紫紋兜蘭的花形態(tài)和雙雄蕊花藥發(fā)育及分類學(xué)意義

朱永 黃家林 陶凱鋒 王樂騁 張錦 李璐

摘 要： ???兜蘭屬的分類系統(tǒng)學(xué)爭議較大，亟待更多資料澄清。該文利用體式解剖鏡和石蠟切片技術(shù)觀察了紫紋兜蘭的花結(jié)構(gòu)和雙雄蕊花藥發(fā)育特征。結(jié)果表明：（1）花形態(tài)特征支持將紫紋兜蘭放置于兜蘭亞屬的單花斑葉組，包括萼片具脈紋、花瓣長圓形帶黑褐斑，唇瓣具直立的耳狀結(jié)構(gòu)，退化雄蕊新月形等。（2）花藥原基分化出一對側(cè)生并列的藥室，花藥室中央分化出一條不完全貫穿的不育隔膜組織，將其分化為兩個(gè)小孢子囊。在花藥成熟時(shí)，不育隔膜組織被降解吸收，兩個(gè)花粉囊通過次生融合形成一枚馬鞍形的黏性花粉團(tuán)。（3）發(fā)育完整的花藥壁有4層，由外到內(nèi)分別為表皮、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層，符合單子葉型花藥壁。花藥壁具絨氈層和內(nèi)絨氈層，均為2核。在2-細(xì)胞花粉時(shí)期，中層和絨氈層發(fā)生降解，藥室內(nèi)壁發(fā)生纖維狀加厚。（4）小孢子母細(xì)胞經(jīng)同時(shí)型胞質(zhì)分裂形成不同排列方式的小孢子四分體，包括正四面體、左右對稱和十字交叉型，并且同一藥室的小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂不同步現(xiàn)象明顯。（5）在雄配子體發(fā)育階段，小孢子或保持在四分體內(nèi)或從四分體中游離出來，經(jīng)有絲分裂發(fā)育為2-細(xì)胞型花粉，形成具有黏性的四合花粉或花粉粒?；诂F(xiàn)有資料，該文比較分析了紫紋兜蘭不完全貫穿的不育隔膜組織、單子葉型花藥壁、具2核的絨氈層和內(nèi)絨氈層、同時(shí)型胞質(zhì)分裂和黏性花藥等特征的分類學(xué)意義，為理解兜蘭屬及杓蘭亞科的分類學(xué)和保護(hù)生物學(xué)提供新資料。

關(guān)鍵詞： ?兜蘭屬， 杓蘭亞科， 花藥壁發(fā)育， 小孢子發(fā)生， 雄配子體發(fā)育， 花粉散粉單元， 分類學(xué)

中圖分類號： ??Q949.58

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： ???A

文章編號： ??1000-3142（2024）01-0102-11

Floral morphology and anther development in diandrous

orchid Paphiopedilum purpuratum with

their taxonomic implications

ZHU Yong1， HUANG Jialin2， TAO Kaifeng1， WANG Yuecheng1， ZHANG Jin1， LI Lu1*

（ 1. College of Biodiversity Conservation， Southwest Forestry University， Kunming 650224，

China; 2. Yuxi Normal University， Yuxi 653100， Yunnan， China ）

Abstract： ??The taxonomy of Paphiopedilum Pfitz. has been disputed and needs more data for clarification. Floral morphology and anther development in P. purpuratum were observed using microscope and paraffin section. The results were as follows： （1） It was supported that P. purpuratum should be placed in Paphiopedilum subgenus Paphiopedilum sect. Barbata by some floral features， including a single flower， sepal white with veins， petal spotted with blackish-maroon， pouch of a lip auriculate on both sides， and a staminode lunate. （2） At the early stage， anther primordium developed into a pair of laterally juxtaposed thecae. An incomplete sterile septa was differentiated in the center of each theca， giving rise to two arc-shaped microsporangia. When anther split， the sterile septum was discomposed and degenerated resulting in a mass of sticky pollens from two pollen sacs were fused into a unit. （3） The developed anther wall consisted of an epidermis， an endothecium， a middle layer， and a tapetum， conforming to the monocotyledonous type. Both tapetum and the inner tapetum cells contained 2 nuclei. At the stage of 2-celled grains， degeneration occurred in the epidermis and tapetum layers， while the endothecium became thickened fibrously. （4） Microspore mother cells underwent a simultaneous cytokinesis resulting in microspore tetrads with varied arrangements of tetrahedral， isobilateral， and decussate types， and the meiotic activity of microspore mother cells in the same theca was obviously asynchronous and different meiosis phases could be observed. （5） Microspores produced 2-celled pollens via a mitosis， which could be retained in pollen tetrads or released as monad. Based on the data available， some key features are selected for taxonomy and conservation biology of Paphiopedilum in Cypripedioideae， including the differentiation of incomplete sterile septum， the monocotyledonous type of anther wall， the binucleated tapetum， differentiation of the ?inner tapetum， simultaneous cytokinesis， the sticky pollens， and so on. This study provides new information for taxonomy and conservation biology of Paphiopedilum， as well as of ?Cypripedioideae.

