8種發(fā)酵型果酒的抗氧化活性和風味物質研究

章 慧，宋林東，張夢璐，劉慧君*

（北京農學院 農業(yè)農村部農產品加工與品質控制重點實驗室，北京 102206）

發(fā)酵型果酒是指以新鮮水果為原料，經破碎、壓榨以及微生物發(fā)酵釀制而成的低度飲料酒，酒精度一般在7%vol～18%vol[1-2]。近年來，隨著人們健康理念的轉變，對酒的需求也向果酒轉變[3]，果酒釀造的興起不僅能解決水果產量過剩、銷售不暢等問題，還能提高其附加值，增加農民的經濟收入[4-5]。此外，這些以各種水果為原料的果酒不僅保留了新鮮水果的自然風味和營養(yǎng)成分，在發(fā)酵過程中還生成了多種新的功能性成分，具有促進血液循環(huán)、調節(jié)新陳代謝、延緩細胞衰老等作用[6]，因而深受廣大消費者的喜愛，消費市場前景廣闊[7]。

目前，關于果酒的研究主要集中在釀造工藝的優(yōu)化和酵母菌種的篩選等方面，冉娜等[8]采用正交試驗優(yōu)化龍眼果酒的釀造工藝，獲得了最佳的制備工藝條件。周元等[9]從獼猴桃的果皮中分離出釀酒酵母用于釀制獼猴桃酒，能更好地表達獼猴桃果酒的特征香氣。但不同品種的原料所含成分差異不同，也會導致果酒的功效指標和風味成分具有顯著影響[10-11]。DAVIDOVIC S M等[12]利用紅港（Redhaven）桃果酒與不同品種的白葡萄酒進行比較，發(fā)現桃果酒中總酚、總黃酮含量和抗氧化活性均顯著高于白葡萄酒，并且果酒在發(fā)酵過程中產生醇類、酯類、多糖等各種新成分。桑椹酒和干紅葡萄酒顏色相似，都含有大量花青素[13-14]，但因為原料不同，其營養(yǎng)物質和風味各有不同。

當今市場上果酒品類眾多，商家常常對其“營養(yǎng)保健”功效大肆宣傳，但對不同果酒的賣點宣傳模糊，不同果酒具體的營養(yǎng)成分、含量及功能性[15]等也缺乏足夠的數據支持。

本研究深入研究不同種類果酒的主要功效指標和香氣成分，同時進行感官品評分析，為后續(xù)不斷優(yōu)化果酒生產工藝，充分利用水果資源、解決果品過剩等問題提供相關基礎數據，并為中國果酒企業(yè)細化明確營養(yǎng)成分，對果酒質量的提升及新款果酒的開發(fā)提供了理論依據，促進果酒產業(yè)在新消費時代健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂酒（SG，9%vol）、荔枝酒（LG，6.5%vol）、草莓酒（CG，8%vol）、百香果酒（BG，8%vol）、抹茶青梅酒（MG，9%vol）、蜜桃酒（TG，14%vol）、青梅酒（QG，6.5%vol）、南果梨酒（NG，8%vol）：市售；總黃酮試劑盒、植物總酚含量檢測試劑盒、2,2-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）自 由基清除能力檢測試劑盒、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力檢測試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；甲醇、2-辛醇、二氯甲烷：美國Sigma Aldrich公司；無水NaCl、Na2HPO4、檸檬酸、偏重硫酸鉀：國藥集團化學試劑有限公司。本研究所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

T6紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；TGL-20BR高速臺式冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；DK-S24電熱恒溫水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司；6890N-MSD 5975氣相色譜-質譜聯用（gas chromatographmass spectrometer，GC-MS）儀：美國Agilent公司；57250-U固相萃取裝置：美國Supelco公司；N-EVAP氮吹儀：上海安譜科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 福林酚法測定總酚含量

將5 mg/L沒食子酸標準溶液用蒸餾水稀釋使質量濃度為0.156 3 mg/L、0.078 1 mg/L、0.039 0 mg/L、0.020 0 mg/L、0.010 0 mg/L、0.005 0 mg/L、0.002 5 mg/L的標準系列溶液，以沒食子酸質量濃度（c）為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標，得出線性回歸方程為：A=1.197c+0.003 6（R2=0.997 3）。吸取50 μL酒樣溶液，以蒸餾水稀釋的上清液為對照、蒸餾水為空白對照，按照試劑盒方法進行操作，平行3次。

