納米氧化鈰在阿霉素誘導(dǎo)心臟毒性中的作用及其對(duì)P53基因表達(dá)的影響

李俊奇 韓軒茂 藺雪峰 袁敏

[摘要]?目的?研究納米氧化鈰在阿霉素心臟毒性損傷中的作用及其對(duì)P53基因表達(dá)的影響，探討納米氧化鈰對(duì)阿霉素心臟毒性損傷的作用機(jī)制。方法?培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞，隨機(jī)分為5組：對(duì)照組、模型組（1μmol/L阿霉素）、納米氧化鈰組（10μg/ml納米氧化鈰）、實(shí)驗(yàn)組（1μmol/L阿霉素+10μg/ml納米氧化鈰）、陽(yáng)性對(duì)照組（1μmol/L阿霉素+10μmol/L右丙亞胺）。建立阿霉素心臟毒性損傷模型，CCK-8法檢測(cè)心肌細(xì)胞的存活率；生化法檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶（lactic?dehydrogenase，LDH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量；流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive?oxygen，ROS）水平及細(xì)胞凋亡率；Western?blot檢測(cè)心肌細(xì)胞中Bax、Bcl-2及P53蛋白的表達(dá)。結(jié)果?與對(duì)照組相比，模型組的細(xì)胞存活率下降，細(xì)胞LDH、MDA含量上升，細(xì)胞內(nèi)ROS水平和凋亡率增加，Bax和P53蛋白表達(dá)量升高，Bcl-2蛋白表達(dá)量下降，且Bcl-2/Bax比值下降（均P<0.001）；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率上升，細(xì)胞LDH、MDA含量下降，細(xì)胞ROS含量和凋亡率下降，Bax和P53蛋白表達(dá)量降低，Bcl-2蛋白表達(dá)量升高，且Bcl-2/Bax比值升高（均P<0.001）。結(jié)論?納米氧化鈰能有效預(yù)防阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性損傷，其作用可能與下調(diào)P53基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]?納米氧化鈰；阿霉素；心臟毒性；P53基因；細(xì)胞凋亡

[中圖分類號(hào)]?R541.9????[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]?A ????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.05.015

Role?of?cerium?oxide?nanoparticles?in?doxorubicin-induced?cardiotoxicity?and?its?effect?on?P53?gene?expression

LI?Junqi1，2，?HAN?Xuanmao2，?LIN?Xuefeng2，?YUAN?Min1，2

1.Baotou?Medical?College，?School?of?Graduate?Studies，?Baotou?014000，?Inner?Mongolia，?China;?2.the?First?Department?of?Cardiology，?the?First?Affiliated?Hospital?of?Baotou?Medical?College，?Inner?Mongolia?University?of?Science?and?Technology，?Baotou?014000，?Inner?Mongolia，?China

[Abstract]?Objective?To?study?the?effect?of?nano-ceria?on?doxorubicin-induced?cardiotoxic?injury?and?its?effect?on?P53?gene?expression，?and?to?explore?the?mechanism?of?nano-ceria?on?doxorubicin-induced?cardiotoxic?injury.?Methods?H9C2?myocardial?cells?were?cultured?and?randomly?divided?into?five?groups：?control?group，?model?group?（1μmol/L?adriamycin），?nano-cerium?oxide?group?（10μg/ml?nano-cerium?oxide），?experimental?group?（1μmol/L?adriamycin?+10μg/ml?nano-cerium?oxide），?and?positive?control?group?（1μmol/L?adriamycin+10μmol/L?dexperimine）.?The?adriamycin?induced?cardiotoxicity?model?was?established，?and?the?viability?of?myocardial?cells?was?measured?by?CCK-8?method.?The?contents?of?lactate?dehydrogenase?（LDH）?and?malondialdehyde?（MDA）?in?myocardial?cells?were?detected?by?biochemical?method.?The?levels?of?reactive?oxygen?（ROS）?and?the?apoptosis?rate?in?myocardial?cells?were?detected?by?flow?cytometry.?The?expressions?of?Bax，?Bcl-2?and?P53?proteins?in?myocardial?cells?were?detected?by?Western?blot.?Results?Compared?with?the?control?group，?the?cell?viability?was?decreased?in?the?model?group，?the?cell?LDH?and?MDA?contents?were?increased，?the?intracellular?ROS?level?and?apoptosis?rate?were?increased，?the?expressions?of?Bax?and?P53?proteins?were?increased，?and?the?expression?of?Bcl-2?protein?was?decreased，?and?the?ratio?of?Bcl-2/Bax?was?decreased?（all?P<0.001）.?Compared?with?the?model?group，?the?experimental?group?showed?increased?cell?viability，?decreased?cell?LDH?and?MDA?contents，?decreased?cell?ROS?content?and?apoptosis?rate，?decreased?Bax?and?P53?protein?expressions，?and?increased?Bcl-2?protein?expression，?and?the?Bcl-2/Bax?ratio?was?increased?（all?P<0.001）.?Conclusion?Ceria?nanoparticles?can?effectively?prevent?adriamycin-induced?cardiotoxic?injury，?and?its?effect?may?be?related?to?the?down-regulation?of?P53?gene?to?inhibit?cardiomyocyte?apoptosis.

