基于電子鼻和HS-SPME-GC-MS比較不同空間層次濃香型原酒揮發(fā)性風(fēng)味成分

李俁珠，楊康卓，劉志鵬，何張?zhí)m，鄭 佳*

（宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓 644000）

中國白酒是世界六大蒸餾酒之一，距今已有2 000多年的發(fā)展歷史[1-2]。根據(jù)其工藝及風(fēng)味差異共分為12大類型，其中濃香型白酒因其產(chǎn)量高、分布廣，深受消費者喜愛，占總消費量的70%以上[3-5]。它由高粱或多種混合糧食為原料，經(jīng)發(fā)酵后蒸餾而成，具有綿柔甘洌、酒香濃郁、入口綿、落口甜、尾凈余長的獨特風(fēng)味[6-7]。

“以糟養(yǎng)窖，以窖養(yǎng)糟”是濃香型白酒與其他香型白酒生產(chǎn)工藝的區(qū)別之一[8-9]。濃香型白酒的獨特風(fēng)味，是糟醅與窖泥中的微生物共同發(fā)酵產(chǎn)生的。由于受到水分和含氧量等多重因素的作用，不同空間層次的糟醅與窖泥，其微生物群落結(jié)構(gòu)及風(fēng)味物質(zhì)之間均具有顯著差異[10-11]。因此，不同空間層次的濃香型原酒也具有較大的風(fēng)味特征差異。

電子鼻，是一種模仿人類嗅覺系統(tǒng)以識別氣味的設(shè)備，可以對樣品的整體風(fēng)味信息進行客觀判別并有效區(qū)分，具有操作簡單，快速的優(yōu)勢，但無法分離、鑒定樣品的香氣成分[12-13]。而頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）可對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行分離、鑒定，具有靈敏度高、抗干擾能力強等優(yōu)點[14-15]，已廣泛應(yīng)用于白酒等食品揮發(fā)性風(fēng)味成分的研究，王鐵儒等[16]利用HS-SPME-GC-MS和電子鼻技術(shù)結(jié)合主成分分析成功區(qū)分了不同酵母混合發(fā)酵的獼猴桃酒。

本研究擬采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)結(jié)合電子鼻技術(shù)比較不同空間層次的濃香型原酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，利用偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）模型確定對不同空間層次原酒分類起關(guān)鍵作用的香氣成分，并對電子鼻結(jié)果進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和線性判別分析（lin ear discriminant analysis，LDA）。旨在為分層起糟、分層蒸餾、按質(zhì)并壇等生產(chǎn)工藝技術(shù)提供理論支撐，為濃香型原酒品質(zhì)控制提供新技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同空間層次的濃香型原酒樣品（分別收集了10口不同窖池的上、下層糟醅蒸餾所得濃香型原酒樣品，均為對應(yīng)窖池的混合樣。其中，上層為未被黃水覆蓋的干糟，下層為發(fā)酵后被黃水沁潤的濕糟，上層樣品編號為1～10，下層樣品編號為11～20）：宜賓五糧液股份有限公司。

C7～C30正烷烴標(biāo)準(zhǔn)品、2-乙基己醇、苯甲醛、苯甲酸、丁酸、3-甲基丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、癸酸、己酸甲酯、月桂酸乙酯（均為色譜純）：美國西格瑪奧德里奇生命科學(xué)公司；氯化鈉（色譜純）：阿拉丁生化科技股份（上海）有限公司；苯乙醛（色譜純）：美國賽默飛世爾科技公司；乙酸乙酯、1-丁醇、月桂酸、丁酸乙酯、己酸乙酯（均為色譜純）：北京百靈威科技有限公司；3-甲基-2-丁醇、4-甲基-2-戊醇、3-甲基丁醇、戊醇、2-庚醇、己醇、苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯丙酸乙酯、對甲酚、壬酸、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、乙酸正丁酯、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、異己酸乙酯、丁酸異戊酯、乙酸己酯、己酸丙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、戊酸異戊酯、己酸丁酯、丁酸己酯、辛酸乙酯、己酸異戊酯、己酸戊酯、壬酸乙酯、DL-2-羥基-4-甲基戊酸乙酯、己酸己酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、十一酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕櫚酸乙酯、十八酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯、糠醛、丁醛、3-甲基丁醛、己醛、丙酮、2-戊酮、內(nèi)標(biāo)物（4-辛醇、戊酸甲酯）（均為色譜純）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP-INNOWax氣相毛細(xì)管柱（60 m×0.32 mm×0.25 μm）、SPME專用直型襯管：美國安捷倫科技（中國）有限公司；GERSTEL MPSpro多功能全自動樣品前處理平臺：哲斯泰（上海）貿(mào)易有限公司；2 cm 30/50 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭：美國Supelco公司；PEN3便攜式電子鼻：德國Air Sense公司；Milli-Q型超純水儀：美國密里博公司。

