維胺酯原料藥的有關物質(zhì)分析

李鈺鑫，蘭文*，劉雁鳴（1.湖南省藥品檢驗檢測研究院，長沙 410001；2.國家藥品監(jiān)督管理局藥用輔料工程技術研究重點實驗室，長沙 410001）

維胺酯，化學名為N-（4-乙氧碳基苯基）維甲酰胺，因結構與全反式維A 酸類似，其作用機制與13-順維A 酸及芳香維A 酸較相似，但刺激性低于維A酸，不良反應比維A酸少，治療指數(shù)為維A酸的10倍[1-2]。維胺酯能夠調(diào)節(jié)和控制上皮細胞分化與生長，減少皮脂分泌，抑制角質(zhì)形成細胞的角化過程，使角化異常恢復正常，發(fā)揮抗雄激素、抗炎、調(diào)節(jié)免疫及預防瘢痕形成等作用，用于治療各種痤瘡、角化異常性皮膚病等，同時對魚鱗病、銀屑病（牛皮癬）、苔蘚類皮膚病、黏膜病及結締組織等疾病也有一定療效[3-5]。維胺酯為我國自行研制的維A酸類藥物，維A酸作為起始原料與三氯化磷反應轉化為維A酰氯，再與苯佐卡因反應生成維胺酯，反應路線如圖1所示。目前國內(nèi)僅3家維胺酯原料生產(chǎn)企業(yè)，國內(nèi)外藥典均未收載該品種[6-7]，現(xiàn)行標準為《國家藥品標準》化學藥品地標升國標第二冊[WS-10001-（HD-0164）-2002]和原國家食品藥品監(jiān)督管理總局標準YBH14602008，與《國家藥品標準》化學藥品地標升國標第二冊標準比較，原國家食品藥品監(jiān)督管理總局標準YBH14602008增訂了有關物質(zhì)及殘留溶劑檢查，有關物質(zhì)方法僅對雜質(zhì)總量進行控制。本文在現(xiàn)行標準基礎上，結合《中國藥典》2020年版四部指導原則[8]，首次建立了同時測定維胺酯中維A酸和其他雜質(zhì)的HPLC方法；并采用液質(zhì)聯(lián)用技術[9-10]結合強制降解試驗，對主要未知雜質(zhì)峰進行定性分析并推測雜質(zhì)來源。采用ADMET Predictor 軟件[11]對維胺酯及其主要雜質(zhì)進行毒性預測，為制訂維胺酯原料藥的質(zhì)量標準提供參考。

1 材料

Ultimate3000型高效液相色譜儀（美國戴安公司）；十萬分之一MS205DU電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；1290-6550型高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（美國安捷倫公司）。

維胺酯對照品（純度：99.03%，批號：190303，C公司，湖南省藥品檢驗研究院標定）；維A酸對照品（純度：99.4%，批號：100307-200902，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇（色譜純，Burdick ＆Jackson）；水為純化水；其他試劑均為分析純；15批維胺酯原料藥（A公司，批號分別為170101、170102、170103、181002；B公司，批號分別為161205、161206、190303、190304、190305；C公司，批號分別為V2A20160501、V2A20160502、V2A20160503、VIA-20190401、VIA-20190402、VIA-20190403）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（93∶7）；流速：1.0 mL·min－1，檢測波長：370 nm；進樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取維胺酯約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇適量超聲使溶解，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取維A酸對照品約12.5 mg，置100 mL量瓶中，用甲醇適量超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 對照溶液的制備 精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 系統(tǒng)適用性溶液的制備 取維胺酯對照品適量，加甲醇超聲溶解并稀釋成每1 mL中約0.5 mg的溶液，取溶液適量，于（2500±500）lx光照強度下照射30 min，即得。

2.3 方法學驗證

2.3.1 專屬性 取“2.2”項下系統(tǒng)適用性溶液、對照品溶液、供試品溶液及稀釋劑（甲醇）各20 μL進樣測定，結果顯示維胺酯的出峰時間約15.6 min，維A酸的出峰時間約6.363 min，峰形對稱性較好，維A酸理論塔板數(shù)在11 000以上，主峰與已知雜質(zhì)維A酸及其他未知雜質(zhì)峰均有效分離。空白溶劑對測定無干擾，結果見圖2。

