麻石清肺合劑HPLC指紋圖譜的建立及7種成分含量測(cè)定

王博，吳茱萸，裴媛，于曉濤，王瑞（漯河市中心醫(yī)院，河南 漯河 462000）

麻石清肺合劑來(lái)源于《傷寒論》“麻杏石甘湯”[1]，由麻黃、厚樸、甘草、苦杏仁等中藥組成，具有清肺熱、化濁痰的功效，主要用于肺炎、慢性支氣管炎等肺病患者痰熱郁肺證。中藥飲片由于產(chǎn)地不同、炮制加工方式不同等多方面因素的影響，導(dǎo)致品質(zhì)參差不齊[2]。中藥復(fù)方制劑受制劑生產(chǎn)多個(gè)環(huán)節(jié)的影響，加之其本身成分的復(fù)雜性，其質(zhì)量的均一穩(wěn)定直接影響藥效，因此對(duì)其進(jìn)行整體質(zhì)量控制尤為重要[3]。指紋圖譜能夠?qū)χ兴幖爸兴帍?fù)方中化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)、整體的表征，呈現(xiàn)專(zhuān)屬性強(qiáng)、穩(wěn)定性高等特點(diǎn)[4]，在中藥材、飲片及復(fù)方制劑的品質(zhì)評(píng)價(jià)中得到了廣泛應(yīng)用[5-7]。結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別，可以簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，更加直觀深入地評(píng)判樣本的質(zhì)量，篩選差異化合物[8]。本文將通過(guò)HPLC法建立麻石清肺合劑指紋圖譜，聯(lián)合聚類(lèi)分析等多元統(tǒng)計(jì)方法對(duì)其進(jìn)行分析，同時(shí)測(cè)定麻石清肺樣品中鹽酸麻黃堿等7種成分的含量，為麻石清肺合劑全方位的品質(zhì)評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

HPLC色譜儀（Agilent科技公司，1260型），電子天平（日本島津公司，AUW-120D型），CJ-020S型超聲機(jī)（深圳市超潔有限公司），超純水過(guò)濾系統(tǒng)（密理博公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、甘草苷、和厚樸酚、厚樸酚（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為171241-201809、171237-201510、111610-201908、110730-201915、110729-202015，純度均大于95%），苦杏仁苷（批號(hào)為DST190829-004）、甘草酸（批號(hào)為MUST-19052407）（純度均大于98%，成都曼思特公司）。乙腈（色譜純，美國(guó)TEDIA公司）；磷酸（色譜純，天津科密歐公司）；水為自制超純水。

12批麻石清肺合劑為漯河市中心醫(yī)院自制（批號(hào)分別為20220120、20220217、20220314、20220407、20220428、20220518、20220613、20220705、20220801、20220906、20220929、20221018，編號(hào)S1～S12）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相A為0.1%磷酸-水溶液，B為乙腈，梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；流速1.0 mL·min－1；柱溫30℃；進(jìn)樣量5 μL。

表1 梯度洗脫方法Tab 1 Gradient elution method

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取各對(duì)照品適量，加50%甲醇分別配制成鹽酸麻黃堿292.600 μg·mL－1、鹽酸偽麻黃堿175.480 μg·mL－1、苦杏仁苷1248.000 μg·mL－1、甘草苷192.000 μg·mL－1、甘草酸298.080 μg·mL－1、和厚樸酚14.826 μg·mL－1、厚樸酚25.338 μg·mL－1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取麻石清肺合劑100 μL，加80%甲醇900 μL稀釋10倍，搖勻后用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按麻石清肺合劑處方工藝制備缺麻黃、厚樸、苦杏仁、甘草的陰性樣品，并稀釋10倍制備陰性樣品溶液。

2.3 麻石清肺合劑HPLC指紋圖譜的建立

2.3.1 方法學(xué)考察 取S1麻石清肺樣品100 μL制備成供試品溶液，連續(xù)6次進(jìn)樣考察精密度；平行制備6份麻石清肺樣品S1供試品溶液，進(jìn)樣檢測(cè)考察重復(fù)性；取麻石清肺樣品S1供試品溶液，放置0、3、6、9、12、24 h分別進(jìn)樣測(cè)定，考察樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定性。結(jié)果精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)得到的各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.8%，相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%。

2.3.2 指紋圖譜的構(gòu)建 取12批麻石清肺合劑供試品溶液，進(jìn)樣檢測(cè)并采集數(shù)據(jù)。運(yùn)用2012版《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》以S1樣品為參照?qǐng)D譜，生成對(duì)照指紋圖譜，見(jiàn)圖1，共標(biāo)定16個(gè)共有峰。得到樣品S1～S12的相似度分別為0.982、0.900、0.986、0.992、0.976、0.937、0.968、0.980、0.989、0.975、0.979、0.991。