Key words： ?Paphiopedilum， Cypripedioideae， anther wall development， microsporogenesis， male gametogenesis， pollen dispersal unit， taxonomy

杓蘭亞科（Cypripedioideae Lindl.）的花形態(tài)特征在蘭科里較為獨(dú)特，主要因其具有兩枚可育雄蕊和花藥開裂時(shí)散粉單元為黏性花粉，明顯區(qū)別于其余4個(gè)亞科（Dressler， 1986; Kocyan & Endress， 2001; Singer et al.， 2008）。作為蘭科的基部類群，具有兩枚可育雄蕊的杓蘭亞科與具有三枚可育雄蕊的擬蘭亞科（Apostasioideae Rchb.）的親緣關(guān)系較近，包括5個(gè)屬約180種，每個(gè)屬都有獨(dú)立而特定的地理分布（Dressler， 1986; Cox et al.， 1997; Pridgeon et al.， 1999）。除了南美洲特有的3個(gè)小屬以外，其余2個(gè)屬在我國均有分布，即杓蘭屬（Cypripedium L.）和兜蘭屬（Paphiopedilum Pfitz.）（Cribb， 1998; 郎楷永，1999； 劉仲健等，2009）。杓蘭亞科具較高觀賞價(jià)值（Cribb， 1998; 郎楷永，1999），其野生資源備受關(guān)注，國產(chǎn)兜蘭屬和杓蘭屬均被列入國家重點(diǎn)保護(hù)植物名錄（國家林業(yè)和草原局 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部，2021）。

長期以來，兜蘭屬的分類系統(tǒng)爭議較大，問題主要集中在屬下的亞屬及其分組的處理。早期的分類系統(tǒng)根據(jù)唇瓣形態(tài)（Atwood， 1984; Cribb， 1987）和細(xì)胞學(xué)（Karasawa， 1980， 1982）將兜蘭屬分為2個(gè)亞屬或6個(gè)亞屬。后來的研究認(rèn)為該屬應(yīng)該劃分為3個(gè)亞屬（Cribb， 1998; Pridgeon et al.， 1999），得到了分子系統(tǒng)學(xué)證據(jù)的支持（Cox et al.， 1997; Chochai et al.， 2012; Tsai et al.， 2020），但現(xiàn)有中國兜蘭屬的分類系統(tǒng)仍舊采納兩個(gè)亞屬的概念（郎楷永，1999； 劉仲健等，2009）亟待澄清。在重建兜蘭屬分類系統(tǒng)的資料中，葉面斑塊的有無和唇瓣形態(tài)常被用作該屬的物種鑒定依據(jù)（Cribb， 1998; Pridgeon et al.， 1999; 郎楷永，1999；劉仲健等，2009），其余花結(jié)構(gòu)的分類學(xué)價(jià)值極少受到關(guān)注。Cribb（1998）認(rèn)為兜蘭亞屬（Paphiopedilum subgenus Paphiopedilum）的單花斑葉組（sect. Barbata）因普遍具有單花、唇瓣基部直立的耳狀結(jié)構(gòu)、葉片具明暗鑲嵌的斑塊等可用于該組的分類依據(jù)。它明顯區(qū)別于多花無耳組（sect. Coryopedilum），后者普遍具數(shù)朵花組成的花序，唇瓣基部無耳狀結(jié)構(gòu)，葉片光滑凈色無斑塊。紫紋兜蘭 ［P. purpuratum （Lindl.） Stein］是中國兜蘭屬最早被引種栽培和命名發(fā)表的物種，模式標(biāo)本產(chǎn)于我國的香港，在福建、廣東、廣西和云南以及境外的越南也有分布（劉仲健等，2009）。根據(jù)唇瓣小于中萼片的形態(tài)特征，紫紋兜蘭被放置于兜蘭亞屬（Cribb， 1998; Pridgeon et al.， 1999; 郎楷永，1999）。近年來的分子系統(tǒng)學(xué)進(jìn)一步把它列入單花斑葉組（Cox et al.， 1997; Chochai et al.， 2012; Tsai et al.， 2020），但是，關(guān)于它的形態(tài)學(xué)和花藥發(fā)育特征的研究資料較少。