[Key?words]?Cerium?oxide?nanoparticles;?Anthracyclines;?Cardiotoxicity;?P53?gene;?Apoptosis

蒽環(huán)類藥物是一類抗腫瘤藥物，包括阿霉素（doxorubicin，DOX）、表阿霉素和柔紅霉素等，因不可替代的療效，是目前腫瘤藥物化療中最有效和最廣泛的藥物[1-2]。然而，蒽環(huán)類藥物被證明存在不可忽視的劑量依賴性心臟毒性，會(huì)導(dǎo)致不同程度的心肌收縮功能障礙，進(jìn)一步發(fā)展為心肌病，最終導(dǎo)致心力衰竭，使蒽環(huán)類藥物的臨床應(yīng)用受到嚴(yán)重限制[3-4]。細(xì)胞凋亡是蒽環(huán)類藥物心臟毒性的重要機(jī)制之一，P53基因在調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[5-7]。

最近，納米材料和稀有金屬在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，且開(kāi)發(fā)更加安全有效地預(yù)防保護(hù)蒽環(huán)類藥物心臟毒性的藥物已成為目前的研究熱點(diǎn)[8-9]。納米氧化鈰（cerium?oxide?nanoparticles，CeO2NPs）是一種稀有金屬氧化物顆粒，既具有稀有金屬的特性又具備納米材料的優(yōu)勢(shì)，研究發(fā)現(xiàn)，納米氧化鈰具有自主價(jià)態(tài)轉(zhuǎn)換能力和酶模仿活性等特點(diǎn)，可緩解心肌缺血再灌注損傷導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡[10-12]。本研究通過(guò)建立蒽環(huán)類藥物心臟毒性損傷模型，證明納米氧化鈰在阿霉素心臟毒性中的作用，并通過(guò)觀察P53基因的表達(dá)，探討納米氧化鈰對(duì)阿霉素心臟毒性的作用機(jī)制。

1??材料與方法

1.1??細(xì)胞

H9C2大鼠心肌細(xì)胞株購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司，批號(hào)CL-0089，培養(yǎng)于內(nèi)蒙古包頭醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，溫度37℃，氧氣濃度21%，二氧化碳濃度5%。

1.2??藥物與試劑

氧化鈰（<25nm，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；鹽酸阿霉素、右丙亞胺（dextrazoxane，Dex）鹽酸鹽（上海源葉生物公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；CCK-8檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物公司）；ROS檢測(cè)試劑盒（上海翊圣生物公司）；乳酸脫氫酶（lactic?dehydrogenase，LDH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物公司）；抗-GAPDH、山羊抗兔IgG（北京博奧森生物公司）；Bax多克隆抗體、Bcl-2兔多克隆抗體（美國(guó)Signalway?Antibody公司）；p53抗體（美國(guó)AffinitY公司）。

1.3??儀器與設(shè)備

細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱（日本松下公司）；倒置光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；L530R型離心機(jī)（湖南湘儀儀器公司）；KQ2200DE型數(shù)控超聲波清洗器（中國(guó)昆山公司）；ELx-808型酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)安捷倫科技公司）；JYD-650型超聲波細(xì)胞破碎儀（上海之信儀器公司）；DYY-7C型電泳儀電源（北京六一儀器廠）；DYCZ-24DN型迷你電泳槽（北京六一儀器廠）；JY-ZY5型濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)印系統(tǒng)槽（北京君意東方電泳設(shè)備公司）；M1703940型半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)槽（美國(guó)伯樂(lè)Bio-Rad公司）；TVO.63XC-MO型成像系統(tǒng)（廣州市明美科技公司）。

1.4??造模與干預(yù)

正常培養(yǎng)細(xì)胞，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H9C2心肌細(xì)胞隨機(jī)分成5組：（1）正常對(duì)照組：用含正常培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；（2）模型組：用含1μmol/L阿霉素的培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)箱中處理細(xì)胞24h；（3）納米氧化鈰組：用含10μg/ml納米氧化鈰的培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)箱中處理細(xì)胞24h；（4）實(shí)驗(yàn)組：用含1μmol/L阿霉素和10μg/ml納米氧化鈰的混合培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)箱中共同處理細(xì)胞24h；（5）陽(yáng)性對(duì)照組：用含10μmol/L右丙亞胺和1μmol/L阿霉素的混合培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)箱中共同處理細(xì)胞24h。

