諾獎得主阿諾德的新方向：培育優(yōu)化酶

編譯/舒愉棉

弗朗西斯 · 阿諾德（Frances Arnold）因開創(chuàng)性的酶定向演化技術(shù)而獲得2018年諾貝爾化學(xué)獎，該技術(shù)使酶能被應(yīng)用于橫跨醫(yī)藥、消費(fèi)品、農(nóng)業(yè)、燃料和化學(xué)品生產(chǎn)的可持續(xù)化學(xué)領(lǐng)域。阿諾德現(xiàn)任加州理工學(xué)院化學(xué)工程、生物工程和生物化學(xué)專業(yè)的萊納斯 · 鮑林教授[加州理工學(xué)院為紀(jì)念著名科學(xué)家萊納斯 · 鮑林（Linus Pauling）而命名的教授職位]。2021年，現(xiàn)任美國總統(tǒng)拜登任命她為總統(tǒng)科學(xué)技術(shù)顧問委員會（PCAST）聯(lián)合主席。阿諾德曾被美國前總統(tǒng)奧巴馬授予美國國家技術(shù)與創(chuàng)新獎?wù)?。?023年國際卓越研究論壇上，她圍繞用于工程改造酶從而賦予其新功能的演化工藝做學(xué)術(shù)報告。在本次采訪中，她與《美國科學(xué)家》（American Scientist ）雜志主編費(fèi)內(nèi)拉 · 桑德斯（Fenella Saunder）探討她最新的研究成果。

弗朗西斯·阿諾德

如何為“定向演化”這一概念下定義？

20世紀(jì)80年代，當(dāng)我開始從事蛋白質(zhì)工程師這一工作時，沒人知道獲得優(yōu)化蛋白質(zhì)的規(guī)則是什么——優(yōu)化意味著蛋白質(zhì)能夠執(zhí)行人類感興趣而非攜帶它的生物體感興趣的功能。沒人知道氨基酸序列與蛋白質(zhì)功能之間的映射關(guān)系，我們也不知道這在酶中是什么情況，更不知道哪些編碼能產(chǎn)生特定功能。如今我們知道了怎么解讀DNA，能對DNA測序；我們知道了怎么寫入DNA，能合成DNA；我們知道了怎么編輯DNA。但我們不知道如何組合DNA，而這個問題在演化中已經(jīng)被解決得非常非常好了。所以為了克服我們對DNA序列和編碼在酶中的作用幾近一無所知，我決定采用已經(jīng)被證明非常有用的自然進(jìn)程——演化。我所做的，就是主導(dǎo)酶的演化。

定向演化早在20世紀(jì)80年代就通過分子生物學(xué)的技術(shù)實(shí)現(xiàn)了。我將這三種技術(shù)湊到了一起：因易出錯從而能在基因中制造突變的PCR技術(shù)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，一種復(fù)制DNA的方法）、能將這些突變基因整合到微生物中并且能表達(dá)出突變蛋白質(zhì)的DNA重組技術(shù)以及能半高通量進(jìn)行篩選的技術(shù)。首臺能夠觀察96孔板的光譜儀問世于20世紀(jì)80年代末，因此我將這些零件拉扯到一起，開始篩選突變蛋白庫并尋找有益突變，再將這些反饋到迭代了的流程中，即酶的演化優(yōu)化。你猜怎么著？效果非常好。

自然選擇產(chǎn)生的并不總是最佳的適應(yīng)產(chǎn)物，而是那些剛好能承受選擇壓力的生物。這是否是定向演化能產(chǎn)生新功能的一部分原因呢？

誠然，要是沒有進(jìn)步的空間，演化也不會行得通，對吧？如果你已經(jīng)處于最佳狀態(tài)了，那么給予任何干預(yù)都不會起作用，這樣要走上坡路就很難。但是如果人為改變了適配標(biāo)準(zhǔn)，那么全景圖譜中其他部分峰值的相關(guān)適配度就被降低了，這就為進(jìn)一步優(yōu)化創(chuàng)造了空間。人為改變適配標(biāo)準(zhǔn)就是我們在讓酶演化從而去完成一些非自然任務(wù)（就是那些酶普遍不熱衷去完成的任務(wù)）時所做的事情，這至關(guān)重要。我們通常發(fā)現(xiàn)改進(jìn)酶的天然功能或自然環(huán)境很困難，但通過改造酶，讓它們?nèi)ネ瓿梢恍┳匀凰x予不同的任務(wù)時，事情就真的很簡單了。

