周夏成,劉遠(yuǎn)財(cái),孫夢瑩,楊佳穎,陳卓,張愛琴
1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,浙江杭州 310005;2.浙江省腫瘤醫(yī)院中醫(yī)科 中國科學(xué)院杭州醫(yī)學(xué)研究所,浙江杭州 310022
肺癌是目前世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。腸道微生態(tài)是影響人體健康的重要因素,研究表明腸道菌群可通過調(diào)節(jié)炎癥、免疫反應(yīng)等影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[2-5]。中醫(yī)證候是疾病發(fā)展過程中某個(gè)階段生理、病理變化的高度概括,具有動(dòng)態(tài)性和即時(shí)性的特征[6]。目前,“如何為中醫(yī)證候提供客觀的評(píng)判依據(jù)?如何用內(nèi)在的變化表征外在的表現(xiàn)?”等問題已成為中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。運(yùn)用生物學(xué)方法研究中醫(yī)證候,有助于從客觀上揭示證候的本質(zhì)[7]。因此,本研究運(yùn)用16SrDNA 和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)對不同中醫(yī)證型非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)進(jìn)行腸道微生態(tài)學(xué)和免疫功能的研究,從生物學(xué)角度分析NSCLC 中醫(yī)證候的診斷依據(jù),為今后中醫(yī)藥治療NSCLC 提供理論支持,為中醫(yī)藥抗腫瘤治療提供依據(jù)。
患者相關(guān)病理報(bào)告示:組織病理學(xué)和(或)細(xì)胞學(xué)證實(shí)為NSCLC[8]。患者本人證候主訴符合《中醫(yī)臨床診療術(shù)語·證候部分》中醫(yī)證診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]:①氣陰兩虛證:咳嗽痰少,氣短息弱,聲低懶言,面色觥白,自汗或盜汗,口干少飲,諸癥勞累后加劇,舌質(zhì)淡嫩或偏紅,脈細(xì)弱;②陰虛內(nèi)熱證:咳嗽少痰或無痰,或痰中帶血絲,口干、口渴,潮熱盜汗,夜寐不安,大便燥結(jié),舌紅少苔或無苔,脈細(xì)數(shù);③脾虛濕滯證:咳嗽痰多,痰白或黃白相兼,不欲食或納少腹脹便溏,面色萎黃,舌淡苔白膩有齒痕,脈滑;④氣滯血瘀證:咳嗽不暢,痛處固定,拒按,夜間加劇,面色黯淡,舌質(zhì)紫邊尖有瘀點(diǎn),脈澀或結(jié)代。
納入標(biāo)準(zhǔn):①符合1.1 中的診斷標(biāo)準(zhǔn);②無其他惡性腫瘤個(gè)人史;③符合中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn);④年齡18~70 歲;⑤患者本人同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):①患者近14d 內(nèi)使用過抗生素治療;②有精神疾病,無完全民事行為能力。脫落標(biāo)準(zhǔn):①患者依從性差;②患者要求終止試驗(yàn)。
本研究采用Logistic 分析,擬探查變量有6 項(xiàng),相關(guān)資料顯示Logistic 回歸樣本量要求每個(gè)自變量需有10~15 個(gè)樣本,經(jīng)計(jì)算得出需收集60~90 例患者樣本。
選取2019 年3 月—10 月于浙江省腫瘤醫(yī)院胸外科門診就診且診斷為NSCLC,并擬行肺癌根治術(shù)的患者作為患者組?;颊呷虢M前經(jīng)中醫(yī)科兩名副主任以上中醫(yī)師同時(shí)辨證為氣滯血瘀證、脾虛濕滯證、氣陰兩虛證或陰虛內(nèi)熱證。本研究共收集樣本70 例,其中排除或退出24 例,共納入46 例,其中氣滯血瘀證組13 例,脾虛濕滯證組12 例,氣陰兩虛證組7例,陰虛內(nèi)熱證組14 例。選取同期12 名健康志愿者為對照組。本研究經(jīng)浙江省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(倫理審批號(hào):IRB-2018-219)。
1.5.1 組織培訓(xùn) 研究開始前綜合培訓(xùn)相關(guān)研究員,明確納排標(biāo)準(zhǔn),并嚴(yán)格執(zhí)行,要求各研究員熟練掌握樣本采集操作及儲(chǔ)存方式。
1.5.2 入組評(píng)估 患者入組前需經(jīng)2 名副主任以上中醫(yī)師同時(shí)辯證確認(rèn)分型,若有分歧則再請一名主任中醫(yī)師重新評(píng)估,方可入組。
1.5.3 標(biāo)本采集 采集糞便標(biāo)本過程中盡量采取無菌操作,過程迅速,盡量減少標(biāo)本與空氣的接觸時(shí)間,并及時(shí)將標(biāo)本放至–80℃冰箱內(nèi)凍存?zhèn)溆谩?/p>
