羌活勝濕湯物質(zhì)基準(zhǔn)多指標(biāo)成分含量測(cè)定及量值傳遞分析*

王敏，薛志峰，孫新茹，李丹丹，王志娟，惠玉玉，劉志東

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程中心，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617；3.哈爾濱珍寶制藥有限公司，哈爾濱 150040）

羌活勝濕湯（QSD）出自金代醫(yī)家李東垣所著《內(nèi)外傷辨惑論》[1]，由羌活、獨(dú)活、藁本、防風(fēng)、川芎、炙甘草、蔓荊子7 味中藥組成，具有祛風(fēng)勝濕止痛之功，主治風(fēng)濕在表之痹證，是臨床祛風(fēng)濕止痛的中藥復(fù)方?，F(xiàn)代臨床研究表明本方主要用于關(guān)節(jié)炎、頸椎病、偏頭痛、肩背疼痛等疾病的治療[2]。經(jīng)典名方是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，其復(fù)方制劑是中藥產(chǎn)品發(fā)展的重要途徑[3]，而經(jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)更是其復(fù)方制劑研發(fā)和開展的核心內(nèi)容，QSD 被收錄在國(guó)家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的第1 批古代經(jīng)典名方目錄中。目前，關(guān)于QSD 的文獻(xiàn)報(bào)道多集中于藥理作用及臨床應(yīng)用領(lǐng)域，物質(zhì)基準(zhǔn)方面鮮有研究。本研究根據(jù)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《古代經(jīng)典名方關(guān)鍵信息考證原則》等相關(guān)指導(dǎo)原則，通過(guò)制備15 批經(jīng)典名方QSD 物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉，采用高效液相（HPLC）法建立QSD 多指標(biāo)成分含量測(cè)定方法，測(cè)定其指標(biāo)成分含量，進(jìn)行飲片到物質(zhì)基準(zhǔn)之間的量值傳遞分析，為經(jīng)典名方QSD 后續(xù)的研究及相關(guān)制劑研發(fā)的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 1260 型高效液相色譜儀，DAD 檢測(cè)器，美國(guó)Agilent 公司；AX205 型十萬(wàn)分之一天平，瑞士METTLER TOLEDO 公司；FA124 型萬(wàn)分之一天平，天津億諾科學(xué)儀器有限公司；Milli-Q 超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore 公司；DZL 煎藥壺，潮州市潮安區(qū)康爾順貿(mào)易有限公司；TDGC2-3KVA 型接觸式調(diào)壓器，飄風(fēng)電器有限公司；N-10000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本EYELA 公司；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴槽，天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-400B 超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；FW100 型萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；B-290 型噴霧干燥儀，瑞士Buchi 公司；DZF-6090 型真空干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；FDU-2100 型冷凍干燥機(jī)，日本EYELA 公司。

1.2 試藥 羌活醇（111820-201504，含量以99.9%計(jì)）、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯（111583-201605，含量以98.6%計(jì)）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（111523-201610，含量以96.1%計(jì)）、蔓荊子黃素（111554-201705，含量以98.3%計(jì)）、異歐前胡素對(duì)照品（110827-201611，含量以99.4%計(jì)）、甘草酸銨對(duì)照品（110731-201619，含量以93.0%計(jì)）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品鑒定研究所；甲醇（色譜級(jí)，賽默飛世爾科技有限公司），乙腈（色譜級(jí)，賽默飛世爾科技有限公司），磷酸（色譜級(jí)，批號(hào)130271，賽默飛世爾科技有限公司），實(shí)驗(yàn)室自制超純水；QSD 物質(zhì)基準(zhǔn)15 批次，批號(hào)及所用飲片產(chǎn)地信息見表1，由黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司提供，經(jīng)過(guò)天津中醫(yī)藥大學(xué)祁東利副研究員鑒定羌活NOTOPTERYGⅡRHIZOMA ET RADIX、獨(dú)活A(yù)NGELICAE PUBESCENTIS RADIX、藁本LIGUSTICI RHIZOMA ET RADIX、防風(fēng)SAPOSHNIKOVIAE RADIX、炙甘草GLYCYRRHIZAE RADIX ET RHIZOMA PRAEPARATA CUM MELLE、川芎CHUANXIONG RHIZOMA、蔓荊子VITICIS FRUCTUS 均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版要求。

