淫羊藿總黃酮聯(lián)合黃芪多糖對骨質疏松性骨折模型大鼠骨折愈合的影響*

高遠航，柴 儀，劉爍煒，常伯倫，暴 凱，李 倩

（河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011）

骨質疏松癥（OP）為一種全身代謝性疾病，主要與骨形成和骨破壞相關［1］。絕經后骨質疏松癥（PMOP）是臨床絕經女性較常見的代謝性疾病，由體內激素變化導致。據(jù)不完全統(tǒng)計，全球800 萬50 歲以上女性患有OP，且診斷明確［2］。研究發(fā)現(xiàn)，植物雌激素是目前治療該類疾病的一類雌激素樣生物活性物質，臨床療效良好，副作用小。中藥淫羊藿中含有雌激素樣活性物質總黃酮，對促進骨吸收和抑制骨破壞具有良好作用［3］。中藥黃芪的主要成分黃芪多糖可促進細胞增殖分化而調控骨細胞代謝，可抑制破骨細胞活性而影響骨代謝［4-5］。前期研究發(fā)現(xiàn)，與單用淫羊藿總黃酮、黃芪多糖比較，兩藥聯(lián)用不僅能更好地改善骨質疏松模型大鼠的血鈣、血磷和骨鈣素水平，且對骨干質量、骨灰質量、骨鈣和骨磷的含量增加更明顯［6］。為此，本研究中探討了淫羊藿總黃酮聯(lián)合黃芪多糖對骨質疏松性骨折模型大鼠骨折愈合、骨痂形成及塑形情況的影響。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：XBT-1型醫(yī)用X射線膠片（美國Kodak公司）；JIDI - 5G 型離心機（廣州吉迪儀器有限公司）；μCT -100型Mirco-計算機體層成像（CT）儀，Evaluation6.5-3型CT成像處理系統(tǒng)，均購于SCANCO Medical AG。

試藥：淫羊藿總黃酮提取物（上海梵態(tài)生物科技有限公司，貨號為CAS489-32-7）；黃芪多糖（中國Desite公司，批號為DH0109）；Ⅰ型膠原N端前肽（PⅠNP）、堿性磷酸酶（AKP）、骨鈣素（BGP）檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，批號分別為27UTGCPLY6，2QFC5TC3NJ，R5B8RYU7I1）。

動物：60 只健康6月齡雌性SD 大鼠，體質量為200～220 g，動物生產許可證號為SCXK（冀）2018-1-004，動物使用許可證號為SCXK（冀）2018-1-004，購于河北醫(yī)科大學實驗動物中心。飼養(yǎng)條件為12 h/12 h 明暗交替，溫度為（23 ±1）℃，相對濕度為（50 ± 15）%，自主飲食。

1.2 方法

試驗藥物制備：將淫羊藿總黃酮提取物與黃芪多糖按1∶1（m/m）比例混合，攪拌，即得。

分組、造模與給藥：將60只雌性SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為全處理組（A組）、后處理組（B組）、對照組（C組），各20只。飼以常規(guī)飼料，自由飲水。A組、B組、C組大鼠分別灌胃淫羊藿總黃酮提取物與黃芪多糖混懸液690 mg/（kg·d）、生理鹽水、生理鹽水4 周后，復制骨質疏松性骨折模型大鼠。將雌性SD 大鼠用2%苯巴比妥鈉60 mg/kg 進行腹腔麻醉，麻醉成功后，常規(guī)消毒，摘除雙側卵巢，術后4 周，行經典開放截骨模型術，大鼠麻醉消毒后，右股骨外側切口，暴露股骨干，用鋼鋸于股骨結節(jié)處開髓，將1 mm克氏針順行插入遠端，復位骨折后，順行打入股骨近端，確定克氏針牢固后，對多余部分進行剪除修整，逐層縫合切口，遂復制骨質疏松性骨折模型大鼠［6］。造模3 d 后，肌肉注射頭孢硫脒4 000 U/d抗感染。3組均造模成功，飼以常規(guī)飼料，自由飲水。A組、B組大鼠灌胃淫羊藿總黃酮提取物與黃芪多糖混懸液690 mg/（kg·d），C組大鼠灌胃等量生理鹽水，6周后處死。