花形態(tài)和花藥發(fā)育胚胎學(xué)特征在蘭科分類系統(tǒng)學(xué)中發(fā)揮著重要作用，包括唇瓣與合蕊柱的形態(tài)、可育雄蕊和花藥室的數(shù)目、花藥壁發(fā)育類型、絨氈層特征、小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂類型、花藥成熟時(shí)的散粉單元等（Burns & Bernhardt， 1985; Dressler， 1986， 1993; Johri et al.， 1992; Johnson & Edwards， 2000; Harder & Johnson， 2008; 李璐，2023），但資料較少（Sood， 1989; 譚慶琴等，2020）。最新的蘭科分類系統(tǒng)為理解5個(gè)亞科的花形態(tài)和胚胎學(xué)特征的分類系統(tǒng)學(xué)意義提供了基礎(chǔ)框架（Chase et al.， 2015）?，F(xiàn)有蘭科花藥發(fā)育資料集中在具有3枚可育雄蕊的擬蘭亞科（Apostasioiedeae）（Kocyan & Endress， 2001）、具有單雄蕊的蘭亞科（Orchidoideae）（Swamy， 1946; Maheshwari & Narayanaswami， 1952; Kant & Bhanwra， 2010）和樹蘭亞科（Epidendroideae）（Bhanwra & Vij， 2003; Kant， 2019， 2023; 譚慶琴等，2020）。在具有雙雄蕊的杓蘭亞科中，杓蘭屬的花藥發(fā)育過程研究資料較多（Swamy， 1949; Brown & Lemmon， 1996; Sood & Rao， 1988; Kant， 2011），但兜蘭屬的花藥發(fā)育資料相對少見（Swamy， 1949; 任玲和王伏雄，1987），其余3個(gè)屬的資料也較為匱乏（Johri et al.， 1992; Cribb， 1998）。本研究利用體式解剖鏡和石蠟切片技術(shù)，觀察了紫紋兜蘭的花結(jié)構(gòu)和花藥發(fā)育過程中的不育隔膜組織的分布和分化、花藥壁類型、胞質(zhì)分裂方式、花藥形態(tài)等特征，結(jié)合現(xiàn)有資料，比較分析其分類學(xué)意義，為理解兜蘭屬及杓蘭亞科的分類學(xué)和保護(hù)生物學(xué)提供新資料。

1 材料與方法

紫紋兜蘭栽培于西南林業(yè)大學(xué)科研教學(xué)實(shí)習(xí)基地（云南豐春坊生物科技有限公司蘭花資源圃），生長多年，正常開花。2017—2020年，連續(xù)4年采集不同發(fā)育時(shí)期的花蕾和開放花，取15朵左右新鮮開放花，在徠卡體式解剖鏡（Leica M165 FC）下觀察唇瓣、合蕊柱、花粉團(tuán)等花結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征并拍照，其余材料固定在50%的酒精，24 h后轉(zhuǎn)入70%的酒精常溫保存。取固定后的材料，按發(fā)育形態(tài)分為3個(gè)階段（幼嫩花蕾期、花蕾期、開花期），每個(gè)階段取5～10朵。材料經(jīng)酒精梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋，常規(guī)石蠟切片（Leica RM 2235，切片厚度為8 μm）。切片經(jīng)烘干、脫蠟、復(fù)水、愛氏蘇木精染色、中性樹脂膠封片后，制成永久切片。切片在尼康顯微鏡（Nikon E100）下觀察并拍照，利用圖像編輯軟件（Adobe Photoshop CS6）制作圖版。蘭科植物結(jié)構(gòu)術(shù)語參考《中國蘭科植物鑒別手冊》（陳心啟等，2009）。