表1 15 批QSD 物質(zhì)基準(zhǔn)組合信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 指標(biāo)成分含量測(cè)定 色譜條件：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱。流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸水。洗脫梯度：0～15 min，12%～15%乙腈；15～37 min，15%～19%乙腈；37～52 min，19%～24%乙腈；52～64 min，24%～27%乙腈；64～75 min，27%～37%乙腈；75～92 min，37%～50%乙腈；92～109 min，50%～58%乙腈；109～113 min，58%～90%乙腈；113～125 min，90%乙腈。柱溫30 ℃。體積流量0.8 mL/min。進(jìn)樣量10 μL。檢測(cè)波長(zhǎng)：254（檢測(cè)5-O-甲基維斯阿米醇苷和蔓荊子黃素）、310（檢測(cè)羌活醇和異歐前胡素）、237（檢測(cè)甘草酸銨）、330（檢測(cè)二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯）nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取5-O-甲基維斯阿米醇苷、蔓荊子黃素、羌活醇、異歐前胡素、甘草酸銨、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對(duì)照品適量，加入甲醇制成1 mL 含18.08 μg 5-O-甲基維斯阿米醇苷、4.47 μg 蔓荊子黃素、44.7 μg 羌活醇、8.016 μg 異歐前胡素、504 μg 甘草酸銨、4.29 μg 二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的混合對(duì)照品溶液。

2.3 QSD 物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉的制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法，分別對(duì)方中各飲片進(jìn)行隨機(jī)組合，見表1?！秲?nèi)外傷辨惑論》原文記載的QSD 處方及制法為“羌活、獨(dú)活各一錢，藁本、防風(fēng)、甘草（炙）、川芎各五分，蔓荊子三分。上咀，都作一服，水二盞，煎至一盞，去渣，大溫服，空心食前”。經(jīng)前期考證，確定處方劑量為羌活、獨(dú)活各3.0 g，川芎、藁本、炙甘草、防風(fēng)各1.5 g，蔓荊子0.9 g。取各飲片置于砂鍋中，加入去離子水400 mL，浸泡30 min 后煎煮至藥液體積剩余約200 mL，使用兩層紗布趁熱過(guò)濾，置于室溫冷卻后，將標(biāo)準(zhǔn)湯劑旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至流浸膏，預(yù)凍后冷凍干燥，即得15 批QSD 物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉，同法制備各陰性凍干粉。

2.4 供試品溶液的制備 取“2.3”項(xiàng)下制備的QSD凍干粉0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密移取60%甲醇（v/v）10 mL，稱取質(zhì)量，320 W、40 kHz 超聲處理45 min，放冷至室溫，補(bǔ)足失去質(zhì)量，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.5 含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性考察 分別精密吸取按“2.2”項(xiàng)及“2.4”項(xiàng)下制備得到的各對(duì)照品溶液、供試品溶液及各陰性樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果顯示，陰性對(duì)照?qǐng)D中顯示對(duì)5-O-甲基維斯阿米醇苷、蔓荊子黃素、羌活醇、異歐前胡素、甘草酸銨、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 QSD 專屬性考察HPLC 圖

2.5.2 線性關(guān)系考察 精密吸取按“2.2”項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液適量，用甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度的系列對(duì)照品溶液。按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如表2所示。結(jié)果表明，各指標(biāo)成分線性關(guān)系良好。