1.5??CCK-8法檢測(cè)

H9C2細(xì)胞在96孔板中按照實(shí)驗(yàn)分組藥物處理24h，除去孔內(nèi)舊培養(yǎng)基，向每孔加入含有100μl培養(yǎng)基和10μl?CCK-8繼續(xù)孵育4h，孵育結(jié)束后置于酶標(biāo)儀450nm處檢測(cè)吸光度（A值）。

1.6??LDH活性檢測(cè)

H9C2細(xì)胞以1×105?cell/mL的密度接種到6孔板中，按照實(shí)驗(yàn)分組藥物處理24h，收集細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清，加入提取液后重懸細(xì)胞沉淀，冰上超聲波破碎細(xì)胞（功率200W，超聲3s間隔10s，重復(fù)3次）；8000g?4℃低溫離心機(jī)離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至450nm下測(cè)定A值。

1.7??MDA含量檢測(cè)

H9C2細(xì)胞以1×105?cell/mL密度接種到6孔板中，按照實(shí)驗(yàn)分組藥物處理24h，使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，12?000g離心10min，取上清加入200μL?MDA檢測(cè)工作液，混勻后100℃水浴加熱15min。水浴后冷卻至室溫，1000g室溫離心10min，取200μL上清加入到96孔板中，酶標(biāo)儀預(yù)熱30min后在酶標(biāo)儀532nm處測(cè)定吸光度（A值）。

1.8??活性氧（reactive?oxygen，ROS）測(cè)定

H9C2細(xì)胞以1×105?cell/ml密度接種到6孔板中，按照實(shí)驗(yàn)分組藥物處理24h，棄去舊培養(yǎng)基，用不含血清及雙抗的純細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌1次，每孔加入的20μmol/L?DCFH-DA?1ml，37?℃下孵育20min，中間每隔5min晃勻1次，使探針充分與細(xì)胞接觸。PBS洗滌3次去除多余的DCFH-DA探針，最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)在488nm激發(fā)波長(zhǎng)和535nm發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光信號(hào)強(qiáng)度。

1.9??細(xì)胞凋亡檢測(cè)

H9C2細(xì)胞以1×105?cell/ml密度接種到6孔板中，按照實(shí)驗(yàn)分組藥物處理24h，除去舊培養(yǎng)基，使用不含EDTA?的胰酶消化細(xì)胞1.5min，加入完全培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞吹打下來(lái)，轉(zhuǎn)移至EP離心管內(nèi)，800g離心5min收集細(xì)胞沉淀。加入PBS溶液中繼續(xù)吹打洗滌2次，同樣條件下離心收集細(xì)胞沉淀。于細(xì)胞沉淀中加入1×緩沖液工作液，吹打重懸細(xì)胞沉淀，使細(xì)胞濃度達(dá)到1×106?cell/mL。吸取100μl至新的EP離心管中，加入5μl?Annexin?V-FITC和10μl?PI，輕輕混勻后室溫避光孵育20min后，管內(nèi)加入400μl?1×緩沖液工作液，震蕩混勻使用流式細(xì)胞儀盡快檢測(cè)。

1.10??Western?blot法檢測(cè)

將實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞經(jīng)裂解液裂解后，冰浴靜置20min，混勻后4℃，12000r/min離15min后取上清液，BCA法進(jìn)行蛋白定量。上樣緩沖液與適當(dāng)?shù)鞍讋驖{混勻后，置于沸水中加熱10min后冷卻至室溫，以凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)膜，TBST洗膜5min，5%脫脂奶粉，4℃過(guò)夜。加入稀釋的相應(yīng)一抗（P53、Bcl-2、Bax抗體均按照1∶1000比例稀釋，GAPDH?1∶2000），搖床孵育2h，TBST洗膜3次，每次5min。加入二抗（1∶1000）配制進(jìn)行37℃搖床孵育1h，TBST洗膜3次，每次5min，結(jié)束后顯色，測(cè)量條帶灰度值，并以目標(biāo)條帶與內(nèi)參條帶灰度的比值反映目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況。

1.11??統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS?22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，單因素方差分析（ANOVA）分析組間差異，采用GraphPad?Prism?7.0進(jìn)行分析與制圖，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2??結(jié)果

2.1??納米氧化鈰對(duì)阿霉素心臟毒性損傷細(xì)胞活力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞存活率下降；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率上升差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)表1。