正側位X線攝片檢查：為進一步觀察術后各組骨痂形成及骨折愈合的情況，分別于造模后第10，17，24，30天用2%苯巴比妥鈉60 mg/ kg 腹腔麻醉大鼠，麻醉成功后，對大鼠患肢左脛骨行正側位X線攝片，且利用Lane-Sandhu 評分標準對各時間點的X 線攝片進行療效評分。

血生化指標檢測：造模6 周后，于大鼠腹主動脈采血，離心（轉速為1 800 r / min）10 min，取上清液，-80 ℃冰箱冷凍保存，按酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒說明書操作。設置標準樣品孔和樣品孔，將50 μL 待測樣品添加到樣品孔中，但不添加任何樣品到空白孔中。除空白孔外，將100 μL 辣根過氧化物酶（HRP）標記抗體添加到標準樣品孔和樣品孔的每個孔中，并用密封膜封閉反應孔。將反應孔在37 ℃水浴或恒溫箱中孵育60 min。棄液體，在吸水紙上干燥。用洗滌劑350 μL填充每個孔并靜置1 min；棄洗滌劑，在吸水紙上干燥，重復洗板5次。向每個孔中加入50 μL 底物A 和50 μL 底物B，在37 ℃的黑暗中孵育15 min，加終止液終止反應，利用酶標儀測量各孔的吸光度（OD），繪制標準曲線，計算PⅠNP，AKP，BGP的濃度。

塑形情況：造模6周后處死大鼠，每組隨機選取10只，利用Micro-CT儀掃描患肢，使大鼠股骨縱軸與Micro-CT 儀檢查床滑軌的移動軸保持平行，設置掃描分辨率為40 μm，每次掃描時間為14 min。將獲得的掃描結果進行標準化處理，再沿股骨縱軸以骨折線為中心圍繞骨痂進行上下掃描，共100 個掃描層面，建立三維興趣區(qū)（ROI）。在進行區(qū)分高礦化組織與低或未礦化組織時，采用標準皮質骨密度的45%作為固定閾值，參考文獻［7］及掃描結果，分別計算骨小梁數(shù)量（Tb.N）、礦化骨組織體積（BV）、骨痂總體積（TV）、骨體積分數(shù)（BV/TV）、骨礦密度（BMD），觀察骨折塑形情況。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學軟件分析。計量資料以±s表示，多組間比較使用單因素方差分析（One - Way ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 正側位X 線攝片

不同時間點模型大鼠正側位X 線攝片見圖1。與本組造模后第10 天比較，3 組大鼠造模后第17，24，30 天的正側位X線攝片Lane-Sandhu評分均顯著升高（P＜0.05）；與C 組比較，A 組大鼠造模后第10，30 天的正側位X 線攝片Lane - Sandhu 評分均顯著升高（P＜0.05）。詳見圖2和表1。

表1 不同時間點3組大鼠正側位X線攝片Lane-Sandhu評分比較（ ± s，分，n=20）Tab.1 Comparison of Lane - Sandhu scores of frontal and lateral X - ray films among the three groups at different time points（ ± s，point，n=20）

表1 不同時間點3組大鼠正側位X線攝片Lane-Sandhu評分比較（ ± s，分，n=20）Tab.1 Comparison of Lane - Sandhu scores of frontal and lateral X - ray films among the three groups at different time points（ ± s，point，n=20）

注：與C 組比較，△P ＜0.05；與B 組比較，#P ＜0.05。表2 和表3同。與本組造模后第10天比較，*P ＜0.05。Note：Compared with those in group C，ΔP ＜0.05；Compared with those in group B，#P ＜ 0.05（for Tab. 1 - 3）；Compared with those on the 10th day after modeling，*P ＜0.05.