表2 QSD 物質(zhì)基準(zhǔn)中指標(biāo)性成分含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.5.3 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取一定濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的含量測(cè)定色譜條件進(jìn)樣洗脫，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄各指標(biāo)成分峰面積，計(jì)算得到的峰面積RSD值均小于3.00%，結(jié)果表明該方法儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一批物質(zhì)基準(zhǔn)供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于供試品溶液制備后0、2、4、8、12、24、36、48 h 進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算5-O-甲基維斯阿米醇苷、蔓荊子黃素、羌活醇、異歐前胡素、甘草酸銨、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯峰面積的RSD值分別為2.85%、1.91%、0.92%、2.53%、0.67%、2.01%，表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批物質(zhì)基準(zhǔn)供試品溶液6 份，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算5-O-甲基維斯阿米醇苷、蔓荊子黃素、羌活醇、異歐前胡素、甘草酸銨、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯含量的RSD值分別為2.86%、1.60%、0.76%、0.71%、0.81%、0.89%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取上述重復(fù)性實(shí)驗(yàn)已測(cè)定各指標(biāo)成分含量的同批次QSD 物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉適量，精密稱定，分別以指標(biāo)成分含量的50%加入各指標(biāo)成分對(duì)照品儲(chǔ)備液各6 份，按“2.4”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各指標(biāo)成分的回收率。結(jié)果如表1所示，各指標(biāo)成分平均加樣回收率均在95%～105%，RSD在0.77%～3.69%，結(jié)果表明加樣回收率良好。

2.6 15 批QSD 物質(zhì)基準(zhǔn)指標(biāo)成分含量及飲片-物質(zhì)基準(zhǔn)轉(zhuǎn)移率測(cè)定 采用“2.4”項(xiàng)下的方法分別制備15 批物質(zhì)基準(zhǔn)供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定15 批物質(zhì)基準(zhǔn)中各指標(biāo)成分的含量，各飲片按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版進(jìn)行含量測(cè)定[4]，按公式“轉(zhuǎn)移率（%）=[物質(zhì)基準(zhǔn)中指標(biāo)成分含量（mg/g）]÷[對(duì)應(yīng)批次飲片中指標(biāo)成分含量（mg/g）]×100%”計(jì)算各指標(biāo)成分飲片到物質(zhì)基準(zhǔn)的含量轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表3 及表4。

表4 飲片-物質(zhì)基準(zhǔn)中甘草酸銨、蔓荊子黃素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯轉(zhuǎn)移率%

由表3、表4 結(jié)果可知，15 批物質(zhì)基準(zhǔn)中指標(biāo)成分5-O-甲基維斯阿米醇苷含量為1.27～2.81 mg/g，平均轉(zhuǎn)移率為77.60%，轉(zhuǎn)移率均值的±30%為54.32%～100.88%；羌活醇含量為1.09～1.70 mg/g，平均轉(zhuǎn)移率為16.82%，轉(zhuǎn)移率均值的±30%為11.77%～21.87%；異歐前胡素含量為0.03～0.28 mg/g，平均轉(zhuǎn)移率為1.44%，轉(zhuǎn)移率均值的±30%為1.01%～1.87%；甘草酸銨含量為12.74～33.78 mg/g，平均轉(zhuǎn)移率為54.86%，轉(zhuǎn)移率均值的±30%為38.40%～71.32%；蔓荊子黃素含量為0.09～0.59 mg/g，平均轉(zhuǎn)移率為9.30%，轉(zhuǎn)移率均值的±30%為6.51%～12.09%；二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯含量為0.06～0.20 mg/g，平均轉(zhuǎn)移率為8.93%，轉(zhuǎn)移率均值的±30%為6.25%～11.60%。

3 討論

3.1 含量測(cè)定及指標(biāo)成分的選擇 中藥有效成分作為中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，其選擇及確定是中藥復(fù)方及單味藥材質(zhì)量控制的重要過(guò)程，含量測(cè)定指標(biāo)成分的選擇不僅要符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版[4]的規(guī)定，還要確保其在相應(yīng)的飲片、物質(zhì)基準(zhǔn)及復(fù)方能夠?qū)崿F(xiàn)可靠穩(wěn)定的質(zhì)量控制。本方選取的指標(biāo)成分羌活醇、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、甘草酸銨、蔓荊子黃素、5-O-甲基維斯阿米醇苷均為《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版[4]中羌活、獨(dú)活、甘草、蔓荊子、防風(fēng)藥材的含量測(cè)定成分，均為專屬性成分，且對(duì)于他們的藥理作用有明確的文獻(xiàn)報(bào)道[5-16]。獨(dú)活、甘草在《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版中含量測(cè)定的成分還有蛇床子素、甘草苷，進(jìn)行專屬性實(shí)驗(yàn)時(shí)在獨(dú)活陰性中有干擾；甘草苷出現(xiàn)峰形不好、不易分開等現(xiàn)象，故蛇床子素與甘草苷沒有作為指標(biāo)成分進(jìn)行測(cè)定?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2020年版中藁本、川芎的含量測(cè)定成分均為阿魏酸，無(wú)法作為專屬性指標(biāo)成分，且藁本、川芎的化學(xué)成分相似[17-18]，經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究，未在藁本、川芎中找到專屬性成分。