2 結(jié)果與分析

2.1 花形態(tài)及解剖特征

紫紋兜蘭具有以下典型的花結(jié)構(gòu)特征（圖版Ⅰ ：1）：單花，花葶長達(dá)30 cm以上；花大，深紫色，帶明顯條紋；中萼片白色、闊卵形，邊緣外卷，頂部急劇變狹呈尖角；合萼片狹披針形，與子房并列向下生長；側(cè)花瓣長圓形，具紫紅色脈紋，邊緣淺波狀外卷；唇瓣深盔狀，囊口方闊，前端無缺刻，兩側(cè)具一個(gè)直立的耳；基部的側(cè)裂片向內(nèi)卷，具疣狀突起。解剖鏡下，可觀察到雄蕊和雌蕊僅在基部愈合為半生合蕊柱，呈扁平半圓柱形，分背腹面，密被紫色短柔毛；兩側(cè)各有1枚可育雄蕊，花絲肉質(zhì)短粗；上部有獨(dú)立生長的柱頭和退化雄蕊，肉質(zhì)扁平呈盾狀，朝近軸面呈90°彎曲生長（圖版Ⅰ ：2-4）。退化雄蕊倒心形半月狀（圖版Ⅰ ：2，3）；柱頭圓餅狀，表面光滑，帶3淺裂（圖版Ⅰ ：3-5）。花藥發(fā)育早期，兩枚可育雄蕊與柱頭近等高（圖版Ⅰ ：5），可見花藥由一對側(cè)生花藥室組成（圖版Ⅰ ：6），每個(gè)花藥室頂部沿縱軸有一條淺槽（圖版Ⅰ ：5，6）。發(fā)育后期，花藥室沿淺槽開裂（圖版Ⅰ ：7），露出表面光滑、呈彎曲棒狀、粘成一團(tuán)的花粉（圖版Ⅰ ：8）。

2.2 花藥壁發(fā)育

在早期花藥的橫切面上，可觀察到合蕊柱基部兩側(cè)各有1枚可育雄蕊，其花藥均由一對側(cè)生花藥室組成，朝近軸面彎曲生長，有圍抱合蕊柱之勢（圖版Ⅱ ：1）。每對花藥室連接處的薄壁細(xì)胞染色較淺，具有明顯的主維管束，構(gòu)成一條較寬的藥隔組織 （圖版Ⅱ ：1）?；ㄋ幨抑醒胗幸粓F(tuán)孢原細(xì)胞分化為染色較淺的薄壁細(xì)胞且未參與不育隔膜組織的形成，其中最外1～2層細(xì)胞徑向伸長，發(fā)育為具有2核的內(nèi)絨氈層（圖版Ⅱ ：2，3）。小孢子母細(xì)胞時(shí)期，花藥室表皮下的一個(gè)孢原細(xì)胞經(jīng)2次平周分裂形成了具有4層細(xì)胞的成熟花藥壁，由外至內(nèi)分別為表皮、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層（圖版Ⅱ ：4，5）。因此，花藥壁發(fā)育模式為單子葉型。小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期間，表皮細(xì)胞多為整齊的長方形（圖版Ⅱ ：1，7），有的呈波浪狀或齒狀（圖版Ⅱ ：4-6）；藥室內(nèi)壁細(xì)胞增大呈方廓形至長方形（圖版Ⅱ ：4-10）；中層細(xì)胞細(xì)小，單核；絨氈層細(xì)胞增大具有明顯的雙核（圖版Ⅱ ：4-8）。在小孢子四分體或小孢子單體時(shí)期（圖版Ⅱ ：6-9），中層和絨氈層降解明顯，藥室內(nèi)壁細(xì)胞繼續(xù)增大，表皮細(xì)胞變窄?；ㄋ幊墒鞎r(shí)，花藥壁僅剩下表皮殘跡和帶狀纖維加厚的藥室內(nèi)壁層（圖版Ⅱ ：10）。從成熟花藥的縱切面和橫切面上可以觀察到不育隔膜組織降解明顯，花藥頂部凹陷處的花藥壁較?。▓D版Ⅱ ：11），發(fā)生斷裂，準(zhǔn)備散粉（圖版Ⅱ ：12）。

2.3 小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育

發(fā)育早期，花藥室表皮下的分生組織經(jīng)有絲分裂形成孢原細(xì)胞，藥室中央的孢原細(xì)胞分化為染色較淺的不育隔膜組織，靠外側(cè)的孢原細(xì)胞分化為染色較深、核質(zhì)比大的造孢細(xì)胞（圖版Ⅱ ：1，2），緊接著分裂形成了核質(zhì)比大、排列緊密的小孢子母細(xì)胞（圖版Ⅲ ：1）。小孢子母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂I的前期（圖版Ⅲ ：2，3）、中期（圖版Ⅲ ：4）、后期（圖版Ⅲ ：5）和減數(shù)分裂Ⅱ形成了處于同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的正四面體排列的4個(gè)子核（圖版Ⅲ ：6）。之后，4個(gè)子核間出現(xiàn)了明顯的子細(xì)胞壁，產(chǎn)生了3種排列方式的小孢子四分體，包括正四面體（圖版Ⅲ ：7）、左右對稱型（圖版Ⅲ ：8）和十字交叉型（圖版Ⅲ ：9）。接著，小孢子有的從四分體內(nèi)釋放出來（圖版Ⅲ ：10），有的仍然保持在四分體內(nèi)（圖版Ⅲ ：11），繼續(xù)通過有絲分裂形成了具有2-核的花粉?；蛩暮匣ǚ郏▓D版Ⅲ ：12）。因此，紫紋兜蘭的小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂的胞質(zhì)分裂方式為同時(shí)型（Johri et al.， 1992）。