1.6.1 腸道微生態(tài)分析 DNA 提取:使用DNA 提取試劑盒對糞便總DNA 進(jìn)行提取,將樣本進(jìn)行16S V3-V4 區(qū)域擴(kuò)增。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)分析:以稀釋后的基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR。將1.5μl PCR 產(chǎn)物置于120V 電壓下持續(xù)電泳20min,再使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行紫外線成像拍照。質(zhì)檢測序:質(zhì)檢合格后進(jìn)行濃度定量,并進(jìn)行相應(yīng)的比例混合,最后運(yùn)行Miseq 測序程序。引物信息見表1。
表1 樣本擴(kuò)增引物信息
1.6.2 白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-12 和干擾素γ(interferon,IFN-γ)檢測 ①分組:準(zhǔn)備酶標(biāo)包被板,將其置于框架上,選擇一處加入50μl 標(biāo)準(zhǔn)品,標(biāo)記為標(biāo)準(zhǔn)品孔;另選一處加入10μl 待測樣本及40μl 樣本稀釋液,標(biāo)記為待測樣品孔;選取一處空白對照孔。分別向待測樣本孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔加入100μl 辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的檢測抗體。②溫育:將酶標(biāo)包被板置于37℃ CO2孵箱中溫育1h 后取出,倒掉多余液體,用無菌磷酸緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗板5 次,每個(gè)孔250μl。③顯色:每孔分別加入50μl 顯色劑A液及顯色劑B 液,混勻30s 后把板置于37℃濕潤的培養(yǎng)箱中避光顯色15min,再加入50μl 終止液終止反應(yīng)。④測量:測量各孔的吸光值并記錄分析數(shù)據(jù)。
采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較采用單因素方差分析或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分率)[n(%)]表示,比較采用X2檢驗(yàn),P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
符合納排標(biāo)準(zhǔn)的NSCLC 患者46 例,病理類型均為腺癌。氣滯血瘀證組13 例,其中男7 例,女6例;平均年齡(59.46±7.34)歲;Ⅰ期病例8 例(61.5%),Ⅱ期病例5 例(38.5%)。氣陰兩虛證組7 例,其中男3 例,女4 例;平均年齡(60.57±4.79)歲;Ⅰ期病例3 例(42.9%),Ⅱ期病例4(57.1%)。脾虛濕滯證組12 例,其中男6 例,女6 例;平均年齡(58.58±6.71)歲;Ⅰ期病例6 例(50.0%),Ⅱ期病例6 例(50.0%)。陰虛內(nèi)熱證組14 例,其中男8 例,女6 例;平均年齡(56.50±3.74)歲;Ⅰ期病例6 例(42.9%),Ⅱ期病例8 例(57.1%)。各組患者在疾病分期、年齡、性別等方面比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性,見表2。
表2 各組患者一般資料的比較
2.2.1 操作分類單元(operational taxonomic units,OUT)聚類及稀釋曲線 稀釋曲線可用來反映測序的數(shù)據(jù)量是否足以反映樣品內(nèi)部物種的多樣性。曲線上升趨勢隨讀數(shù)條數(shù)的增加而逐漸趨于平坦,反映本研究的數(shù)據(jù)量較為合理,見圖1。
圖1 樣品物種豐富度稀釋曲線圖和箱線圖
2.2.2 韋恩圖 本研究對58 個(gè)樣品進(jìn)行16S 測序分析,共產(chǎn)生 284 個(gè)分類操作單元(operational taxonomic unit,OTU)。其中,5 組樣本有117 個(gè)共有OTU,相比于健康對照組,氣滯血瘀證組有13 個(gè)特有的OUT,氣陰兩虛證組有3 個(gè)特有的OTU,脾虛濕滯證組有15 個(gè)特有的OTU,陰虛內(nèi)熱證組有7個(gè)特有的OTU,健康對照組有18 個(gè)特有的OUT,見圖2。
圖2 OTU 韋恩圖
2.2.3 腸型分析 不同中醫(yī)證型的肺癌患者腸道菌群結(jié)構(gòu)存在差異。其中,氣陰兩虛證組與陰虛內(nèi)熱證組的樣本點(diǎn)較集中,菌群組成分布較為相似;脾虛濕滯證組與氣滯血瘀證組的樣本點(diǎn)較分散,群菌組成分布差異相對較大,見圖3。
圖3 腸型分布圖
2.2.4 差異物種分析 不同中醫(yī)證型中屬水平差異性菌屬相對豐度排行前20 的種系中,氣陰兩虛證組有6 個(gè)差異性菌屬,其中羅斯菌屬(Roseburia)、芽殖菌屬(Gemmiger)、毛螺菌屬(Lachnospiracea)、另枝菌屬(Alistipes)較健康組顯著富集;放線菌屬(Actinomyces)、腸桿菌屬(Enterobacteriaceae)、克雷伯菌屬(Klebsiella)較健康組顯著降低。陰虛內(nèi)熱證組有4 個(gè)差異性菌屬,其中,羅斯菌屬、毛螺菌屬、瘤胃菌屬(Ruminococcaceae)較健康組顯著富集;埃希菌屬/志賀桿菌屬(Escherichia/Shigella)較健康組顯著降低。氣滯血瘀證組有5 個(gè)差異性菌屬,其中,毛螺菌屬、普氏菌屬(Prevotella)、梭菌屬(ClostridiumXⅠVa)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)較健康組顯著富集;放線菌屬(Actinomyces)較健康組顯著降低。脾虛濕滯證組有3 個(gè)差異性菌屬,其中,副細(xì)菌(Parabacteroides)較健康組顯著富集;而鏈球菌屬(Streptococcus)、放線菌屬較健康組顯著降低。
