默露芬芳：精子細胞轉(zhuǎn)變?yōu)樾◎蝌綍r有位低調(diào)的守護者

本篇報道圍繞2022年上海市自然科學(xué)獎一等獎項目“RNA調(diào)控在精子發(fā)生及男性不育中的新功能機制研究”展開，該獎項由中國科學(xué)院分子細胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心劉默芳研究員領(lǐng)銜獲得。

2006年，劉默芳結(jié)束在美國約翰霍普金斯醫(yī)學(xué)院的研究生涯，回到中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所王恩多課題組擔(dān)任副組長。劉默芳已經(jīng)和RNA打了很多年的交道，此刻的她十分渴望能獨自在RNA領(lǐng)域開拓出一片嶄新的天地。

正好在那一年，RNA領(lǐng)域出現(xiàn)了一個重要的新突破。

包括華人科學(xué)家林海帆在內(nèi)的多個研究團隊，分別在小鼠、果蠅等多種模式生物的生殖細胞中發(fā)現(xiàn)了一類全新的小RNA分子。由于這類新型小RNA分子在果蠅生殖細胞中與Piwi蛋白結(jié)合在一起發(fā)揮功能，因此研究者們將其命名為Piwi相互作用的RNA（Piwi-interacting RNA），簡稱piRNA。

piRNA在生物體內(nèi)可以算得上是非常“低調(diào)”的一類分子了。首先，piRNA集中存在于生殖細胞，在其他絕大多數(shù)的體細胞中基本上都不表達；其次，即使是在生殖細胞中，piRNA也并不會進一步合成蛋白質(zhì)分子，僅僅是以RNA分子的形式默默存在著。

但與此同時，piRNA卻有著很強的多樣性，以小鼠的生殖細胞為例，人們就發(fā)現(xiàn)了超過一百多萬種具有不同序列的piRNA。

那么問題來了，為什么在生殖細胞中會表達種類如此繁多的piRNA？piRNA究竟具有怎樣的生物學(xué)功能呢？

最初的幾項研究紛紛發(fā)現(xiàn)，許多piRNA序列都能匹配到一類名為轉(zhuǎn)座子的DNA元件，進而抑制這些轉(zhuǎn)座子序列的表達。

轉(zhuǎn)座子是一大類能在基因組不同序列之間“跳躍”的分子，轉(zhuǎn)座子的跳躍有一定的概率會導(dǎo)致基因突變，因此從長遠來看是推動生物演化的重要動力之一。但對于生物個體來說，過于活躍的轉(zhuǎn)座子并非好事，由此導(dǎo)致的基因突變會增加癌癥等疾病的風(fēng)險。此前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細胞演化出了專門將轉(zhuǎn)座子活性管控在一定頻率以下的分子機制。

當(dāng)具體到以精子細胞為例的生殖細胞中，由于肩負著將遺傳信息完整、精確傳遞到下一代的重要使命，研究者推測，在這里對于轉(zhuǎn)座子活性的“管控”也會比其他細胞類型更加嚴格。

而piRNA的橫空出世，完美地印證了這一推測：piRNA就好像是一道專門為生殖細胞額外添加的“安檢門”，保證轉(zhuǎn)座子的活性在生殖細胞中被抑制在一個更低的水平。

但劉默芳卻留意到，并非所有piRNA分子都能匹配到轉(zhuǎn)座子序列。

那這些匹配不到轉(zhuǎn)座子序列的“例外”piRNA分子是否還具有未知的生物學(xué)功能呢？此外，科學(xué)家們在實驗室里對小鼠、果蠅等模式動物進行基因敲除操作，破壞piRNA生成或功能，都會導(dǎo)致模式動物不能繁育后代。那如果我們?nèi)说膒iRNA生成或功能出現(xiàn)故障，會導(dǎo)致怎樣的后果呢？

劉默芳決定將這些問題作為自己團隊的主要研究方向。

轉(zhuǎn)座子之外的靶點

2010年，一個法國研究團隊發(fā)現(xiàn)piRNA在果蠅胚胎發(fā)育的過程中參與對編碼發(fā)育因子Nanos的信使RNA的降解，破壞piRNA的結(jié)合蛋白Aub會導(dǎo)致Nanos信使RNA清除不及時，進而引起胚胎頭部的發(fā)育出現(xiàn)缺陷。

