤樣品采集自湖南省衡陽市垃圾場附近。選擇垃圾沉積時間較長的區(qū)域，基于五點取樣法，將收集的土壤樣品貯存于滅菌的透明封口袋內(nèi)并編號，迅速帶回實驗室進(jìn)行后續(xù)處理。

1.2? 培養(yǎng)基

1.2.1

Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基。蛋白胨10.00 g/L，酵母提取物5.00 g/L，氯化鈉19.00 g/L，氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.4。121 ℃滅菌 20 min。

1.2.2

無機(jī)鹽培養(yǎng)基。K2HPO4 0.700 g/L、KH2PO4 0.700 g/L、MgSO4·7H2O 0.700 g/L、NH4NO3 1.000 g/L、NaCl 0.005 g/L、FeSO4·7H2O 0.002 g/L、ZnSO4·7H2O 0.002 g/L、MnSO4·H2O 0.001 g/L，調(diào)節(jié)pH至7.0，121 ℃滅菌 20 min。

1.3? 降解菌群的篩選和轉(zhuǎn)接富集

首先將PLA/PBAT復(fù)合塑料膜制備成大小規(guī)格為 10 mm×10 mm 的薄片，在 2% SDS 中浸泡過夜，隨后在75%酒精中浸泡4 h，用無菌水沖洗干凈備用。稱取10 g土樣于90 mL無菌水中，制得土壤稀釋液。放置3片PLA/PBAT薄膜到180 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，制備成以PLA/PBAT復(fù)合塑料膜為唯一碳源的培養(yǎng)環(huán)境，然后按照10%的接種量取20 mL土壤稀釋液到培養(yǎng)基中，在37 ℃搖床中連續(xù)培養(yǎng)22 d（該試驗以22 d為一個降解周期），觀測PLA/PBAT塑料膜在液體培養(yǎng)基中的崩解情況。選擇未添加土壤稀釋液的PLA/PBAT塑料膜-無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基作為空白對照組。

第一個降解周期培養(yǎng)結(jié)束后，繼續(xù)富集轉(zhuǎn)接時，將 10%（20 mL）的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接入新的PLA/PBAT復(fù)合塑料膜-無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)22 d，共轉(zhuǎn)接3次，得到3個批次培養(yǎng)液（初始菌液記為G0，第1次轉(zhuǎn)接后的菌液記為G1，第2次和第3次轉(zhuǎn)接后的菌液分別記為G2和G3）。

1.4? PLA/PBAT塑料膜失重率

一個降解周期培養(yǎng)結(jié)束之后，在超凈臺中將三角搖瓶打開，將PLA/PBAT復(fù)合塑料膜用75％的酒精和無菌水沖洗2遍。晾干之后測定降解后的PLA/PBAT塑料膜質(zhì)量，并計算失重率。

失重率（%）=PLA/PBAT塑料膜純損失質(zhì)量/培養(yǎng)前塑料膜質(zhì)量×100

通過搖瓶培養(yǎng)前后塑料膜重量的變化來計算失重率，失重率越高，則說明塑料膜的降解效果越好。

1.5? DNA提取和高通量測序

取每個批次（G0、G1、G2和G3共計4個批次）的菌體進(jìn)行收集，用細(xì)菌全基因組提取試劑盒（TIANGEN，中國）完成菌群 DNA的抽提，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，隨后將樣本送至上海美吉生物有限公司開展高通量測序。

選取細(xì)菌 16S rRNA 的 V4～V5 區(qū)進(jìn)行高通量測序分析。首先利用通用引物 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′和5′-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3′進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增回收后在 Illumina HiSeq 2500測序平臺上完成高通量測序分析。然后對測得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，包括拼接、質(zhì)控、抽平等，獲得的序列以 97%相似性生成 OTU（operational taxonomic units），再使用Silva 128 數(shù)據(jù)庫比對，得到物種信息注釋的基本情況。

1.6? 生物信息學(xué)統(tǒng)計分析

采用 UPARSE 軟件進(jìn)行 OTU 聚類后，將微生物在門、綱、目、科、屬、種分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析，利用 R 語言（Version 3.4.1）進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計算細(xì)菌群落的 α-多樣性指數(shù)，包括Observed OUT 和 Shannon指數(shù)等，并基于加權(quán)和非加權(quán)分析不同批次細(xì)菌群落的 β-多樣性指數(shù)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? PLA/PBAT塑料膜高效降解菌群的富集和篩選

該研究共采集35份土壤樣本，將土壤稀釋液接種于PLA/PBAT復(fù)合塑料膜-無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)。37 ℃培養(yǎng)22 d后，發(fā)現(xiàn)其中1個搖瓶出現(xiàn)PLA/PBAT塑料膜破碎的現(xiàn)象，說明該土壤樣本中具備能夠降解PLA/PBAT塑料膜的微生物菌群，將其作為初始的研究菌群，記為G0。隨后將G0接種至新的PLA/PBAT復(fù)合塑料膜-無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接后獲得第一批次（記為G1），第2批次（記為G2）和第3批次（記為G3）的菌液。