1.3.2 硝酸鋁顯色法測定總黃酮含量

將1 mg/L蘆丁標準品溶液用體積分數60%的乙醇稀釋使質量濃度為0、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L、1.0 mg/L的標準系列溶液，以標準品質量濃度（c）為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標，得出線性回歸為A=2.549 7c-0.004 1（R2=0.998 3）。吸取200 μL酒樣溶液，以蒸餾水為空白對照，按照試劑盒方法進行操作，平行3次。

1.3.3 ABTS+自由基清除能力的測定

將10 mmol/L維生素C溶液用試劑盒提取液稀釋為0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L的標準系列溶液，以維生素C溶液濃度（c）為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標，得出線性回歸方程為：A=-0.363 7c+0.348 4（R2=0.975 9）。吸取100 μL酒樣溶液，同時以1 mmol/L維生素C溶液為陽性對照、以試劑一稀釋的酒樣上清液為對照、以蒸餾水為空白對照，按照試劑盒方法進行操作，平行3次。

1.3.4 DPPH自由基清除能力的測定

吸取100 μL酒樣溶液，同時以10 mg/mL維生素C溶液為陽性對照、以無水乙醇稀釋的酒樣上清液為對照、以提取液為空白對照，按照試劑盒方法進行操作，平行3次。

1.3.5 揮發(fā)性風味成分分析

根據李媛媛等[16]的方法略作修改。

樣品前處理：取10 mL不同品種的酒樣（用去離子水稀釋）放入20 mL頂空瓶中，加入3 g NaCl和10 μL 500 mg/L的2-辛醇作為內標，充入氮氣（N2），密封混勻，同時置于50 ℃恒溫加熱磁力攪拌器中萃取45 min。在GC進樣口，250 ℃熱解吸5 min。

氣相色譜條件：初始溫度50 ℃，保持2 min，然后以2 ℃/min的速度升溫至85 ℃保持0.1 min，再以5 ℃/min的速度升溫至230 ℃保持2 min。載氣為高純氦氣，流速1 mL/min，進樣量1 mL，不分流進樣。

質譜條件：離子源溫度為230 ℃，電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量為70 eV，四級桿溫度為150 ℃，質量掃描范圍為20～350 u。

定性定量分析：對酒樣中的化合物的定性主要采用保留指數對比和質譜庫檢索對比兩種方式。將自動識別的色譜峰與美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）08質譜庫進行對比，手動篩選出與未知化合物的保留時間與標準樣品的保留時間在5 s以內，則認為是同一種物質。風味成分采用內標法半定量分析，揮發(fā)性物質含量計算公式如下：

1.3.6 感官分析

參考尹延順等[17]的方法。

1.3.7 數據處理

使用IBM SPSS Statistics 22.0對試驗結果進行單因素方差分析（anaylsis of variance，ANOVA），P＜0.05表示差異顯著，The Unscrambler X 10.4進行偏最小二乘回歸法（par tial least squares regression，PLSR）分析。

2 結果分析

2.1 不同酒樣中總酚、總黃酮含量測定結果

酚類和黃酮類物質是果酒的主要抗氧化成分[18]，果酒抗氧化能力的差異主要由酚類和黃酮類物質的組成與含量及其之間的協同作用造成[19]。

酚類物質是果酒的“骨架成分”，影響著果酒的色澤、香氣，具有抑菌、抗氧化、清除自由基、消除疲勞等多種功效。由圖1可知，8種酒樣中均含有一定量的總酚，含量由高到低為：QG（0.139 mg/L）＞NG（0.092 mg/L）＞SG（0.070 mg/L）＞CG（0.063 mg/L）＞BG（0.056 mg/L）＞MG（0.055 mg/L）＞TG（0.042 mg/L）＞LG（0.031 mg/L），其中QG的總酚含量顯著高于其他果酒（P＜0.05），其次是NG。原料水果本身含有多種酚類物質，且在釀造過程中不會破壞酚類化合物在最終產品中的保留。夏道宗[20]研究發(fā)現，青梅梅果和梅核中富含大量的總酚物質，趙國群等[21]也發(fā)現，南果梨是極適合釀制果酒的梨種，其所釀果酒中總酚含量可達547.20 mg/L。