這一發(fā)現(xiàn)首次表明，除了轉(zhuǎn)座子序列之外，能夠編碼蛋白質(zhì)的信使RNA也可以成為piRNA的靶點，并接受其調(diào)節(jié)。

果蠅中發(fā)現(xiàn)的這個案例進一步堅定了劉默芳在哺乳動物中系統(tǒng)地尋找piRNA新靶點和新功能的信心。

piRNA在小鼠精子形成過程中一個有趣的特殊性質(zhì)為劉默芳提供了突破口：原來，在精子細胞最終形成蝌蚪形狀成熟精子的過程中，存在著兩波piRNA的表達高峰，其中匹配不到轉(zhuǎn)座子序列的piRNA主要存在于第二波表達高峰。

因此，劉默芳團隊首先從小鼠的睪丸組織中分離出處于第二波piRNA表達高峰中的精子細胞，進而純化出包含piRNA的復(fù)合物。經(jīng)過深度測序，他們驚喜地發(fā)現(xiàn)，在分離出的復(fù)合物與piRNA配對的RNA分子中，雖然超過2/3都是匹配到轉(zhuǎn)座子序列的“經(jīng)典”piRNA，但是仍然存在約20%是能夠編碼蛋白質(zhì)的信使RNA。

接下來他們選擇出十對互相匹配的piRNA和信使RNA，對它們之間物理上的相互作用進行驗證，并通過功能學(xué)論證特異性piRNA的存在會促進對應(yīng)信使RNA的降解。

如何理解這個發(fā)現(xiàn)的意義呢？

原來，piRNA促進信使RNA的降解主要發(fā)生在精子細胞從圓形向長桿形轉(zhuǎn)化的過渡階段。對于最終成熟的精子來說，為了能保證足夠的運動能力，要盡可能地拋除可能會增加負重的材料。打個比方說，就像是神州飛船，在發(fā)射升空的過程中會將帶有多余重量的助推器逐一脫落，最終只剩下一個裝載著宇航員的“大鐵球”進入太空。而在形成精子的過程中，細胞從最初的圓形先轉(zhuǎn)變?yōu)殚L桿形最終變?yōu)轵蝌綘?，細胞中的大部分信使RNA都需要被清除干凈。

而劉默芳團隊的工作表明，piRNA在幫助精子細胞減輕負荷的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。換而言之，在精子形成的特定階段，piRNA還扮演著“清潔工”的光榮使命。

能者多勞的piRNA

劉默芳團隊前后選取了超過100對piRNA和信使RNA進行驗證，其中絕大部分的piRNA都會促進信使RNA的降解，進而引起所編碼蛋白質(zhì)水平的降低。

但其中卻出現(xiàn)了5對例外：研究者驚奇地發(fā)現(xiàn)，這些piRNA的表達并不影響對應(yīng)信使RNA的含量；而對于所編碼的蛋白質(zhì)，piRNA表達不僅不會引起蛋白水平的降低，反而會導(dǎo)致蛋白水平的升高！

這離奇的現(xiàn)象，究竟是源自實驗操作的失誤，還是背后隱藏著未知的全新生物學(xué)原理？

劉默芳團隊并沒有輕易放過這5對“例外現(xiàn)象”，通過對其進行深入挖掘，最終幸運地回答了精子發(fā)育領(lǐng)域的另一個重要問題。

“轉(zhuǎn)錄-翻譯解偶聯(lián)”現(xiàn)象是長期困擾精子發(fā)生領(lǐng)域研究者的一大謎團：精子細胞在發(fā)育的過程中，為了“瘦身”，首先要對攜帶著基因組信息的細胞核進行壓縮，而此操作卻終止了細胞核內(nèi)信使RNA的轉(zhuǎn)錄；為了保證生產(chǎn)出精子在后續(xù)發(fā)育過程中所需的蛋白質(zhì)，精子細胞會提前合成出所需的信使RNA，并將其儲存在一種名為“信使核糖核蛋白”（mRNP）的復(fù)合物中。mRNP就像是細胞臨時搭建的一個“倉庫”，保存在mRNP中的信使RNA處于“休眠”狀態(tài)，翻譯蛋白質(zhì)的活性很低。