1.3 方法

1.3.1 電子鼻測定

根據(jù)本課題組前期優(yōu)化的方法進行電子鼻測定[17]。具體操作流程如下：吸取10 μL酒樣注入10 L氣體采樣袋中，氮氣填充，室溫平衡5 min后，進行電子鼻測定。電子鼻參數(shù)設(shè)置如下：氣體流量200 mL/min，傳感器清洗時間60 s，調(diào)零時間5 s，準(zhǔn)備時間5 s，數(shù)據(jù)采集時間60 s。每個樣品重復(fù)測定5次，取51～54 s響應(yīng)值用于數(shù)據(jù)分析。PEN3電子鼻傳感器10個探頭具體信息見表1。

表1 電子鼻傳感器敏感物質(zhì)Table 1 Sensitive substances of electronic nose sensor

1.3.2 HS-SPME-GC-MS分析

樣品前處理：分別向20 mL螺紋頂空瓶中加入100 μL酒樣、900 μL飽和食鹽水，同時加入10 μL內(nèi)標(biāo)混合溶液（4-辛醇、戊酸甲酯，質(zhì)量濃度均為100 mg/L），渦旋混勻，并使用配備聚四氟乙烯隔墊的螺紋蓋密封頂空瓶。

頂空固相微萃?。℉S-SPME）條件：每個樣品測試前，將DVB/CAR/PDMS萃取頭插入老化器中270 ℃老化3 min。將頂空瓶置于60 ℃振蕩平衡15 min，平衡結(jié)束后將老化的萃取頭插入頂空瓶萃取45 min，后取出萃取頭插入GC進樣口中，并在230 ℃解吸3 min，進行GC-MS分析測定。

氣相色譜條件：HP-INNOWax毛細(xì)管柱（60 m×0.32 mm×0.5 μm）；進樣口溫度230 ℃，載氣為高純氦氣（He）（純度＞99.999%），流速1 mL/min，不分流模式；色譜柱升溫程序：40℃保持3min，以4℃/min的速度升溫至230℃，保持10min。

質(zhì)譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV；接口溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；掃描模式：scan；質(zhì)量掃描范圍35～350 m/z，溶劑延遲時間為2 min。

定性和定量方法：通過Mass Hunter軟件將未知化合物的質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜庫美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）20進行對比，篩選匹配指數(shù)＞85的化合物，作為初步判斷結(jié)果；然后根據(jù)相同GC升溫程序下正構(gòu)烷烴（C7～C30）標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間，結(jié)合Kováts保留指數(shù)計算未知化合物的保留指數(shù)（retention index，RI），根據(jù)文獻報道的RI值對化合物進行再次鑒定；最后，對比分析標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間與未知化合物出峰時間是否一致，最終判斷化合物歸屬。采用內(nèi)標(biāo)法根據(jù)被測化合物和內(nèi)標(biāo)物相應(yīng)的色譜峰面積之比，計算各物質(zhì)的含量，其計算公式如下：

式中：Cs為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度，mg/L；Ci為待測物質(zhì)量濃度，mg/L；Ai和As分別為待測物和內(nèi)標(biāo)物的峰面積。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

采用WinMuster（Version 1.6.2，AIRSENSE ANALYTICS GmbH）軟件對原酒數(shù)據(jù)進行主成分分析（PCA）和線性判別分析（LDA）；通過SIMCA-P 11軟件（Umetrics，Umea，Sweden）對不同層次酒樣的揮發(fā)性化合物進行PLS-DA模型分析。最后，通過Excel 2019和IBM SPSS 22.0進行結(jié)果統(tǒng)計分析及表格制作，Origin 8.0軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同層次濃香型原酒的電子鼻分析

原酒樣品在PEN3便攜式電子鼻上的傳感器響應(yīng)如圖1（a）所示，在進樣初期G/G0值較低，隨著揮發(fā)性氣體成分在傳感器表面不斷聚集，G/G0值逐漸增加，而后趨于平緩。為保證試驗結(jié)果的重復(fù)性，選擇51～54 s穩(wěn)態(tài)時段的數(shù)據(jù)進行分析。上下層原酒樣品電子鼻傳感器響應(yīng)值雷達圖見圖1（b）和圖1（c），它可以揭示電子鼻各傳感器陣列對原酒樣品信號響應(yīng)的整體和個體差異[18]。由圖1（b）和圖1（c）可知，上下層原酒在電子鼻上的主要響應(yīng)傳感器均為W1W、W5S、W2S、W2W和W1S，其中下層原酒在W5S、W2W和W1S傳感器上的相對響應(yīng)明顯高于上層原酒，說明上下層酒樣具有相似的風(fēng)味輪廓，但在具體風(fēng)味化合物的種類和含量上有一定差異，這些差異可能來源于氮氧化合物、醇類、醛酮類、芳香類以及有機硫化物。