時間造模后第10天造模后第17天造模后第24天造模后第30天F值P值A組0.890±0.658△1.580±0.607*2.260±0.733*3.160±0.834△*34.931 0.000 B組0.630±0.597 1.260±0.653*2.110±0.658*2.740±0.933*31.193 0.000 C組0.470±0.513 1.260±0.653*1.890±0.809*2.420±0.961*23.075 0.000 F值2.450 1.550 1.198 3.127 P值0.096 0.221 0.310 0.520

圖1 不同時間點A組模型大鼠正側位X線攝片A.The 10th day after molding B.The 17th day after molding C.The 24th day after molding D.The 30th day after moldingFig.1 Frontal and lateral X - ray films of model rats in group A at different time points

圖2 造模后第30天B組和C組大鼠正側位X線攝片F(xiàn)ig.2 Frontal and lateral X - ray films of SD rats on the 30th day after molding in groups B and C

2.2 血生化指標

與C 組比較，A 組大鼠AKP，BGP，PⅠNP 水平均顯著升高（P＜0.05），B 組大鼠AKP 和BGP 水平均顯著升高（P＜0.05）；與B組比較，A組大鼠PⅠNP和BGP水平均顯著升高（P＜0.05）。詳見表2。

表2 3組大鼠血生化指標比較（ ± s，n=20）Tab.2 Comparison of blood biochemical indexes among the three groups（ ± s，n=20）

表2 3組大鼠血生化指標比較（ ± s，n=20）Tab.2 Comparison of blood biochemical indexes among the three groups（ ± s，n=20）

血生化指標PⅠNP（μg/L）AKP（U/L）BGP（U/L）A組5.722±0.150△#131.265±14.569△1.545±0.124△#B組5.450±0.122 134.494±13.923△1.461±0.114△C組5.360±0.114 79.894±6.774 1.071±0.130 F值42.174 124.571 84.915 P值0.000 0.000 0.000

2.3 塑形情況

與C 組比較，A 組大鼠BV，BV/TV，BMD 均顯著升高（P＜0.05）；與B 組比較，A 組大鼠BV/TV 顯著升高（P＜0.05）。詳見表3。

表3 3組大鼠骨分化指標比較（ ± s，n=10）Tab.3 Comparison of bone differentiation indexes among the three groups（ ± s，n=10）

表3 3組大鼠骨分化指標比較（ ± s，n=10）Tab.3 Comparison of bone differentiation indexes among the three groups（ ± s，n=10）

骨分化指標Tb.N（mm-1）BV（mm3）TV（mm3）BV/TV（%）BMD（g/cm3）A組2.808±0.474 31.235±7.374△47.310±10.389 66.210±7.448△#0.652±0.088△B組2.539±0.380 24.059±9.653 41.359±9.879 57.033±9.634 0.600±0.997 C組2.582±0.440 21.089±3.643 42.585±9.635 50.408±5.737 0.541±0.086 F值1.106 5.075 0.993 10.426 3.690 P值0.345 0.013 0.384 0.000 0.038

3 討論

PMOP 是指女性絕經后體內激素水平失衡，造成體內骨吸收大于骨形成狀態(tài)，從而導致骨質疏松發(fā)生的一類代謝性疾?。?-9］，臨床表現(xiàn)主要為骨密度降低，形成低骨量或骨質疏松，以及骨組織內微結構改變［10］。OP最嚴重的結局就是發(fā)生骨折，骨質疏松性骨折的預防和治療是研究OP的最終目的［11］。目前，主要通過補充雌激素來糾正破壞的骨平衡［12］。植物雌激素因良好的療效和較低的副作用成為臨床替代傳統(tǒng)雌激素的治療方法。