在培養(yǎng)過程中定期觀察降解膜的狀態(tài)，結(jié)果顯示，在未進(jìn)行任何處理的情況下，PLA/PBAT塑料膜表面較為平整，有韌性。而第1次轉(zhuǎn)接菌液培養(yǎng)22 d，PLA/PBAT塑料韌性逐漸消失，易于破碎；經(jīng)過第2批次菌液處理后可觀察到塑料4周發(fā)生破損，表面有裂紋；直到在第3批次G3菌群的處理下，可以明顯發(fā)現(xiàn)PLA/PBAT塑料發(fā)生完全崩解破碎（圖1）。由此可見，菌群降解能力隨著富集代數(shù)的增加而增強(qiáng)。

檢測塑料膜的失重率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，G0菌群在22 d后塑料膜的失重率為 2.52%，而到了第3批次G3，轉(zhuǎn)接處理同樣的天數(shù)，塑料失重率高達(dá) 4.93%（圖1），說明G3批次的微生物降解PLA/PBAT塑料的效果越好。

2.2? 轉(zhuǎn)接富集中高效降解菌群的結(jié)構(gòu)變化

將G0、G1、G2、G3的菌液提取DNA后進(jìn)行建庫測序分析，結(jié)合16S rRNA高通量測序的結(jié)果，分析G0、G1、G2、G3的微生物群落結(jié)構(gòu)。利用韋恩分析發(fā)現(xiàn)，各組共有的OTU個數(shù)為75，而特有的OTU在不同批次的微生物中差異較大，G0、G1、G2、G3各自特有的數(shù)目為167、83、21、17（圖2）。 隨著轉(zhuǎn)接次數(shù)的增加，菌群中特有的OTU數(shù)目呈現(xiàn)出減少的趨勢。

分析各個批次菌群的結(jié)構(gòu)組成，結(jié)果顯示：門水平上，G0

中的優(yōu)勢菌依次是變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門

（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria），相對豐度分別為50.15%、9.50%、 6.57%、6.38%、5.75%和

5.37%，所占比例高達(dá)83.00%以上。隨著連續(xù)轉(zhuǎn)接富集到G3，其優(yōu)勢菌門為擬桿菌門（Bacteroidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、變形菌門（Proteobacteria）、裝甲菌門（Armatimonadetes）和綠彎菌門（Chloroflexi），相對豐度分別為 39.57%、20.10%、15.55%、10.40%和 9.73%，這5個優(yōu)勢菌門所占比例達(dá)到95.00%以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他門水平（圖3）。

因此，在逐代轉(zhuǎn)接的過程中，變形菌門、疣微菌門（Verrucomicrobia）、酸桿菌門（Acidobacteria）的占比隨著轉(zhuǎn)接次數(shù)的增加而減少；而擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）、裝甲菌門（Armatimonadetes）則隨著轉(zhuǎn)接次數(shù)的增加而增加，說明這4個門的菌株能夠適應(yīng)逐代的降解過程，并且發(fā)揮出良好的降解性能，尤其是浮霉菌門（Planctomycetes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。

根據(jù)門分類水平上群落組成結(jié)構(gòu)結(jié)果分析可知，擬桿菌門為PLA/PBAT塑料降解的優(yōu)勢菌門，這與他人對塑料降解菌群的研究一致，擬桿菌門的細(xì)菌是多糖的主要降解者［20-21］。孫超岷等［20］研究發(fā)現(xiàn)，深海冷泉擬桿菌可通過降解藻類多糖促進(jìn)深海營養(yǎng)和碳循環(huán)，并通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)聯(lián)合分析了該菌株的降解和利用機(jī)制。在擬桿菌門的研究中，其編碼碳水化合物酶的基因數(shù)量明顯高于變形菌門和綠彎菌門中的細(xì)菌［21］。

從屬水平對不同轉(zhuǎn)接代次的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，比較菌群結(jié)構(gòu)組成可以發(fā)現(xiàn)，不同轉(zhuǎn)接批次的微生物群落相對豐度不同，存在一定的差異。從G0到G3，其微生物在屬水平上差異較大，擬桿菌門OPB56屬、綠彎菌門厭氧繩菌屬、浮霉菌門SH-PL14所占比例隨著轉(zhuǎn)接富集的次數(shù)增加而明顯升高，分別由6.57%升至39.57%、由3.43%升至9.73%和由6.38%升至20.10%（圖4）。該結(jié)果說明這3個菌屬在富集轉(zhuǎn)接的過程中適應(yīng)了以PLA/PBAT塑料膜為唯一碳源的培養(yǎng)條件，并逐漸成為降解PLA/PBAT塑料膜的優(yōu)勢菌群，后續(xù)將會繼續(xù)深入研究這3個菌屬的基因組特點。擬桿菌門OPB56屬在轉(zhuǎn)接富集過程相對豐度逐漸升高，比較G0和G3可以發(fā)現(xiàn)其占比具有顯著性差異。這和之前研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌門可能是降解PLA/PBAT塑料的潛在細(xì)菌類型是一致的。至于其具體的降解機(jī)制，還需要結(jié)合宏基因組學(xué)、代謝組學(xué)等多手段進(jìn)行深入的研究，發(fā)掘可能的降解基因或者降解機(jī)制。