圖1 濃香型原酒樣品的電子鼻傳感器響應(yīng)曲線（a）及上層（b）、下層（c）香氣特征雷達圖Fig.1 Electronic nose sensor response curves (a), aroma characteristics radar diagram of upper (b) and bottom(c) layers of original strong-flavor Baijiu samples

電子鼻數(shù)據(jù)處理中所采用的模式識別算法可以提高其識別精度和工作效率，同時增強系統(tǒng)的抗干擾能力。其中，PCA和LDA最為常用[19]。PCA是將采集的數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)換和降維，得出貢獻率最大和最主要的成分，將樣品按照主成分劃分在不同的區(qū)域，通過區(qū)域之間的距離表示不同樣品之間的差異[20]。LDA是將高維的模式樣本投影到最佳鑒別矢量空間的典型監(jiān)督分類算法。通過LDA可以抽取分類信息和壓縮特征空間維數(shù)，通過樣品空間距離的遠近判斷樣品的性質(zhì)差異大小[21]。

對上下層濃香型原酒的電子鼻傳感器響應(yīng)值進行PCA和LDA，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，第1主成分（principalcomponent，PC）PC1的方差貢獻率為75.48%，第2主成分（PC2）的方差貢獻率為13.58%，PC1和PC2累計方差貢獻率達89.06%，說明PC1和PC2可以反映原酒樣品中的絕大部分信息。同一層次酒樣的數(shù)據(jù)點聚集性較好，表明樣品具有良好的重復(fù)性；不同層次的酒樣分布區(qū)域明顯不同，說明上下層酒樣的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)差異明顯，且可以通過PCA進行有效區(qū)分。酒樣線性判別（linear discriminant，LD）因子1的方差貢獻率為35.59%，酒樣LD2的方差貢獻率為8.06%，酒樣LD1和LD2的累計方差貢獻率為43.65%。結(jié)果表明，LDA對電子鼻的原始特征數(shù)據(jù)解釋力度欠佳，但大部分樣品間無重疊部分，說明大部分樣品間香氣特征存在差異，可以進行有效區(qū)分。綜上，采用不同空間層次原酒樣品的揮發(fā)性風(fēng)味化合物差異，均可通過PCA和LDA對其進行有效區(qū)分，但PCA比LDA更能準(zhǔn)確區(qū)分原酒的不同空間層次。

2.2 不同層次濃香型原酒揮發(fā)性風(fēng)味化合物的特征分布

利用HS-SPME-GC-MS分析上下層濃香型原酒中揮發(fā)性風(fēng)味化合物，結(jié)果見表2。

表2 不同空間層次濃香型原酒樣品的主要揮發(fā)性風(fēng)味化合物GC-MS分析結(jié)果Table 2 Results of main volatile flavor compounds in original strong-flavor Baijiu samples with different spatial levels analyzed by GC-MS

由表2可知，在上下層濃香型原酒酒樣中共鑒定出76種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，包括酯類39種、酸類9種、芳香類9種、醇類8種、酮類4種、醛類3種、呋喃類3種及其他類1種。

不同空間層次原酒樣品中各類別揮發(fā)性風(fēng)味化合物的總含量結(jié)果見圖3。由圖3可知，下層濃香型原酒中酯類、酸類、縮醛類、有機酸等總含量均顯著高于上層濃香型原酒（P＜0.05）。這是因為在糟醅發(fā)酵過程中時窖池下層厭氧程度更高，更有利于己酸菌、梭菌等細(xì)菌代謝有機酸[24]；這些有機酸對應(yīng)的酯類化合物如己酸乙酯、丁酸異戊酯、庚酸乙酯、己酸丁酯、丁酸己酯、己酸己酯、己酸戊酯、己酸異戊酯均具有相同的情況；而半揮發(fā)性的酯類如月桂酸乙酯、棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯丁二酸二乙酯等物質(zhì)上下層原酒間差異不明顯。除此之外，3-甲基-2-丁醇、4-甲基-2-戊醇、2-庚醇、己醇、2-乙基己醇，乳酸乙酯、DL-2-羥基-4-甲基戊酸乙酯丙酮、2-戊酮、2-己酮等化合物其下層原酒中的含量顯著高于上層（P＜0.05）。這可能是因為在重力作用下糟醅發(fā)酵時產(chǎn)生的黃水將上層的部分風(fēng)味化合物帶到窖池底部，使得下層糟醅中富集了更高含量的這類物質(zhì)[22-24]。醛類化合物中己醛在上層原酒中的含量顯著高于下層（P＜0.05）；呋喃類與芳香族類化合物的含量在上下層間差異均不顯著（P＞0.05）。