3 討論與結(jié)論

雄蕊數(shù)目和花藥發(fā)育胚胎學(xué)特征，包括花藥室數(shù)目、花藥壁發(fā)育類型、小孢子發(fā)生的胞質(zhì)分裂方式、小孢子四分體排列形式以及散粉單元方式等，在被子植物中，尤其是蘭科分類學(xué)中具有重要作用（Johri et al.， 1992; Dressler， 1993; 胡適宜，2005; Singer et al.， 2008； 李璐，2023）。現(xiàn)有研究表明，關(guān)于蘭科的花藥發(fā)育的研究資料，集中在具三雄蕊的擬蘭亞科和具單雄蕊的蘭亞科和樹蘭亞科，較少見于具雙雄蕊的杓蘭亞科，且具單雄蕊的香莢蘭亞科（Vanilloideae）的花藥發(fā)育研究幾乎為空白（李璐，2023）。據(jù)此，本研究觀察了紫紋兜蘭的花形態(tài)和花藥發(fā)育胚胎學(xué)特征，結(jié)合現(xiàn)有資料，比較分析了它們的分類學(xué)意義，具體如下。

3.1 新月形退化雄蕊和具條紋脈萼片的分類學(xué)意義

紫紋兜蘭具有紫色條紋脈的中萼片和新月形的退化雄蕊的花形態(tài)特征，明顯區(qū)別于大多數(shù)兜蘭屬物種，具有較高的物種識別度。值得注意的是，這兩個(gè)特征還見于紫紋兜蘭所在的單花斑葉組的其余5種以及同一亞屬的多花無耳組的3個(gè)種。前者包括紫紋兜蘭的3個(gè)近緣種 ［胼胝兜蘭（P. callosum）、髯毛兜蘭（P. barbartum）、勞氏兜蘭（P. lawrenceanum）］（Cox et al.， 1997; Chochai et al.， 2012; Tsai et al.， 2020）和國產(chǎn)的2個(gè)種 ［秀麗兜蘭（P. venustum）、彩云兜蘭（P. wardii）］（劉仲健等，2009）。后者包括國王兜蘭（P. rothschildianum）、皇后兜蘭（P. sanderianum）和菲律賓兜蘭（P. philippinense），它們都具有這兩個(gè)重要分類學(xué)意義的形態(tài)特征（Cribb， 1998）。這似乎意味著單花斑葉組和多花無耳組之間也許存在著一定親緣關(guān)系，值得進(jìn)一步研究。同時(shí)，考慮到退化雄蕊的形態(tài)結(jié)構(gòu)在兜蘭屬種間差異明顯（Cribb， 1998），其分類學(xué)意義值得重視。

3.2 紫紋兜蘭可育雄蕊花藥成熟時(shí)的花粉類型

紫紋兜蘭的花藥成熟開裂后，露出一團(tuán)表面光滑但有黏性的散粉單元（pollen dispersal unit），即花粉粒被黏性物質(zhì)粘連為一團(tuán)，形似樹蘭亞科的花粉團(tuán)（pollinium）。有研究認(rèn)為花粉單粒散生是兜蘭屬的分類學(xué)特征之一（Swamy， 1949; Poddubnaya-Arnoldi， 1960），杓蘭屬的花粉也被描述為2-細(xì)胞型單?；ǚ郏⊿ood & Rao， 1988）。不過，后來的研究進(jìn)一步證實(shí)了兜蘭屬（任玲和王伏雄，1987）和杓蘭屬（Kant， 2011）成熟的散粉單元均為黏性花粉粒，這些黏性物質(zhì)來自于絨氈層細(xì)胞降解后的脂類物質(zhì)，含有黃色的類胡蘿卜素，被稱為花粉鞘類物質(zhì)， 具有將整個(gè)花藥內(nèi)的花粉粘成一體，提高傳粉效率的特征（任玲和王伏雄，1987），這與其他4個(gè)亞科的散粉單元類型截然不同（Singer et al.， 2008）。本研究觀察到紫紋兜蘭成熟花藥內(nèi)的花粉細(xì)胞較為稀疏，既有單?；ǚ垡灿兴暮匣ǚ郏⒎侨缛f代蘭屬（Vanda Jones ex R. Br.）（張錦等，2019）和巾唇蘭屬（Pennilabium J. J. Sm.）（李璐等，2020）的花粉團(tuán)那樣排列緊密。這樣的“黏性花粉”在長瓣兜蘭（Paphiopedilum dianthum）（史軍等，2007）和綠花杓蘭（Cypripedium henryi）（Li et al.， 2008）的傳粉者身上清晰可辨，支持了前人的觀點(diǎn)（任玲和王伏雄，1987），為進(jìn)一步理解杓蘭亞科的傳粉生物學(xué)提供了形態(tài)學(xué)和胚胎學(xué)方面的數(shù)據(jù)。