當(dāng)精子發(fā)育推進到形狀由圓形向長桿形轉(zhuǎn)變時，保存在mRNP中的信使RNA會被有序釋放出來，進而快速翻譯產(chǎn)生精子發(fā)育后期所需要的蛋白質(zhì)。

精子形成過程中這一先轉(zhuǎn)錄合成信使RNA，然后不立即翻譯出蛋白，而是先保存在mRNP復(fù)合物中，等到時機成熟后再恢復(fù)翻譯活性的機制被稱作“轉(zhuǎn)錄-翻譯解偶聯(lián)”現(xiàn)象。

而劉默芳團隊注意到，在能意外上調(diào)蛋白水平的5條piRNA中，恰好就有2條是對于精子發(fā)育后期非常重要的。

由此他們推測，piRNA是否就是推動mRNP釋放信使RNA、重新激活蛋白翻譯的關(guān)鍵分子呢？

事實也的確如他們所料！特定的piRNA能通過結(jié)合信使RNA末端的一段特殊序列，招募一系列的翻譯調(diào)節(jié)因子，激活該信使RNA的翻譯。

而且他們還發(fā)現(xiàn)，這一新機制不局限于此前發(fā)現(xiàn)的5個piRNA，進一步蛋白組學(xué)的實驗結(jié)果表明，這種依賴于piRNA通路的翻譯激活機制能推廣到超過數(shù)百個不同蛋白。

這一發(fā)現(xiàn)進一步確立了piRNA在生殖細胞中“勞?！钡牡匚唬核鼈兪紫饶茉诰影l(fā)育全程抑制轉(zhuǎn)座子活性保證基因組的穩(wěn)定性；其次還能重新激活保存于mRNP中信使RNA的翻譯活性；最后在精子發(fā)育后期確保信使RNA的清除，使得最終成熟的精子能輕裝上陣，具有較強的運動能力。這些發(fā)現(xiàn)分別發(fā)表在《細胞研究》（2014年）和《細胞》（2019年）期刊上。

概括起來，劉默芳團隊的這一系列研究工作，發(fā)現(xiàn)了piRNA對于精子細胞中的信使RNA存在著雙重調(diào)控作用。

激活翻譯的好幫手

伴隨著piRNA對于“轉(zhuǎn)錄-翻譯解偶聯(lián)”現(xiàn)象功能的闡明，劉默芳團隊對mRNP復(fù)合物在精子發(fā)育不同階段的動態(tài)變化產(chǎn)生了強烈的興趣。

可精子細胞是如何知道，該在什么時候重新激活蛋白翻譯呢？

為了回答這個問題，劉默芳團隊從幼齡和成年小鼠睪丸中純化出處于高度活性狀態(tài)的核糖體復(fù)合物，利用蛋白組學(xué)手段鑒定出了12個在成年小鼠睪丸中富集的翻譯調(diào)控因子。其中，一個名為FXR1的蛋白格外引起了研究者們的興趣。

伴隨著精子細胞形狀的改變，F(xiàn)XR1蛋白的表達量也逐漸升高。而且FXR1能結(jié)合上千種不同序列的信使RNA分子，促進相應(yīng)蛋白的翻譯。更有趣的是，F(xiàn)XR1的一個同源蛋白具有一種特殊的“相分離”性質(zhì)——隨著其濃度的升高，能在細胞中形成一類聚集在一起的特殊結(jié)構(gòu)。

那么FXR1是否也具有類似的相分離性質(zhì)呢？

體外的實驗表明，隨著濃度升高，F(xiàn)XR1的確可以形成相分離特有的結(jié)構(gòu)。同時，在生殖細胞中敲除FXR1，會導(dǎo)致雄性小鼠出現(xiàn)不育的表型。

劉默芳團隊由此做出一個大膽的猜想：在精子發(fā)育的過程中，F(xiàn)XR1蛋白水平的升高，可能會通過相分離的機制將分散存在的mRNP復(fù)合物聚攏在一起，從而解除mRNP復(fù)合物對于翻譯活動的抑制，推動精子發(fā)育進入下一個階段。