與健康對照組比較,氣陰兩虛證組患者血清中的IFN-γ 含量顯著升高(P<0.05);氣滯血瘀證組患者血清中的IL-12 含量顯著降低(P<0.01),其余組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3。
表3 各組納入者的血清IL-12、IFN-γ 含量比較(±s,pg/ml)
表3 各組納入者的血清IL-12、IFN-γ 含量比較(±s,pg/ml)
注:與健康對照組比較,*P<0.05;#P<0.01
組別 IL-12 P IFN-γ P健康對照組(n=12) 57.81±5.66 — 715.88±119.29 —?dú)怅巸商撟C組(n=7) 71.47±21.29 0.101 1016.81±362.43* 0.043脾虛濕滯證組(n=12) 49.53±14.22 0.148 784.83±87.06 0.208氣滯血瘀證組(n=13) 40.20±11.72# 0.002 839.40±245.72 0.222陰虛內(nèi)熱證組(n=14) 44.78±21.82 0.125 931.54±429.28 0.193
基于本研究結(jié)果,筆者推測肺癌中醫(yī)證候變化的實(shí)質(zhì)可能與腸道中某些菌群的數(shù)量變化或種類有關(guān)。故假設(shè)通過觀察不同中醫(yī)證型NSCLC 患者腸道菌群的多樣性及差異性,來探究NSCLC 患者不同中醫(yī)證型的生物學(xué)基礎(chǔ),從而闡釋中醫(yī)證候的科學(xué)機(jī)理。
免疫失調(diào)是致使肺癌發(fā)生、發(fā)展的重要原因[10]。IFN-γ 是一種具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子,是機(jī)體發(fā)揮免疫作用不可缺少的成分[11]。IL-12 被認(rèn)為是調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)反應(yīng)最有意義的細(xì)胞因子之一[12]。本研究結(jié)果提示,氣滯血瘀組血清中IL-12 含量較健康組顯著降低,氣陰兩虛組血清中的IFN-γ 含量較健康組顯著升高,其余無顯著性差異。在4 個(gè)證型中,血清IFN-γ 的濃度均高于健康組。筆者推測早期肺癌患者正氣尚足,處于邪正交爭階段,從而促進(jìn)宿主分泌IFN-γ 調(diào)節(jié)免疫功能及增強(qiáng)抗腫瘤作用。
特定的腸道微生物與宿主免疫系統(tǒng)相互調(diào)節(jié),共同影響人體健康[13-17]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)菌群可通過激活Myd88 通路來刺激免疫細(xì)胞分泌IL-1β 及IL-23,進(jìn)一步誘導(dǎo)肺部產(chǎn)生IL-17 的γδT 細(xì)胞(主要是Vγ6+Vδ1+ T 細(xì)胞)增殖與活化,從而促進(jìn)肺部腫瘤發(fā)展[18]。本研究中,羅斯菌屬、另枝菌屬的豐度在氣陰兩虛組中均較健康組顯著富集。相關(guān)研究證實(shí),羅斯菌屬作為腸道中的有益菌,可促進(jìn)免疫系統(tǒng)的抗腫瘤作用。Kenya Honda 研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)另枝菌屬等11 株腸道微生物可增加INFγ+CD8+T 細(xì)胞水平,提高由這些菌群介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)[19]。筆者推測,氣陰兩虛組血清中的IFN-γ、IL-12 濃度均較其他3 個(gè)證型組高可能與腸道羅斯菌屬、另枝菌屬有關(guān)。此外,本研究還檢測出諸多目前尚未證實(shí)影響腫瘤發(fā)展及免疫應(yīng)答的菌屬,有待于進(jìn)一步研究。
證候的生物學(xué)基礎(chǔ)是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的關(guān)鍵部分,生物學(xué)方法的運(yùn)用有助于闡明中醫(yī)藥的科學(xué)本質(zhì)。筆者認(rèn)為菌群的數(shù)量、結(jié)構(gòu)、種類及人體與菌群之間都維持著相對的動(dòng)態(tài)平衡,一旦平衡被破壞,就會(huì)導(dǎo)致菌群的失調(diào)進(jìn)而影響疾病的發(fā)生、發(fā)展。這種微生態(tài)理論與中醫(yī)學(xué)中的陰陽學(xué)說、整體觀等基礎(chǔ)理論不謀而合。本研究對不同中醫(yī)證型NSCLC 患者進(jìn)行腸道微生態(tài)學(xué)和免疫功能的分析,有助于為肺癌的中醫(yī)證候研究提供新思路。
利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。