圖3 不同空間層次濃香型原酒樣品中各類別揮發(fā)性風(fēng)味化合物的總含量Fig.3 Total contents of various categories volatile flavor compounds in original strong-flavor Baijiu samples with different spatial levels

2.3 不同空間層次濃香型原酒的揮發(fā)性風(fēng)味化合物的差異性分析

為進一步明確不同空間層次濃香型原酒中的差異風(fēng)味化合物，根據(jù)PLS-DA模型分析有顯著差異的化合物，結(jié)果見圖4。由圖4可知，PC1為55.5%，PC2為11.9%，PC1和PC2累計方差貢獻率大于65%，說明該模型反映了樣品絕大部分的信息，具有較好的解釋力度。結(jié)果顯示，上下層濃香型原酒樣品分別分布在PC1軸的左右兩邊，說明兩者的整體風(fēng)味具有明顯的差異，PLS-DA模型可以對不同空間層次的濃香型原酒進行區(qū)分。不同窖池的上層酒樣較為聚集，而下層酒樣較為分散，與電子鼻的LDA結(jié)果相吻合，說明下層原酒具有更大的組內(nèi)差異，其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成更為復(fù)雜。

圖4 不同空間層次濃香型原酒樣品中揮發(fā)性風(fēng)味成分偏最小二乘法-判別分析結(jié)果Fig.4 Results of partial least squares-discriminant analysis of volatile flavor components in original strong-flavor Baijiu samples with different spatial levels

變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值可以衡量各組分含量對樣本分類判別的影響強度和解釋能力，表征了分類過程中各個變量的重要性，通常VIP值＞1的變量在不同樣本組之間的判別中起著重要作用[25]。通過VIP值篩選出13個關(guān)鍵差異標(biāo)記物，結(jié)果見圖5。

圖5 不同空間層次濃香型原酒中關(guān)鍵差異風(fēng)味化合物的變量重要性投影值Fig.5 Variable importance in the projection values of the key difference flavor components in original strong-flavor Baijiu samples with different spatial levels

由圖5可知，13個關(guān)鍵差異性風(fēng)味化合物中酯類4種、酸類4種、酮類3種、醛類1種、醇類1種?？梢?，酯類和酸類揮發(fā)性風(fēng)味化合物的含量差異可能是造成上下層濃香型原酒整體風(fēng)味差異的重要原因。按照VIP值大小排名依次為乙酸異戊酯＞乙酸乙酯＞2-己酮＞丙酮＞2-戊酮＞己醛＞丁酸＞庚酸＞戊酸＞3-甲基丁酸＞DL-2-羥基-4-甲基戊酸乙酯＞戊醇＞己酸乙酯，這些關(guān)鍵差異性化合物含量的不同是引起不同空間層次濃香型原酒風(fēng)味差異的主要因素。

3 結(jié)論

本研究采用HS-SPME-GC-MS結(jié)合電子鼻技術(shù)對不同層次濃香型原酒的揮發(fā)性風(fēng)味化合物進行了比較分析，共檢測出76種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，其中酯類39種、酸類9種、芳香類9種、醇類8種、酮類4種、醛類3種、呋喃類3種及其他類1種。且下層濃香型原酒中酯類、酸類、縮醛類、有機酸等總含量均顯著高于上層濃香型原酒（P＜0.05）。其中，乙酸異戊酯、乙酸乙酯、2-己酮、己醛、丁酸、3-甲基丁酸、己酸乙酯等13種揮發(fā)性風(fēng)味化合物是兩者的關(guān)鍵差異風(fēng)味物質(zhì)。電子鼻結(jié)果與HS-SPME-GC-MS的結(jié)果互相映證，可以通過LDA和PLS-DA模型實現(xiàn)濃香原酒中揮發(fā)性成分差異的快速有效鑒別。本研究結(jié)果可為科學(xué)管理濃香型原酒入庫，分級儲存等生產(chǎn)工藝提供一定的理論支撐，以保障產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。