3.3 蘭科花藥室數(shù)目和不育隔膜組織分化的重要性

現(xiàn)有資料表明，在蘭科花藥發(fā)育過程中，不育隔膜組織的分化和降解對于理解5個(gè)亞科不同散粉單元類型的形成非常重要（李璐，2023）。在具有單雄蕊的蘭亞科和樹蘭亞科的花藥發(fā)育過程中，早期花藥原基分化出的不育隔膜組織的數(shù)目、朝向和位置對于花粉小塊（massulae）和花粉團(tuán)（pollinium）的類型和數(shù)目至關(guān)重要（Freudenstein & Rasmussen， 1996， 1997; Freudenstein et al.， 2002; Kant & Goel， 2013）。這是因?yàn)椴挥裟そM織在后期會發(fā)生降解，把成熟花粉囊分割為大小不同（等大或不等大）、數(shù)目不等（2、4、8）和形態(tài)多樣（全緣、孔裂、淺裂、深裂）的散粉單元（Freudenstein & Rasmussen， 1996; Singer et al.， 2008; Kant & Hossain， 2010; Kant et al.， 2013; 張錦等，2019；李璐等，2020； 譚慶琴等，2020）。本研究觀察到紫紋兜蘭早期的花藥分化為一對側(cè)生藥室，每個(gè)藥室中央的孢原細(xì)胞分化出一條不育隔膜組織，形成一對靠邊的具淺凹的弧形小孢子囊。這一點(diǎn)在前人的研究中均未得到重視，忽略了花藥室數(shù)目和不育隔膜組織分化的關(guān)系，例如白唇杓蘭（C. cordigerum）和扇脈杓蘭（C. japonicum）被分別描述為4室花藥和4個(gè)小孢子囊（Sood & Rao， 1988; Ghimire et al.， 2020），為理解杓蘭亞科的花藥發(fā)育的分類學(xué)意義帶來了困惑。因此，花藥室的數(shù)目和不育隔膜組織分化之間的關(guān)系值得深入探討（Kant & Goel， 2013）。

3.4 紫紋兜蘭單子葉型花藥壁發(fā)育的分類學(xué)意義

紫紋兜蘭的花藥壁有4層，屬于單子葉型。這與杓蘭亞科現(xiàn)有的研究結(jié)果均不同，具有分類學(xué)價(jià)值。例如，同屬植物的南印兜蘭（Paphiopedilum druryi）（Swamy， 1949）和古德兜蘭（P. godefroyae）（任玲和王伏雄，1987）的花藥壁有5層，屬于基本型，而杓蘭屬的白唇杓蘭（Sood & Rao， 1988; Kant， 2011）和扇脈杓蘭（Ghimire et al.， 2020）有6～8層，為多層型花藥壁。在蘭科里，單子葉型花藥壁多見于蘭亞科，如斑葉蘭屬（Goodyera R. Br.）（Sood， 1988）、蜂蘭屬（Ophrys L.）（Aybeke， 2012）、玉鳳花屬（Habenaria Willd.）（Vij & Sharma， 1987; Sood， 1986）、角盤蘭屬（Herminium L.）（Sood & Rao， 1986）和鳥足蘭屬（Satyrium Sw.）（Rao & Sood， 1979）以及樹蘭亞科的巾唇蘭屬（李璐等，2020）等，而多層型花藥壁普遍出現(xiàn)在樹蘭亞科，包括萬代蘭屬（張錦等，2019）和竹葉蘭屬（Arundina Blume）（譚慶琴等，2020）等。此外，擬蘭亞科的成熟花藥壁也普遍具有4～5層，有的地方具有2層加厚的藥室內(nèi)壁，但關(guān)于其花藥壁類型的特征和分類學(xué)意義并未被提及（Kocyan & Endress， 2001; Singer et al.， 2008）。因此，本研究認(rèn)為花藥壁的層數(shù)和類型在蘭科植物的花藥發(fā)育中非常多樣，這在其他被子植物里不常見，值得重視。