劉默芳（左三）與學(xué)生在實驗室

為了驗證這個猜想，他們設(shè)計了一個精彩的實驗：通過突變篩選，研究者鑒定出了一個FXR1突變體。這個突變體與原版的FXR1相比只在一個關(guān)鍵位點的氨基酸存在差異，結(jié)合RNA分子的能力不變，但卻失去了發(fā)生相分離的能力。當(dāng)小鼠精子細胞中的FXR1蛋白被替換成突變體版本后，研究者驚喜地發(fā)現(xiàn)，mRNP復(fù)合物的翻譯激活能力顯著降低了。

看來，F(xiàn)XR1蛋白的確很可能是通過相分離的機制來調(diào)控精子細胞翻譯激活的。

這個發(fā)現(xiàn)開創(chuàng)性地闡釋了相分離在精子發(fā)育過程中的重要作用。劉默芳團隊于2021年5月25日把論文投稿到《科學(xué)》雜志。

但正是因為這一發(fā)現(xiàn)的意義重大，審稿人對于論證的細節(jié)提出了許多謹慎的質(zhì)疑。有趣的是，其中一位審稿人在審稿意見中寫道：“即使相分離模型今后被證明是錯誤的，這項工作的發(fā)現(xiàn)也是新穎而重要的。研究人員做了大量工作，如果是我的評論延后了該工作的發(fā)表，我表示道歉……”

歷經(jīng)十個月時間的精心修改之后，劉默芳團隊在2022年3月23日將添加了更多補充實驗的論文重新遞交到《科學(xué)》送審，最終在2022年的8月12日正式發(fā)表。

結(jié) 語

從2006年到現(xiàn)在，劉默芳團隊在piRNA領(lǐng)域精耕細作，不斷地深化人們對于精子細胞發(fā)育調(diào)控機制的理解。

與此同時，他們也關(guān)心著基礎(chǔ)研究給臨床實踐帶來的幫助，其中發(fā)表在《細胞》上的一項工作就是課題組與上海市計劃生育科學(xué)研究所合作成果。他們篩查了413例臨床無精、弱精癥患者，在3例病人中發(fā)現(xiàn)了Piwi基因存在突變。研究者通過敲入突變的小鼠模型論證病人攜帶的Piwi基因突變是導(dǎo)致不育的罪魁禍首，并揭示了此類突變的致病機理，且基于致病機理設(shè)計了干預(yù)策略，能夠一定程度上恢復(fù)突變小鼠精子的活力，為這類男性不育癥患者的治療提供了潛在的方法策略。這一工作首次證明了piRNA通路突變是男性不育的新病因。

繼這一奠基性研究之后，劉默芳團隊乘勝追擊，與湘雅生殖醫(yī)學(xué)中心合作，通過人類遺傳學(xué)方法在病人中篩選男性不育相關(guān)的piRNA通路的新型基因突變。研究發(fā)現(xiàn)，原來除了Piwi基因以外，piRNA通路的其他元件的突變也會導(dǎo)致精子發(fā)育的異常。piRNA加工酶PNLDC1就是一個典型代表。此前國際上的同行已經(jīng)利用小鼠模型論證PNLDC1的異常會導(dǎo)致雄性不育，并在2021年也采用和劉默芳類似的人類遺傳學(xué)思路，從不育患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了多個導(dǎo)致PNLDC1功能缺失的突變。劉默芳團隊的發(fā)現(xiàn)與同行互相呼應(yīng)，并且還在PNLDC1蛋白的活性位點上鑒定出了患者突變，進一步豐富了人們對于piRNA通路與精子發(fā)育關(guān)聯(lián)的認識。

近期，他們又從男性不育癥患者中鑒定到一個新的Piwi基因突變，該突變引起piRNA變短，從而導(dǎo)致piRNA消極怠工，不能很好地激活翻譯、生產(chǎn)精子發(fā)育必需的蛋白質(zhì)，從而影響了男性生育力。

這些工作為將來不育患者的篩查、治療提供了堅實的理論基礎(chǔ)。

piRNA通路，這一精子發(fā)育過程中的低調(diào)守護者，背后究竟還隱藏著多少未知的驚喜？

讓我們拭目以待。

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本文作者黃宇翔是密歇根大學(xué)在讀博士研究生，主要研究“細胞自噬的調(diào)控機制”，科普作品主要圍繞生命科學(xué)及相關(guān)學(xué)科方向