2.3.2 強制降解試驗 采用光照、酸、堿、氧化、高溫等劇烈條件對本品（批號：170101）進行破壞性降解處理。取本品25 mg，平行5份，分置50 mL量瓶中，經(jīng)以下條件進行破壞處理：① 光照破壞[于照度（2500±500）lx下放置5 d]；② 酸破壞（1 mol·L－1鹽酸溶液0.5 mL，放置4 h，加5 mol·L－1氫氧化鈉溶液調(diào)至中性）；③ 堿破壞（1 mol·L－1氫氧化鈉溶液0.5 mL，放置4 h，加5 mol·L－1鹽酸溶液調(diào)至中性）；④ 氧化破壞（3%過氧化氫溶液1 mL，放置4 h）；⑤ 高溫破壞（置150℃烤箱中放置4 h，放冷）。結果表明：光照破壞試驗中，在主峰相對保留時間0.9處的未知雜質(zhì)峰面積明顯增加，命名該雜質(zhì)為雜質(zhì)A，說明本品易被光破壞，后期試驗均采用避光操作；其他破壞試驗產(chǎn)生了少量雜質(zhì)，各雜質(zhì)均能與主峰完全分離，表明本色譜系統(tǒng)專屬性良好。在各破壞試驗記錄的色譜圖中，主峰保留時間2倍以后的基線平穩(wěn)且沒有檢測出其他雜質(zhì)峰，故供試品溶液的采集時間擬定為主峰保留時間的2倍，見圖3。

圖3 維胺酯強制降解試驗色譜圖Fig 3 HPLC chormatogram for forced degradation test of viaminate

2.3.3 維A酸的線性關系考察 取維A酸對照品20.43 mg，置100 mL棕色量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為維A酸對照品儲備液。分別精密量取維A酸對照品儲備液適量，用甲醇依次稀釋配成質(zhì)量濃度約為0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、50.0 μg·mL－1的系列對照品溶液。精密量取上述溶液各20 μL，依法測定，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：Y＝136.34X－15.255，r＝1.000，結果表明，維A酸在0.1015～50.76 μg·mL－1與峰面積線性關系良好。

2.3.4 進樣精密度試驗 取“2.3.3”項下第4份溶液，精密量取20 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，結果RSD為0.67%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 回收試驗 精密稱取已知維A酸雜質(zhì)量（0.052%）的樣品（批號：170101）約25 mg 6份，分別置50 mL棕色量瓶中，各精密加入維A酸對照品溶液（質(zhì)量濃度為0.1244 mg·mL－1）1 mL，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定并計算回收率，平均回收率為98.12%，RSD為0.53%。

2.3.6 定量限及檢測限考察 取維胺酯和維A酸對照品各適量，逐級稀釋，各取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。設定量限S/N＝10，檢測限S/N＝3，得維胺酯和維A酸的定量限依次為0.058 μg·mL－1和0.074 μg·mL－1，檢測限依次為0.020 μg·mL－1和0.039 μg·mL－1，

2.3.7 重復性試驗 取“2.3.5”項下6份供試品溶液20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，測得維A酸的量為0.59%，RSD為1.0%；其他單個雜質(zhì)量為0.28%，RSD為1.0%；各雜質(zhì)總量為1.0%，RSD為1.2%。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗 取“2.2”項下供試品溶液，分別于室溫放置0、2、4、8、12、24 h后，進樣測定，結果供試品溶液中維A酸、其他單個雜質(zhì)及各雜質(zhì)的總峰面積的RSD分別為1.3%、0.88%及0.60%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.9 耐用性試驗 使用3個品牌色譜柱[Agilent Eclipse XDB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Welch Ultimate X C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、CAPCELL TYPE MGⅡ（4.6 mm×250 mm，5 μm）]調(diào)整柱溫、流速、流動相比例等色譜條件進行耐用性考察，結果峰形和分離均較好，精密稱取維胺酯（批號：170101）約25 mg 依法測定有關物質(zhì)，結果見表1。

表1 維A酸的耐用性試驗結果Tab 1 Durability of retinoic acid

2.4 樣品含量的測定

取3家公司的15批樣品依法測定有關物質(zhì)，維A酸含量以外標法按峰面積計算，其他雜質(zhì)含量采用主成分自身對照法計算，結果見表2。

表2 樣品有關物質(zhì)測定結果(%)Tab 2 Related substances of samples (%)

2.5 未知雜質(zhì)質(zhì)譜分析

樣品的測定結果表明，3家公司的15批樣品均檢出降解雜質(zhì)A，且含量達0.1%，可能存在安全隱患，有必要對未知雜質(zhì)進行歸屬。本文采用高效液相色譜-四極桿-飛行時間液質(zhì)聯(lián)用儀[10]，在ESI負離子模式下，得到該未知雜質(zhì)的一、二級質(zhì)譜信息，結果顯示雜質(zhì)A與維胺酯的分子離子峰和離子碎片幾乎相同，結果見圖4。