被子植物的絨氈層細(xì)胞核通常為單核，但部分物種也有雙核且在屬內(nèi)較為穩(wěn)定，具有一定的分類學(xué)意義（Johri et al.， 1992）。紫紋兜蘭花藥壁絨氈層和不育隔膜組織的內(nèi)絨氈層均具雙核現(xiàn)象，這與南印兜蘭（Swamy， 1949）和古德兜蘭（任玲和王伏雄，1987）的觀察結(jié)果一致，但與杓蘭屬白唇杓蘭（Sood & Rao， 1988; Kant， 2011）和扇脈杓蘭（Ghimire et al.， 2020）具單核絨氈層的結(jié)果不同。這說明絨氈層細(xì)胞核的數(shù)目或許可以作為兜蘭屬和杓蘭屬界限劃分的依據(jù)之一。有意思的是，Swamy（1949）曾經(jīng)系統(tǒng)地觀察了蘭科16屬28種植物配子體發(fā)育的胚胎學(xué)特征，其中，南印兜蘭具有雙核絨氈層，明顯區(qū)別于其他單雄蕊類的蘭科植物，因此雙核絨氈層被認(rèn)為是杓蘭亞科的鑒別特征之一。不過，后來Sood（1988）也發(fā)現(xiàn)了蘭亞科的斑葉蘭（Goodye rarepens）也存在雙核絨氈層的現(xiàn)象，并提出該特征并非具雙雄蕊蘭的杓蘭亞科所特有。這在后人的研究結(jié)果里也得到證實(shí)?，F(xiàn)有蘭科花藥發(fā)育資料表明，單核絨氈層較為普遍，見于擬蘭亞科、蘭亞科和樹蘭亞科等大部分類群（Vij & Sharma， 1987; Singer et al.， 2008; 張錦等，2019），而雙核絨氈層相對少見，出現(xiàn)在杓蘭亞科的兜蘭屬以及蘭亞科和樹蘭亞科的一些物種，如火燒蘭屬（Epipactis Zinn）植物（Sood， 1997; Bhanwra et al.， 2006a）、紋瓣蘭（Cymbidium pendulum）、蓋喉蘭（Smitinandia micrantha）（Bhanwra et al.， 2006b）和紫花苞舌蘭（Spathoglottis plicata）（Sriyot et al.， 2015）等。此外，在綬草（Spiranthes sinensis）的花藥發(fā)育過程中，絨氈層細(xì)胞在分化早期為單核，成熟時(shí)變?yōu)殡p核（Sood， 1989），這在紫紋兜蘭的花藥發(fā)育過程中未曾注意到。因此，還需要觀察發(fā)育完整的花藥壁結(jié)構(gòu)的細(xì)胞特征來確定絨氈層細(xì)胞核數(shù)目（Johri et al.， 1992）。

3.5 紫紋兜蘭的小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育的分類學(xué)意義

紫紋兜蘭的小孢子母細(xì)胞經(jīng)同時(shí)型胞質(zhì)分裂方式形成小孢子四分體，通過有絲分裂形成了2-細(xì)胞型花粉，兼具單粒花粉和四合花粉共存的現(xiàn)象，這與杓蘭亞科現(xiàn)有研究資料基本一致（Poddubnaya-Arnoldi， 1960; Sood & Rao， 1988; Brown & Lemmon， 1996; Kant， 2011; Ghimire et al.， 2020），可作為該亞科區(qū)別于其他亞科的胚胎學(xué)特征。雖然最早的研究表明杓蘭屬為連續(xù)型胞質(zhì)分裂（Guignard， 1882），但并未得到后續(xù)研究資料的支持。在蘭科花藥發(fā)育過程中，同時(shí)型胞質(zhì)分裂較為普遍，而連續(xù)型胞質(zhì)分裂相對較少，后者見于萬代蘭屬（張錦等，2019）、蜂蘭屬（Aybeke， 2012）和苞舌蘭屬（Spathoglottis Blume）（Sriyot et al.， 2015）。因此，小孢子發(fā)生的胞質(zhì)分裂方式在蘭科分類系統(tǒng)中的演化趨勢也值得重點(diǎn)關(guān)注（Furness & Rudall， 1999; Furness et al.， 2002）。