在靶向突變區(qū)域時，您是否并非隨機(jī)引入突變，而是融合了您對蛋白質(zhì)和生物酶的博學(xué)廣識呢？

人們以為自己掌握了規(guī)則（或者至少是一部分規(guī)則），所以常常傾向這樣去做。但這不就把驚喜給排除在外了嗎？所以，當(dāng)我們嘗試要改變底物特異性時，我們確實(shí)常常會靶向生物酶的活性位點(diǎn)。但我們也注意到，當(dāng)進(jìn)行隨機(jī)突變時，我們會發(fā)現(xiàn)其他額外的有益突變，這些突變的效果我們能觀察到，卻無法解釋。如果不進(jìn)行更廣泛地觀察，你就會錯過學(xué)習(xí)和意外收獲的機(jī)會。

每個人都傾向于靶向突變，因?yàn)楹Y選所有的酶變異體很痛苦，而人們認(rèn)為自己已知的優(yōu)于隨機(jī)的。但有時候我們已知的并不優(yōu)于隨機(jī)的，這就是有意思的部分了。

當(dāng)您發(fā)現(xiàn)了自己無法解釋的有益突變，這是否意味著理論的不完整呢？

讓我們試著把視角帶回到20世紀(jì)80年代。那時候的理論非常有限，對吧？我們所用來了解突變效應(yīng)的工具極為有限。人們會說，好吧，蛋白質(zhì)的表面對于其功能而言并不重要，諸如此類的話。但是這些更多的是經(jīng)驗(yàn)法則而不是任何詳細(xì)的理論。我認(rèn)為咱們的經(jīng)驗(yàn)法則顯然是錯誤的。利用這一點(diǎn)，我發(fā)現(xiàn)有益突變會存在于人們以為不重要的蛋白質(zhì)區(qū)域。這讓人們更加堅定“演化是位好老師”這一觀點(diǎn)?；诶碚撊ピO(shè)計好的酶仍然很困難。

您的發(fā)現(xiàn)是否類似于演化計算，即這些程序有時候會開發(fā)出來看似并不重要、但如果將其刪除代碼就無法工作的片段呢？

是的，我認(rèn)為我們都有一個共同的元素：意外驚喜。兩個領(lǐng)域都找到了很難進(jìn)行逆向工程的解決方案。在蛋白質(zhì)領(lǐng)域，逆向工程被稱為生物化學(xué)：人們嘗試?yán)斫鉃槭裁匆粋€序列具有特定的功能以及這個功能是如何演化的。即使我們掌握適應(yīng)性突變，這件事對于實(shí)驗(yàn)室演化而來的酶而言與自然演化而來的酶一樣難以做到，我們知道突變是什么，但試圖理解它們正在做什么依舊具有挑戰(zhàn)，更別提要做預(yù)測了。演化計算也存在一些相同的特征。

您是如何將機(jī)器學(xué)習(xí)引進(jìn)實(shí)驗(yàn)室的？

定向演化的強(qiáng)大之處在于它的穩(wěn)定性，并且對解決許多問題都非常管用，是一款很普適的程序性技術(shù)。缺點(diǎn)則是速度慢且令人痛苦。你不得不制造出所有的突變，然后不得不檢測所有的突變，因?yàn)榻^大多數(shù)突變并非有益因而還必須得棄用，爾后常常還不得不重復(fù)好幾輪上述步驟。這些執(zhí)行起來非常冗長沉悶。

我們夢寐以求的是可以做規(guī)模小一些的實(shí)驗(yàn)，可能的話，不使用相同的突變范式獲得數(shù)據(jù)，然后將數(shù)據(jù)與我們對蛋白質(zhì)的了解結(jié)合起來——多序列比對、演化語言模型、結(jié)構(gòu)、分子動力學(xué)模擬——并從中學(xué)習(xí)。我們會使用多模態(tài)模型來根據(jù)我們在每一輪中學(xué)習(xí)到的信息來預(yù)測下一組應(yīng)該制作的變異體序列是什么。這就是我們的夢寐以求，也是我們目前正在努力實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)。如今，我們死磕這個問題已經(jīng)好些年了，嘗試測試不同的機(jī)器學(xué)習(xí)過程來看哪些過程有優(yōu)勢且在哪種條件下具有優(yōu)勢。不過我們也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了，良好而傳統(tǒng)的定向演化是非常棒的基準(zhǔn)線，在很多問題面前都難以被撼動。