圖1 12批麻石清肺合劑的HPLC指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprints of 12 batches of Mashi Qingfei mixture

2.4 化學(xué)模式識(shí)別分析

2.4.1 聚類(lèi)分析 將12批麻石清肺合劑的16個(gè)共有峰數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 25.0軟件，采用組間聯(lián)結(jié)法聚類(lèi)分析，以平方歐氏距離為區(qū)間，見(jiàn)圖2。當(dāng)平方歐氏距離為10時(shí)12批樣品分為4類(lèi)，第1類(lèi)為S2，第2類(lèi)為S5、S6，第3類(lèi)為S3、S12，第4類(lèi)為S1、S4、S7～11。

圖2 麻石清肺合劑樣品聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖Fig 2 Mashi Qingfei mixture sample clustering analysis

2.4.2 主成分分析 對(duì)12批麻石清肺合劑中16個(gè)共有峰數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行因子分析。結(jié)果見(jiàn)表2，有4個(gè)主成分的特征值大于1，方差貢獻(xiàn)率累計(jì)達(dá)到85.6%，表明其包含了85.6%的色譜圖信息。峰2、5～7、9、13在主成分1上具有較高的載荷（分別為0.812、0.768、0.875、0.807、0.791、0.750），其代表了主成分1的主要信息；主成分2主要代表了峰1、15、16（分別為0.787、0.967、0.941）；主成分3主要代表了峰3、4、11、12（分別為0.923、0.928、0.513、0.679）；主成分4主要代表了峰8、10、14（分別為0.766、0.880、0.850）。

表2 12批麻石清肺合劑中的主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率Tab 2 Characteristic value and contribution rate of 12 batches of Mashi Qingfei mixture

2.4.3 正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）以12批麻石清肺合劑中16個(gè)共有峰峰面積為變量，構(gòu)建12×16的原始數(shù)據(jù)矩陣，采用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行OPLS-DA分析，結(jié)果見(jiàn)圖3、4。8、7（苦杏仁苷）、3（鹽酸麻黃堿）、9、10（甘草苷）、4（鹽酸偽麻黃堿）、6號(hào)峰的VIP值均大于1.0，這7種成分可能為麻石清肺樣品的差異性成分。

圖3 正交偏最小二乘判別分析得分矩陣圖Fig 3 OPLS-DA score plot

圖4 麻石清肺合劑樣品中16個(gè)共有峰的VIP圖Fig 4 VIP of 16 common peaks of Mashi Qingfei mixture

2.5 多成分含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相A為0.1%磷酸-水溶液，B為乙腈，梯度洗脫程序見(jiàn)表3；流速1.0 mL·min－1；柱溫30℃；進(jìn)樣量5 μL。檢測(cè)波長(zhǎng)：0～47 min，210 nm（鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷）；47～75 min，237 nm（甘草苷）；75～95 min，251 nm（甘草酸）；95～125 min，210 nm（和厚樸酚、厚樸酚）。

表3 梯度洗脫方法Tab 3 Gradient elution method

2.5.2 專(zhuān)屬性考察 取混合對(duì)照品溶液、S1供試品溶液、陰性樣品溶液適量進(jìn)樣，得到各色譜圖見(jiàn)圖5，結(jié)果顯示陰性樣品不干擾樣品中7種成分的測(cè)定。

圖5 對(duì)照品溶液、S1供試品溶液和陰性樣品溶液（缺麻黃、苦杏仁、甘草、厚樸）色譜圖Fig 5 HPLC chromatograms of reference solution，S1 sample solution and negative sample solution（without Ephedrae Herba，Armeniacae Semen Amarum，Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma，or Magnoliae Officinalis Cortex）

2.5.3 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，分別用50%甲醇稀釋成系列對(duì)照品溶液，進(jìn)樣并記錄各濃度下色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、各成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性擬合。同時(shí)測(cè)定鹽酸麻黃堿等7種成分的定量限[LOQ，信噪比（S/N）＝10]和檢測(cè)限（LOD，S/N＝3），結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 7種成分的回歸方程與線性范圍Tab 4 Regressive equations and linear ranges of 7 components