圖1 不同果酒樣品的總酚含量Fig.1 Total phenols content of different fruit wine samples

黃酮類物質具有清除氧自由基、延緩細胞衰老、改善心腦血管疾病等功效[22]，也是果酒重要的品質指標。由圖2可知，NG（0.02 mg/L）中總黃酮含量顯著高于其他7種果酒（P＜0.05），呈現出良好的果酒品質特性。趙一凡[23]的研究也表明南果梨極適合釀制梨酒，其所釀制的果酒中黃酮含量可達311.90 mg/L。

圖2 不同果酒樣品的總黃酮含量Fig.2 Total flavonoids content of different fruit wine samples

受果實產地差異、果酒工藝設計不同、以及微生物和環(huán)境的協同作用等影響，酚類活性物質可能會發(fā)生水解、氧化、縮合等[24]，使得總黃酮和總酚含量多寡呈現一定程度的差異。一般認為果酒中酚類物質越多，品質越高。研究發(fā)現[25-27]，延長浸泡的時間、縮短釀酒的時間、原料進行復配等均可以幫助提高果酒中酚類和黃酮類物質的含量。

2.2 不同酒樣的抗氧化能力

ABTS+自由基目前已被廣泛應用于生物樣品的總氧化能力的測定[28]。李蜜月等[29-31]的研究結果發(fā)現，果酒有較強的ABTS+自由基清除能力。但根據表1的實驗結果顯示，除了NG具有一定的ABTS+自由基清除能力，清除率為0.9%，其余7種果酒均未檢測出ABTS+自由基清除率。原因一方面可能是果酒中的多糖碳鏈的組成方式和糖基結構的復雜性將抑制果酒的清除自由基能力，導致多糖含量與ABTS+自由基的清除率呈負相關[32]，另一方面可能與果酒的成分、工藝生產流程等有關[33]。本次實驗結果中NG的總黃酮含量最高，且呈現一定的ABTS+自由基清除能力。但其他果酒的實驗數據來看，與鄒曉慶[34]的研究呈現一致，果酒中的總酚含量與ABTS+自由基清除能力不相關。

表1 不同果酒樣品的ABTS+自由基清除率Table 1 ABTS+radical scavenging rate of different fruit wine samples

DPPH是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，可以捕獲其他自由基，常被用于抗氧化性的測定[35]。由圖3可知，8種果酒均存在一定的DPPH自由基清除能力，且SG（17.4%）的DPPH自由基清除率顯著高于其他果酒（P＜0.05）。研究發(fā)現[36]，發(fā)酵可使果實中的活性成分更好地溶出，發(fā)酵型果酒的DPPH自由基清除率均高于浸泡型果酒，表明發(fā)酵果酒抗氧化能力明顯優(yōu)于浸泡型果酒。

圖3 不同果酒樣品的DPPH自由基清除率Fig.3 DPPH radical scavenging rate of different fruit wine samples

分析總酚、總黃酮與DPPH自由基清除率之間的關系，結果見圖4。由圖4可知，總酚含量＜0.05 mg/L、總黃酮含量＜0.02 mg/L時，DPPH自由基清除率在0～20%之間輕微跳動；總酚含量在0.05～0.10 mg/L范圍內、總黃酮含量在0.02～0.17 mg/L范圍內時，隨著果酒中酚類物質含量的增加DPPH自由基清除率呈上升趨勢；當總酚含量＞0.10 mg/L時、總黃酮含量＞0.17 mg/L時，DPPH自由基清除率減小到10%左右。本次實驗果酒中總酚和總黃酮含量與DPPH自由基清除率均無顯著相關性（P＞0.05），這可能是因為DPPH自由基清除率是果酒中多種活性因子相互作用的結果，也可能是果酒配制時酚類物質間相互作用發(fā)生聚合或解離等復雜反應，這些反應與果實浸漬程度、配制溫度、作用時間等多種因素有關[37]，因此果酒中的總酚和總黃酮對自由基清除能力存在一定程度的差異。