自20世紀(jì)80年代您開始這項(xiàng)工作至今，技術(shù)已經(jīng)發(fā)生了如此多的改變，您是否不得不讓自己和工序一道基于當(dāng)今可供使用的技術(shù)來進(jìn)行適應(yīng)和調(diào)整呢？

我熱愛工具，作為工程師，我會抓住任何有用的新工具。有許多工具并沒有什么用處，所以真正的訣竅在于知道哪些工具能提供更好的信息，創(chuàng)建更好的數(shù)據(jù)庫，等等，然后我會很樂意使用這些工具。舉個例子，如今我們可以使用質(zhì)譜進(jìn)行中通量篩選，這在過去我們無法做到，現(xiàn)在我們甚至可以使用液相色譜質(zhì)譜（LCMS）來識別優(yōu)化后的酶。我們能通過不同的方式制造突變酶庫。別人也開發(fā)出了非常強(qiáng)大的連續(xù)演化工具，這些沒有像我在20世紀(jì)八九十年代描述的那樣普適，但對于特定問題它們更強(qiáng)大。所以被開發(fā)出來的不只有工具，還有運(yùn)用演化來設(shè)計的全新模式。

有了定向演化，自上而下式的基于設(shè)計構(gòu)建蛋白質(zhì)的方法是否還有一席之地呢？

就采用定向演化而言，工作人員總是需要有一個起始點(diǎn)，而這個起始點(diǎn)必須表現(xiàn)出充分的所需功能或與之相近的功能，并且可供測量評估，從而可以對其進(jìn)行改進(jìn)。我們常常被卡在找到這個起始點(diǎn)。所以蛋白質(zhì)設(shè)計可能的最大好處之一就是創(chuàng)造一個蹩腳的生物酶，而這個生物酶可以成為定向演化改進(jìn)的起始點(diǎn)，因此這便有了一個將兩種技術(shù)完美融合的案例。蛋白質(zhì)設(shè)計還將人帶入與自然界全然不同的序列空間，也將人帶入不同的功能空間。如今真正的挑戰(zhàn)是如何設(shè)計擁有我們所需新功能的酶或蛋白質(zhì)。如果你能做到這一點(diǎn)，你大概就能用這種設(shè)計所得的酶來通過定向演化進(jìn)行改造了。

定向演化是如何幫助減少化工業(yè)產(chǎn)生的廢棄物呢？

這就是我所研究的主要關(guān)注焦點(diǎn)。對我來說，酶及產(chǎn)生酶的微生物的亮點(diǎn)之處在于它們能利用可再生富集資源并將其轉(zhuǎn)化為大量漂亮的化學(xué)產(chǎn)物與材料。我們只是淺嘗輒止地訓(xùn)練微生物和演化它們所生產(chǎn)的酶來為我們做到這些?；瘜W(xué)工藝可以完全被酶法工藝取代，如今已經(jīng)有一些很好的案例。例如，默克公司因其證明能在制藥過程中大幅減少廢棄物產(chǎn)生而獲得了美國環(huán)境保護(hù)署（EPA）頒布的綠色化學(xué)挑戰(zhàn)獎，具體做法便是不再使用有毒重金屬，而是采用酶。微生物會為了獲取糖分而生產(chǎn)這些絕妙的催化劑，這于未來而言有著美好的前景。

那在您看來，這些酶是否很快就會得到廣泛使用呢？

其實(shí)，酶已經(jīng)是一門大生意了。很多酶已經(jīng)出現(xiàn)在了消費(fèi)品中。在你的洗衣粉里有各種酶，在各種生產(chǎn)工藝?yán)镉懈鞣N酶，乙醇產(chǎn)物里或者制造高果糖玉米糖漿過程中有酶和微生物。各種大規(guī)模工藝過程都用上了酶。

其實(shí)，我們對化學(xué)工藝的環(huán)境友好性和可持續(xù)性要求越高，就越要為產(chǎn)生的廢棄物付出代價——于社會而言要為這些廢棄物付出真正的代價，因此對于任何使用這些產(chǎn)品的人而言，產(chǎn)生這些廢物都應(yīng)該付出代價——我們越是讓生產(chǎn)商將這些代價內(nèi)化，我們就越會見到酶被采用。人們會自然地向這一點(diǎn)轉(zhuǎn)變。舉例來說，這就是為什么默克公司轉(zhuǎn)向生物催化的原因，因?yàn)樗麄儾幌朊可a(chǎn)一公斤藥品就產(chǎn)生數(shù)百公斤廢棄物。處理這些廢棄物的代價是高昂的。所以我看到這一改變正在發(fā)生。我們身處于轉(zhuǎn)變的初始階段，但我希望，在接下來的十年或二十年里，我們能見證更多的轉(zhuǎn)變，那些從當(dāng)前需要靠“壞屬性”的化學(xué)試劑來完成的工藝轉(zhuǎn)向使用好的酶的轉(zhuǎn)變。