2.6 雜質(zhì)毒性預測和評價

使用Chemdraw軟件畫出維胺酯及雜質(zhì)的結構式并保存為“.mol”格式，導入ADMET Predictor軟件，對維胺酯及維A酸、雜質(zhì)A的毒理性質(zhì)參數(shù)進行全面預測。結果顯示三者主要毒性為肝臟毒性，另外還有潛在致敏性和生殖毒性，維A酸的預測毒性低于維胺酯，雜質(zhì)A與維胺酯的毒性預測結果基本一致，結果見表3。

表3 ADMET Predictor 軟件預測結果Tab 3 Predict outcomes by ADMET Predictor software

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

維胺酯脂溶性較強，且遇光易變質(zhì)，產(chǎn)生的降解雜質(zhì)與主峰較難達到基線分離，故選擇光破壞溶液作為系統(tǒng)適用性溶液?，F(xiàn)行標準YBH14602008有關物質(zhì)檢查方法采用C18柱，采用不同品牌、不同型號的C18柱，適當調(diào)整流動相比例，均能將維胺酯與光降解雜質(zhì)有效分離。

3.2 溶劑的選擇

分別考察用流動相、甲醇及水作為溶劑時對有關物質(zhì)測定的影響，結果顯示當使用水為溶劑時，樣品幾乎不溶解；當使用流動相為溶劑時，樣品很難溶解。最終選擇甲醇作為稀釋劑，供試品溶解完全，且稀釋劑與主成分維胺酯對待測組分無干擾。

3.3 波長的選擇

截取系統(tǒng)適用性溶液DAD圖中維胺酯的紫外光譜圖、對照品溶液DAD圖中維A酸的紫外光譜圖、供試品溶液DAD圖中主要雜質(zhì)的紫外光譜圖及破壞試驗DAD圖中主要降解雜質(zhì)的紫外光譜圖，結果顯示：維胺酯在370 nm波長處有最大吸收，特殊雜質(zhì)維A酸、雜質(zhì)A及其他主要雜質(zhì)在該波長處都有一定的吸收，故選擇370 nm作為有關物質(zhì)的檢測波長。

3.4 雜質(zhì)A的來源分析

強制降解試驗表明，維胺酯光照敏感，在強光條件下降解產(chǎn)物雜質(zhì)A的峰面積明顯增加，進一步對該雜質(zhì)進行質(zhì)譜分析，其質(zhì)譜圖與維胺酯質(zhì)譜圖一致，經(jīng)企業(yè)調(diào)研和文獻查閱，維胺酯為全反式維A酸的衍生物，其為全反式維A酸的酸根經(jīng)?；?，與氨基反應生成的衍生物，因此也為全反式結構，且維A酸見光易轉化為其順式異構體異維A酸，推斷其為維胺酯的同分異構體（或順式維胺酯）。雜質(zhì)A來源分析見圖5。

圖5 雜質(zhì)A可能來源Fig 5 Formation mechanism of impurity A

3.5 限度擬訂

維A酸為維胺酯合成的起始原料，直接反映維胺酯生產(chǎn)工藝的優(yōu)劣；雜質(zhì)A為維胺酯的主要降解雜質(zhì)，反映其儲存條件下質(zhì)量的優(yōu)劣，故對雜質(zhì)維A酸及雜質(zhì)A進行質(zhì)量控制?，F(xiàn)行標準有關物質(zhì)項中僅對總雜質(zhì)量進行控制，限度為2.0%；參考ADMET Predictor軟件毒性分析結果：維A酸、雜質(zhì)A同維胺酯的毒性相當；同時考慮維胺酯相關制劑的治療周期為4～6周，非長期用藥；結合各企業(yè)近效期樣品的試驗考察結果以及工藝控制情況，暫擬訂限度為維A酸不得過0.5%，雜質(zhì)A不得過0.5%，其他單雜不得過0.5%，各雜質(zhì)總和不得過2.0%。

3.6 維胺酯的質(zhì)量現(xiàn)狀

根據(jù)對國產(chǎn)3家主要生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品的有關物質(zhì)檢查結果，工藝雜質(zhì)維A酸含量均小于0.1%，說明國內(nèi)企業(yè)對該雜質(zhì)控制均較好；各企業(yè)均檢出光降解雜質(zhì)A，說明在樣品儲存過程中，企業(yè)應嚴格控制儲存條件，避免其光照降解。

4 結論

本文建立了一種有效檢測維胺酯原料藥中有關物質(zhì)的高效液相色譜法?；谫|(zhì)譜數(shù)據(jù)，結合強制降解試驗結果以及維胺酯的處方和生產(chǎn)工藝，推測維胺酯中主要雜質(zhì)的結構與來源，并用計算機軟件預測雜質(zhì)的毒性，為維胺酯的質(zhì)量控制奠定了基礎，為該品種的處方和生產(chǎn)工藝、質(zhì)量控制及儲存條件提供了參考依據(jù)。