2.3? PLA/PBAT塑料地膜高效降解菌群轉(zhuǎn)接富集結(jié)果

為了更進(jìn)一步發(fā)掘微生物降解PLA/PBAT塑料膜的機(jī)制，使用 Mothur 軟件計算不同批次PLA/PBAT塑料膜降解菌群的特點，開展阿爾法和貝塔多樣性分析，各樣品細(xì)菌群落的 α-多樣性指數(shù)見表1。在Shannon指數(shù)和Chao指數(shù)的比較中，可以發(fā)現(xiàn)G0和G3存在顯著差異。經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接后，菌群的豐富度和多樣性都降低了，整個菌群結(jié)構(gòu)趨于單一化，這是微生物適應(yīng)PLA/PBAT復(fù)合材料為唯一碳源的調(diào)整。

同時，對不同批次的微生物菌液進(jìn)行基于 Bray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析（PCoA），結(jié)果見圖 5。從圖5可以看出，基于 unweighted Unifrac 距離的 PCoA 分析中，第一主坐標(biāo)軸的解釋度為54.06%，第二主坐標(biāo)軸的解釋度為 25.21%；而基于 weighted Unifrac 距離的 PCoA 分析中，第一主坐標(biāo)軸的解釋度為 67.21%，第二主坐標(biāo)軸的解釋度為 20.09%。無論采用加權(quán)還是非加權(quán)的算法，4個批次的樣品分為明顯的4個區(qū)域，這表明不同批次間的微生物群落構(gòu)成具有較大差異。

2.4 ?不同代次之間的微生物關(guān)系分析

每個門的代表屬基本符合各門的數(shù)量變化規(guī)律，只有個別代表屬的數(shù)量變化規(guī)律不符合所屬門的變化規(guī)律。數(shù)量變化較為明顯的10個屬中，MND1、Aquicella、Subgroup_6_unclassified、Pedosphaeraceae_unclassified 4個屬的數(shù)量隨著轉(zhuǎn)接次數(shù)的增加而減少，說明該4個屬不適應(yīng)膜降解的環(huán)境；而Fimbriimonadaceae_unclassified、OPB56_unclassified、Anaerolineaceae_unclassified、OLB13、SH-PL14、Armatimonadetes_unclassified 6個屬的數(shù)量隨著轉(zhuǎn)接次數(shù)的增加而增加，說明該6個屬適應(yīng)了降解PLA/PBAT塑料膜的環(huán)境（圖6）。占比較大的擬桿菌門（Bacteroidetes）和浮霉菌門（Planctomycetes）所對應(yīng)的OPB56_unclassified和SH-PL14也是占比較大的屬。同時，其他菌屬的占比隨著轉(zhuǎn)接代數(shù)的增加而減少，說明了菌群結(jié)構(gòu)的集中化。

3? 結(jié)論和討論

PLA/PBAT復(fù)合塑料是一種環(huán)境友好型材料，但是目前的研究表明其在短期或中期很難實現(xiàn)土壤中的完全降解。為了提升其生物處理的速度，開發(fā)高效的降解體系以及探究降解的機(jī)制顯得尤為重要［22-23］。

該研究通過篩選土壤中具備降解能力的微生物菌群，并通過多代富集來分析塑料降解微生物的組成特點以及降解機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①通過多輪富集后，微生物降解PLA/PBAT復(fù)合塑料的效率提高了，22 d的降解周期內(nèi)，失重率由252%提高到4.93%；②通過高通量測序分析不同轉(zhuǎn)接代次微生物的結(jié)構(gòu)組成，隨著轉(zhuǎn)接次數(shù)的增加，優(yōu)勢菌株的占比增大，特有菌屬的數(shù)量在降低；③在門分類水平上，轉(zhuǎn)接富集多次后（G3）的菌群豐度較高的 5 個菌門分別為擬桿菌門、浮霉菌門、變形菌門、裝甲菌門和綠彎菌門，占比超過95.00%；在屬分類水平上，豐度較高的菌屬分別為擬桿菌門OPB56屬和浮霉菌門SH-PL14。

該研究利用高通量測序?qū)睦鴱S附近采集的土壤進(jìn)行了多輪富集培養(yǎng)，獲得了一個能夠高效降解PLA/PBAT復(fù)合塑料的菌群，并通過分析微生物的組成發(fā)現(xiàn)群落結(jié)構(gòu)隨著不斷的轉(zhuǎn)接而趨于穩(wěn)定，優(yōu)勢菌屬的特征明顯。在富集培養(yǎng)初期，由于群落需要一定的適應(yīng)性，因而菌群群落結(jié)構(gòu)變化較大，而隨著轉(zhuǎn)接的次數(shù)增加，能夠降解PLA/PBAT復(fù)合塑料的菌群逐漸成為優(yōu)勢菌屬，這些都是潛在的塑料降解菌，其降解機(jī)制還需要進(jìn)一步探究。

下一步要繼續(xù)研究不同種微生物的共培養(yǎng)體系，提高PLA/PBAT塑料的降解率。

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