2.2??納米氧化鈰對(duì)阿霉素心臟毒性損傷細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的水平

與正常對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞LDH、MDA含量上升（P<0.001）；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞LDH、MDA含量下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見(jiàn)圖1。

2.3??納米氧化鈰對(duì)阿霉素心臟毒性損傷細(xì)胞Bax、Bcl-2、P53蛋白表達(dá)的影響

Western?blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組Bax、P53蛋白表達(dá)量升高，Bcl-2蛋白表達(dá)量下降，且Bcl-2/Bax比值下降（均P<0.001）；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組Bax、P53蛋白表達(dá)量降低，Bcl-2蛋白表達(dá)量升高且Bcl-2/Bax比值升高（均P<0.001），見(jiàn)圖2、圖3。

2.4??納米氧化鈰對(duì)阿霉素心臟毒性損傷細(xì)胞凋亡的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組活細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞凋亡比重明顯升高；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組活細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞凋比重下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.001），見(jiàn)圖4。

2.5??納米氧化鈰對(duì)阿霉素心臟毒性損傷細(xì)胞ROS水平的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組的細(xì)胞ROS水平升高（P<0.001），與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組的ROS水平下降（P<0.001），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5）。

3??討論

阿霉素誘導(dǎo)心臟毒性最常見(jiàn)的機(jī)制之一是氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，即阿霉素引起心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激后，會(huì)產(chǎn)生ROS、MDA、LDH等氧化應(yīng)激產(chǎn)物[5]。由于心肌細(xì)胞的不可再生性，一旦這些氧化應(yīng)激產(chǎn)物超過(guò)正常水平，就會(huì)對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生損傷，進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[13-14]。本研究經(jīng)阿霉素處理后的心肌細(xì)胞活力降低、LDH和MDA含量增加、ROS水平升高。證明氧化應(yīng)激參與了阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性。

目前納米氧化鈰已成為各領(lǐng)域廣泛關(guān)注的新興材料，在納米氧化鈰的分子結(jié)構(gòu)中，鈰離子通常以穩(wěn)定的Ce4+價(jià)形式存在，在正常條件下形成立方晶格結(jié)構(gòu)（螢石型），晶格中的氧不穩(wěn)定易脫落，形成氧空缺[15-17]。為了維持晶格結(jié)構(gòu)中電荷平衡，會(huì)有一部分的Ce4+轉(zhuǎn)化為Ce3+，然而Ce3+在有氧條件下具有還原性，會(huì)在氧氣中又被氧化成Ce4+，這一循環(huán)正是納米氧化鈰具有抗氧化能力的原因[18]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，單加納米氧化鈰組的細(xì)胞活力、LDH和MDA含量、細(xì)胞內(nèi)ROS水平均無(wú)明顯差異（P>0.05），證明納米氧化鈰在此濃度下無(wú)毒性；阿霉素與納米氧化鈰共處理組細(xì)胞活力上升、LDH和MDA含量下降、ROS水平降低。證明納米氧化鈰能夠降低阿霉素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而減輕蒽環(huán)類藥物的心臟毒性。

P53基因通過(guò)Bax/Bcl-2，F(xiàn)as/Apol，IGF-BP-3等蛋白，可發(fā)揮對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用[19-21]。Bcl-2?可阻止凋亡形成因子如細(xì)胞色素C等從線粒體釋放出來(lái)，具有抗凋亡作用；而B(niǎo)ax可與線粒體上的電壓依賴性離子通道相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放，具有凋亡作用，P53可以上調(diào)Bax的表達(dá)水平，以及下調(diào)Bcl-2的表達(dá)共同完成促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用[22-23]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，阿霉素組的Bax、P53表達(dá)量增加，Bcl-2蛋白表達(dá)量降低，Bcl-2/Bax蛋白比值減小，流式檢測(cè)凋亡比重升高；證明阿霉素使心肌細(xì)胞發(fā)生了凋亡。阿霉素與納米氧化鈰共處理組的Bax、P53表達(dá)量下降，Bcl-2蛋白表達(dá)量上升，Bcl-2/Bax蛋白比值增大，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡比重降低。由此證明，納米氧化鈰可能通過(guò)下調(diào)P53、Bax以及上調(diào)Bcl-2，抑制蒽環(huán)類誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，納米氧化鈰可減輕阿霉素引起的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，抑制蒽環(huán)類藥物的心臟毒性；本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，納米氧化鈰能夠下調(diào)P53的表達(dá)，抑制阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，因此，納米氧化鈰對(duì)蒽環(huán)類藥物心臟毒性的保護(hù)作用可能與P53的表達(dá)有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2023–04–09）

（修回日期：2023–11–16）