中醫(yī)學認為，PMOP 歸屬“骨痹”“骨痿”等范疇，其發(fā)生、發(fā)展與“腎氣”密切聯(lián)系。《素問·痿論篇》中認為，“腎者水臟也，今水不勝火，則骨枯而髓虛，故足不任身”，闡述了腎氣虧虛導致OP 發(fā)生的疾病機理。除腎氣外，肝氣虛也是OP 發(fā)病的重要原因。《素問·上古天真論篇》中指出“肝氣衰，筋不能動”，其病因病機主要為肝腎虧虛、腎精不足。張冰彬等［13］通過對2年內入院患者的研究發(fā)現(xiàn)，腎虛患者占OP總數(shù)的4/5，提示腎虛為主要證型。肝與腎的關聯(lián)十分密切，肝腎同源，精血同源，肝之血無法到達腎，腎精則虧損，同時肝陰虛也會導致腎陰虛［14］。淫羊藿歸肝、腎二經，具有溫補腎陽、強筋骨作用。相關研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿與內分泌系統(tǒng)具有密切聯(lián)系，其相關物質可激發(fā)內分泌系統(tǒng)，從而增強機體的分泌功能，不僅有效促進骨形成，且能通過促進骨代謝來治療OP［15-16］。淫羊藿總黃酮是淫羊藿的主要有效成分，可通過調控Wnt/β -聯(lián)蛋白（Wnt/β- catenin）途徑，進一步作用于OPG/ 核因子- κB 受體活化因子（RANK）/核因子- κB 受體活化因子配體（RANKL）系統(tǒng)，促進成骨細胞分化，發(fā)揮骨保護作用［17］。黃芪多糖是黃芪的主要有效成分，不僅可促進成骨分化，且能對骨密度和骨量發(fā)揮保護作用［18-19］，可通過激活核因子E2相關轉錄因子2（Nrf2）信號通路，而促進絕經后骨質疏松模型大鼠的抗氧化酶合成分泌，減輕氧化應激反應，增強成骨細胞功能的活性，從而緩解骨質疏松［20］。

骨質疏松患者的骨代謝標記物會出現(xiàn)異常變化，骨代謝生化指標的變化對骨轉化、骨折風險等的評價具有重要參考意義［21］。其中，PⅠNP，AKP，BGP均為《骨代謝生化指標臨床應用專家共識（2020）》［22］中推薦監(jiān)測骨質疏松常見的骨代謝生化指標。本研究結果顯示，與C 組比較，A 組和B 組大鼠的AKP 和BGP 水平均顯著升高（P＜0.05）；與B組比較，A組大鼠的PⅠNP和BGP水平均顯著升高（P＜0.05）。表明淫羊藿總黃酮與黃芪多糖在預防骨質疏松骨折方面具有一定優(yōu)勢，特別在骨質疏松骨折發(fā)生后，淫羊藿總黃酮與黃芪多糖可能通過提高大鼠體內PⅠNP 和BGP 水平及抑制AKP 水平促進骨形成。與本組造模后第10 天比較，3 組大鼠造模后第17，24，30天的正側位X線攝片Lane-Sandhu評分均顯著升高（P＜0.05）；與C組比較，A組大鼠造模后第10，30 天的正側位X 線攝片Lane - Sandhu 評分均顯著升高（P＜0.05）。表明造模后第10，30 天的效果更明顯。對骨骼結構進行金標準評估，Micro - CT 儀可對骨小梁結構進行更精準的評估，起到定量、定性分析的作用［23］。本研究結果顯示，與C 組比較，A 組大鼠的BV，BV/TV，BMD 均顯著升高（P＜0.05）；與B組比較，A 組大鼠的BV/ TV 顯著升高（P＜0.05）。表明淫羊藿總黃酮聯(lián)合黃芪多糖能有效改善骨質疏松性骨折，A組改善效果最好，進一步驗證了淫羊藿總黃酮聯(lián)合黃芪多糖對骨質疏松性骨折的防治作用。A 組與C 組間無顯著差異可能與以下2個因素有關：1）淫羊藿總黃酮聯(lián)合黃芪多糖改善骨質疏松性骨折的治療周期長于6周；2）造模前，服用淫羊藿總黃酮和黃芪多糖能進一步改善骨質疏松，促進骨質疏松性骨折愈合。

綜上所述，淫羊藿總黃酮聯(lián)合黃芪多糖能提高骨質疏松性骨折模型大鼠的BV，BV/TV，BMD，可進一步促進其骨折愈合。本研究中未進一步驗證灌胃周期，缺乏病理組織學的觀察和驗證，有待后續(xù)進一步研究。