定向演化是否能讓酶在極端環(huán)境下工作？

能。降解聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）塑料的酶已經(jīng)演化到十分堅韌，因此能在高溫或極限條件下的工業(yè)降解過程中工作。纖維素酶的熱穩(wěn)定性也得到了提升，因此能在原料流黏度較低而動力學(xué)較高的條件下將纖維素降解為糖。幾乎所有的工業(yè)案例和工藝都受益于讓酶變得更具耐受性，因?yàn)檫@樣酶的使用壽命也往往更長，從而降低了成本。

我的意思是，即使是洗衣粉里的酶也得有耐受性，對吧？畢竟誰想在充滿了表面活性劑和漂白劑種種的洗衣機(jī)里工作呢？這些酶必須得是非常能忍的“小狗皮膏藥”。

碳封存也是一個很好的例子。酶工程公司Codexis證實(shí)他們能制造一種能在接近100攝氏度作業(yè)的碳酸酐酶，并且在這一溫度下工藝成效會好得多，而酶的作業(yè)環(huán)境惡劣到令人驚訝的程度。酶的耐受力比人們想象的還要強(qiáng)得多。當(dāng)然，它們同時也會非常小，有時候表現(xiàn)得也會很糟糕。

演化后的酶是否會被用于可再生能源生產(chǎn)呢？

2004年，我聯(lián)合其他人創(chuàng)辦了一家名為Gevo的公司，就是通過可再生植物資源生產(chǎn)液體燃料。該公司于2011年上市，目前仍在營業(yè)。我們擁有利用玉米和農(nóng)業(yè)廢棄物生產(chǎn)異丁醇的技術(shù)。然而，石油價格暴跌，玉米價格暴漲，靠這個根本賺不到錢。如果我們不將二氧化碳成本內(nèi)部化，要與地下開采出的能源競爭十分困難。市面上有很多很棒的技術(shù)?？稍偕掖既缃癖挥脕碇圃靽姎馊剂?，并且還有其他許多可能用途。但最重要的是，除非我們真正考慮到從石油中制造這些燃料的環(huán)境氣候成本，否則生物工藝很難與之競爭。

但我認(rèn)為將生物學(xué)和生物世界里的化學(xué)引入我們?nèi)祟惖幕瘜W(xué)世界，未來是非常光明的，反之亦然！我們可以從化學(xué)家所做過的工作中學(xué)習(xí)，并將其用于教授生物學(xué)如何去執(zhí)行全新的化學(xué)任務(wù)。所以我們有許多可以相互學(xué)習(xí)的東西。這是一個全新的領(lǐng)域，對社會發(fā)展有巨大的潛力。

您的學(xué)術(shù)之路并非一步到位，而您也似乎對打破常規(guī)毫無保留。在您看來這些偏好是否有助于您在研究中的創(chuàng)新呢？

我認(rèn)為助我創(chuàng)新的是我愿意嘗試各種新事物的意愿。我擁有機(jī)械與航空航天工程學(xué)士學(xué)位和化學(xué)工程的博士學(xué)位。我必須學(xué)習(xí)一些生物學(xué)知識。我曾旅居世界各地，在讀研究生之前做過很多不同類型的工作。我不害怕學(xué)習(xí)新事物、做新事情，也不害怕以不同于標(biāo)準(zhǔn)的視角看待問題。老實(shí)說，如果你要走出去做一些全新的事，你需要具有一定程度的無畏，并且能接受批評，不會在做特立獨(dú)行之事所帶來的負(fù)面關(guān)注下崩潰。所以我認(rèn)為，20世紀(jì)70年代我所做過的不符合當(dāng)時對女性定義的標(biāo)準(zhǔn)的事情為后來的我決定在一個當(dāng)時尚不存在的領(lǐng)域里從事研究提供了優(yōu)勢。

很多人就我的諾貝爾獎獲獎之旅發(fā)問，好像這樣能指明他們自己的道路。要我說，并不存在唯一的道路——你走你自己的路。你必須成為你自己，而不是去模仿其他人。我的意思是，于我自己而言，有趣的道路就是不要與他人相同。好的道路就是擁抱自己的獨(dú)一無二，去做自己的與眾不同。

資料來源 American Scientist