2.5.4 方法學(xué)考察 用50%甲醇稀釋“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，稀釋5倍后連續(xù)進(jìn)樣6次考察儀器精密度。取S1樣品溶液6份，平行制備成供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算7種成分含量考察方法重復(fù)性。取S1樣品溶液，制備后于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定考察穩(wěn)定性。取S1樣品溶液6份，精密加入含鹽酸麻黃堿63.840 μg·mL－1、鹽酸偽麻黃堿35.096 μg·mL－1、苦杏仁苷265.600 μg·mL－1、甘草苷38.400 μg·mL－1、甘草酸57.960 μg·mL－1、和厚樸酚3.163 μg·mL－1、厚樸酚5.562 μg·mL－1的混合對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果精密度試驗(yàn)中7種成分的峰面積RSD均在1.0%～1.3%；重復(fù)性試驗(yàn)中7種成分含量的RSD均在0.49%～2.8%；穩(wěn)定性試驗(yàn)中7種成分峰面積的RSD均在1.2%～2.8%。7種成分的平均加樣回收率為98.12%～101.55%，RSD為1.8%～2.9%。

2.5.5 含量測(cè)定 取12批麻石清肺合劑樣品，制備成供試品溶液進(jìn)樣，并計(jì)算12批樣品中各成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 7種成分的含量測(cè)定結(jié)果(n＝3，μg·mL－1)Tab 5 Content of 7 components (n＝3，μg·mL－1)

3 討論

本研究考察了水、甲醇、80%甲醇等不同類(lèi)型提取溶劑對(duì)樣品的影響，發(fā)現(xiàn)80%甲醇為提取溶劑時(shí)色譜峰響應(yīng)較大、峰數(shù)較多?？疾炝薎nertsil ODS-3 C18、Shimadzu shim-pack GIST C18、Agilent ZORBAX SB C18不同色譜柱，結(jié)果顯示Agilent ZORBAX SB C18色譜柱峰形最好。比較210、230、254、280 nm不同檢測(cè)波長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)樣品在210 nm下出峰數(shù)目最多，故選擇指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，同時(shí)在多成分含量測(cè)定方法中分別選擇化合物各自的最大吸收波長(zhǎng)，鹽酸麻黃堿、和厚樸酚、鹽酸偽麻黃堿、厚樸酚、苦杏仁苷為210 nm，甘草苷為237 nm，甘草酸為251 nm，多波長(zhǎng)切換進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)由于指紋圖譜在210 nm下色譜峰較多，因此其色譜條件梯度變化較緩，時(shí)間較長(zhǎng)，考慮到后續(xù)的多成分含量測(cè)定需進(jìn)行方法學(xué)考察及樣品含量的測(cè)定，為節(jié)約分析時(shí)間，在保證7種成分分離度的前提下對(duì)色譜條件的梯度進(jìn)行了調(diào)整。

本研究建立了12批麻石清肺合劑的指紋圖譜，相似度以對(duì)照指紋圖譜為參考在0.900～0.992，表明這12批樣品質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。結(jié)合聚類(lèi)分析、OPLS-DA等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行分析，結(jié)果不同批次樣品呈現(xiàn)一定的差異，篩選出7個(gè)共有峰VIP值大于1，分別為8、7（苦杏仁苷）、3（鹽酸麻黃堿）、9、10（甘草苷）、4（鹽酸偽麻黃堿）、6號(hào)峰。本方中麻黃指標(biāo)成分為鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿，具有止咳平喘、抗病毒、抗炎等功效[9-10]；苦杏仁中主要成分為苦杏仁苷，在體內(nèi)緩慢分解為氫氰酸，從而舒張支氣管平滑肌，發(fā)揮止咳平喘的作用[11]；甘草中的甘草苷、甘草酸抗病毒、抗腫瘤、免疫保護(hù)等活性較強(qiáng)[12-13]；厚樸中的和厚樸酚、厚樸酚具有腸道保護(hù)、抗病毒等作用[14-15]；依據(jù)本方君臣佐使配伍原理及主要藥效成分選擇此7種成分進(jìn)行定量。12批麻石清肺合劑的含量測(cè)定結(jié)果表明不同批次間7種成分含量存在一定的差異，考慮到與所用飲片產(chǎn)地、批次、廠家、制劑加工等因素有關(guān)，提示在今后的生產(chǎn)中可以固定飲片產(chǎn)地、廠家，控制生產(chǎn)參數(shù)等因素的影響，以保證制劑質(zhì)量的均一穩(wěn)定。

綜上所述，本研究所建立的指紋圖譜和含量測(cè)定方法穩(wěn)定可行，聯(lián)合模式識(shí)別可為麻石清肺合劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。