圖4 總酚（a）、總黃酮（b）含量與DPPH自由基清除率的相關性分析Fig.4 Correlation analysis of total phenols (a) and total flavonoids (b)contents with DPPH radical scavenging rate

2.3 不同酒樣中揮發(fā)性風味成分分析

采用HS-SPME-GC-MS技術對不同果酒揮發(fā)性風味物質進行分析，結果見表2。

表2 不同果酒樣品中揮發(fā)性風味物質GC-MS分析結果Table 2 Results of volatile flavor substances in different fruit wine samples analyzed by GC-MS

由表2可知，8種果酒樣品中共鑒定出揮發(fā)性物質種類為132種，酯類40種、醇類22種、羧酸類6種、醛酮類17種、烷烴類29種及其他類18種。其中，檢出酯類物質最多，占所有揮發(fā)物質種類的33.54%，酯類物質是構成果酒香氣的重要物質，許多酯類化合物形成于發(fā)酵階段，賦予了果酒果香，對果酒的總體香氣形成具有重要作用。周文杰等[38-39]分別在新疆庫爾勒香梨酒和玫瑰香橙果酒中鑒定出酯類物質種類最多。由表2亦可知，CG、MG、SG和TG中的酯類物質含量占比較高，其中CG中獨有的2-甲基丁酸乙酯，呈現一種蘋果的香味，SG中的肉豆蔻酸異丙酯呈現椰子香味，TG中特有的γ-辛內酯呈現原料桃的甜果香氣，并且在8種果酒中，QG中酯類、醇類、醛酮類、羧酸類和烷烴類物質均高于其他品種果酒，可能由于不同原料、釀造技術、菌種等對果酒風味都有影響，研究發(fā)現青梅原料低糖且酚類活性物質含量高，且含有110種主要揮發(fā)性化合物[40]。

醇類是原水果中的糖和氨基酸經過糖代謝和脫羧、脫氫產生的[41]。適量的醇類可以使果酒產生特殊的香味且散發(fā)香氣，8種果酒中共有最多的4種醇是仲辛醇、L-2-辛醇、D-2-辛醇和乙醇，平均含量分別為0.57 mg/L、0.30 mg/L、1.64 mg/L和18.69 mg/L。其中，LG、NG和QG檢出乙醇含量最高，可能由于它們的酒精度高，但乙醇除了與果酒的酒精度有關外，還能賦予果酒甜香的風味特征[42]。

大多數醛酮類物質主要源于水果發(fā)酵、加工和陳釀過程[43]，由表2可知，BG中醛酮類物質比其他類化合物檢出含量高，其中5-羥甲基糠醛含量最高，為6.132 mg/L，其賦予果酒春黃菊花的氣味。8種果酒中共有的醛酮類物質最多的是桃醛，其具有強烈的桃子香氣和杏仁香味。具有獨特香氣的醛酮類物質的存在是造成果酒風味不同的原因，例如僅在MG中檢測到的茉莉酮，散發(fā)優(yōu)雅的茉莉花香和芹菜籽香氣，SG中的癸醛，具有玫瑰花和李子香氣，LG中的異薄荷酮卻呈現一股薄荷香氣。其他揮發(fā)性風味物質中在8種不同果酒中均存在一定差異，單一物質的檢出，往往是水果在未發(fā)酵前本身所具有的，也是該種果酒具有獨特風味的原因所在。

2.4 不同酒樣中關鍵香氣成分分析

果酒中揮發(fā)性香氣成分的風味強度取決于化合物的濃度和香氣閾值，當氣味活性值（odor activity value，OAV）＞1時，則認為是香氣的主要貢獻者，是關鍵香氣成分。不同果酒中OAV＞1的揮發(fā)性香氣化合物結果見表3。

表3 不同果酒樣品中香氣活性值＞1的揮發(fā)性香氣化合物Table 3 Volatile aroma compounds with odor activity value more than 1 in different fruit wine samples