3.2 色譜條件及樣品處理方法的考察 本實(shí)驗(yàn)前期對(duì)含量測(cè)定色譜條件的不同流速（0.7、0.8、0.9mL/min）、不同柱溫（30、35、40 ℃）、不同比例的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，考察色譜圖出峰個(gè)數(shù)、峰形及分離度情況。結(jié)果表明流速為0.8 mL/min、柱溫為30 ℃時(shí)，各峰形較好，分離度較好，整體基線較平穩(wěn)。對(duì)樣品的處理方法考察了不同比例甲醇、乙腈和純水的提取溶劑，不同超聲功率及超聲時(shí)間，以色譜圖整體峰形及分離度結(jié)果確定了60%甲醇復(fù)溶、超聲功率320W、超聲45 min 的樣品處理方法。

3.3 物質(zhì)基準(zhǔn)各指標(biāo)成分的含量及量值傳遞分析 根據(jù)《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑的申報(bào)資料要求（征求意見稿）》中的指導(dǎo)建議，出膏率、指標(biāo)性成分含量轉(zhuǎn)移率應(yīng)在均值±30%的波動(dòng)范圍內(nèi)。結(jié)果提示15 批物質(zhì)基準(zhǔn)的平均出膏率為31.86%，RSD為3.77%，均未出現(xiàn)離散數(shù)據(jù)（平均值的70%～130%以外）。指標(biāo)成分5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯轉(zhuǎn)移率均在均值±30%內(nèi)；異歐前胡素轉(zhuǎn)移率中S5、S15 批次超出范圍；蔓荊子黃素轉(zhuǎn)移率中S2、S5、S9、S14 批次超出范圍；羌活醇轉(zhuǎn)移率中S1、S4、S9、S13、S14、S15 批次超出范圍。分析其原因發(fā)現(xiàn)不同批次飲片中羌活醇、異歐前胡素、蔓荊子黃素含量差異較大，導(dǎo)致多批次飲片-物質(zhì)基準(zhǔn)轉(zhuǎn)移率超出范圍；中藥成分復(fù)雜，中藥復(fù)方中各成分相互作用、相互影響也是造成指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率波動(dòng)范圍較大的原因之一；15 批QSD 物質(zhì)基準(zhǔn)各指標(biāo)成分含量范圍較大，組成QSD 物質(zhì)基準(zhǔn)的飲片含量差異較大，15 批QSD 物質(zhì)基準(zhǔn)的原料來(lái)自不同產(chǎn)地，導(dǎo)致其各項(xiàng)指標(biāo)成分含量差異較大。所以在以后的研究中，要確保選取藥材的來(lái)源和質(zhì)量穩(wěn)定，進(jìn)行藥材道地產(chǎn)地和主產(chǎn)地之間指標(biāo)含量等質(zhì)量的差異分析，選擇一定的含量范圍，以此初步選定藥材產(chǎn)地，除此之外投料的均一性也是保證含量穩(wěn)定的重要條件[19]。建議剔除離散程度較大的批次數(shù)值，后續(xù)研究增加物質(zhì)基準(zhǔn)研究批次，嚴(yán)格控制飲片的質(zhì)量波動(dòng)，以保證不同批次物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定，降低離散值的影響，以期建立更加具有代表性的物質(zhì)基準(zhǔn)相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備15 批QSD 物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉，建立其含量測(cè)定方法，測(cè)定專屬成分羌活醇、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、甘草酸銨、蔓荊子黃素、5-O-甲基維斯阿米醇苷含量并進(jìn)行飲片到物質(zhì)基準(zhǔn)量值傳遞分析，建議在后續(xù)的研究中嚴(yán)格把控投料飲片的質(zhì)量情況，以期為經(jīng)典名方QSD 后續(xù)物質(zhì)基準(zhǔn)與制劑研發(fā)的一致性和穩(wěn)定性提供依據(jù)。