紫紋兜蘭的小孢子四分體排列方式多樣，包括正四面體、左右對稱型和十字交叉型，為理解小孢子四分體排列方式的分類學(xué)意義提供了新資料。已有研究表明，蘭科的小孢子四分體排列方式多樣，多達(dá)５種，包括正四面體、左右對稱型、十字交叉型、“Ｔ”型和線型（胡適宜，1982；Johri et al.， 1992）。其中，正四面體最常見，左右對稱型次之，而其余幾種排列方式是現(xiàn)有蘭科花藥發(fā)育中比較少見的。值得注意的是，小孢子四分體的排列方式與散粉單元內(nèi)部的四合花粉的排列方式基本保持一致。這在蘭亞科的花粉小塊（Kant et al.， 2013）和樹蘭亞科的堅(jiān)固花粉團(tuán)（張錦等，2019； 譚慶琴等，2020； 李璐等，2020）等的花藥發(fā)育過程中均得到了證實(shí)，對于理解蘭科的成熟花粉形態(tài)具有重要意義。

3.6 結(jié)論

綜上所述，本研究提出以下觀點(diǎn)，僅供參考。（1）紫紋兜蘭帶縱條紋的背萼片和新月形退化雄蕊特征在兜蘭屬較為少見，可以作為兜蘭亞屬單花斑葉組和多花無耳組聯(lián)系的紐帶，其親緣關(guān)系值得繼續(xù)探究。（2）紫紋兜蘭在花蕾期和開放花時(shí)的合蕊柱結(jié)構(gòu)差異說明花器官發(fā)生過程中，可育雄蕊和退化雄蕊以及雌蕊柱頭的形態(tài)建成發(fā)生在花發(fā)育后期，即花蕾期，并且三者之間的生長速度存在明顯分化，可育雄蕊的花藥發(fā)育早于退化雄蕊和柱頭。（3）紫紋兜蘭的花藥具有一對側(cè)生花藥室和不育隔膜組織的分化，與同屬植物記錄的各有4室花藥和4個(gè)小孢子囊的結(jié)果均不同，值得關(guān)注。（4）絨氈層細(xì)胞核數(shù)目或許可用于兜蘭屬和杓蘭屬間界限劃分的依據(jù)之一，前者為雙核，后者為單核。（5）紫紋兜蘭花藥發(fā)育的胚胎學(xué)特征與相關(guān)蘭科類群存在明顯異同，具有一定的分類學(xué)意義，包括花藥室的數(shù)目、花藥壁的發(fā)育類型、絨氈層的細(xì)胞核數(shù)目、胞質(zhì)分裂類型、小孢子四分體的排列形式等。（6）現(xiàn)有資料表明花形態(tài)和花藥發(fā)育胚胎學(xué)特征在蘭科不同分類群間均有明顯差異（Aybeke， 2012; Sriyot et al.， 2015; 譚慶琴等，2020），但研究過的類群不足200種（作者初步統(tǒng)計(jì)）。因此，有必要選擇種以上的分類群（組、亞屬、屬、亞族、族、亞科）為代表開展研究，逐步積累資料，為解決有爭議的分類系統(tǒng)學(xué)問題提供花形態(tài)和胚胎學(xué)證據(jù)（Swamy， 1949; Kant， 2010; Kant & Goel， 2013; Valencia-Nieto et al.， 2016）。

致謝 ?云南豐春坊生物科技有限公司王曉云女士和徐志峰先生提供實(shí)驗(yàn)材料，西南林業(yè)大學(xué)云南生物多樣性研究院提供實(shí)驗(yàn)平臺，古旭老師提供實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，在此一并謹(jǐn)表謝意。

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（ 責(zé)任編輯 周翠鳴 ）

收稿日期： ??2023-09-01

基金項(xiàng)目： ??國家自然科學(xué)基金（32060049）; 云南省人社廳基層專家工作站。

第一作者： ?朱永（1997-），碩士研究生，主要從事資源利用與植物保護(hù)研究，（E-mail）822512121@[KG-0.5mm]qq.com。

* 通信作者： ??李璐，博士，副研究員，研究方向?yàn)橹参锵到y(tǒng)與進(jìn)化、植物形態(tài)解剖學(xué)，（E-mail）lilusaraca@foxmail.com， lilu@swfu.edu.cn。