8種果酒中OAV＞1的化合物共有10種，NUZZI M等[44]研究發(fā)現，OAV與揮發(fā)性強度直接相關。由表3可知，8種果酒中OAV＞1的主要有酯類、醛酮類、醇類和羧酸類化合物，這些物質是果酒活性香氣的主要來源，影響果酒整體風味的關鍵揮發(fā)性風味物質，并且各果酒中酯類物質的占比較高，濃度較低時賦予果酒植物香、花香和脂香等香氣，使酒樣具有獨特香味。例如僅在CG中檢測到的己酸乙酯，賦予草莓酒果香的氣味，MG中的香茅醇和苯甲酸乙酯的OAV顯著高于其他酒樣，呈現獨特的玫瑰和蜂蜜香氣，大馬士酮僅在SG和TG中檢測出，OAV顯著高于其他化合物，呈現強烈的玫瑰花香及李子、圓柚的香氣。

2.5 不同酒樣的感官分析

對8種果酒進行感官評價，如圖5所示，8種果酒的感官指標評分各有差異，其中BG、CG、QG、SG、LG、MG和TG分別具有濃郁的花香、果香和甜味，CG、LG、NG和TG具有較強的乳酸味；NG和QG具有麥芽香氣；BG、CG、QG、TG、MG和TG分別具有輕微的酸味和苦味。

圖5 不同果酒樣品感官特性雷達圖Fig.5 Radar map of sensory characteristics of different fruit wine samples

2.6 感官特性與化學成分的相關性分析

利用偏最小二乘法（PLSR）分析感官特性和揮發(fā)性化合物之間的關系，結果如圖6所示。圖6-a中，19%的X方差（揮發(fā)性物質）和22%的Y方差（感官屬性和酒樣）可以在PLSR模型中得到解釋，圖6-b展示了相關載荷圖。

圖6 果酒香氣成分和感官特性的偏最小二乘回歸分析結果Fig.6 Partial least squares regression analysis result of aroma components and sensory characteristics of fruit wine

牛云蔚等[45]通過PLSR對不同產地櫻桃酒中特征呈味物質與感官屬性之間的相關性進行研究，結果表明感官屬性與部分特征呈味物質顯著相關。由圖6可知，TG和CG位于PC-1和PC-2正值處，它的特征是具有果香的感官特性，與感官評價結果相似，果香的氣味描述與己酸乙酯和辛酸乙酯等揮發(fā)性化合物有關，而且這兩種化合物都具有濃郁的果香特征。BG、MG和LG位于PC-1 和PC-2負值處，它的特征是具有甜味等感官特性，并與苯甲酸乙酯和香茅醇等揮發(fā)性化合物有關。然而QG的感官描述與揮發(fā)性化合物之間的相關性較弱，可能是受復雜成分的影響，有待進一步研究。

3 結論

本研究檢測了8種果酒的抗氧化活性，其中，果酒的多酚物質是判斷果酒存在差異性的主要原因之一，賦予果酒的顏色、口感和收斂性等感官特性，影響果酒的貯藏穩(wěn)定性。青梅梅果和梅核中富含大量的總酚物質使青梅酒的總酚含量位于前列，因此選擇適宜釀造果酒的優(yōu)良品種，對果酒產品的品質尤為重要，這為果酒的品種選擇優(yōu)化了方向?？寡趸砸蕾囉诳偡雍浚枪乒δ苄缘闹饕憩F，本研究中8種果酒的抗氧化能力較低，可能由于果酒中多糖結構抑制其清除自由基能力。而這研究結果與商家大力宣傳的優(yōu)良抗氧化功效并不契合，與消費者期望的優(yōu)質果酒仍有較大差異。

此外，通過感官評價和HS-SPME-GC-MS技術檢測不同原料果酒的揮發(fā)性風味物質，可清晰看出不同果酒間的共性與差異，這些物質通?？芍苯踊蜷g接賦予果酒特別的果香，對總體香氣形成具有重要作用，根據PLSR分析得出果香味與己酸乙酯和辛酸乙酯相關，甜味與苯甲酸乙酯和香茅醇相關。這也為明確不同果酒的含量、功能性以及為消費者甄選果酒類型、品質評價提供了參考依據。

隨著人們對果酒的質量提出了更高要求，兼?zhèn)涓郀I養(yǎng)價值和美好風味的果酒才能受到消費者的青睞，本研究旨在為不同原料的果酒提供豐富的基礎數據，推動果酒生產和消費產業(yè)革新，從理論層面為我國果酒產業(yè)發(fā)展和果酒品質深入研究提供參考依據，從而進一步拓展果品資源的利用領域。