基于脂質代謝組學研究羥基紅花黃色素A治療高脂血癥LDLR-/-小鼠的作用機制

唐華靖，羅雅歌，楊磊，徐寶欣，徐靜雅，苗琳，柴麗娟，張晗，王怡，毛浩萍

（1.天津中醫(yī)藥大學方劑學教育部重點實驗室，天津 301617；2.悅康藥業(yè)集團股份有限公司，北京 100176）

高脂血癥是人體內脂代謝發(fā)生紊亂的一種現(xiàn)象，其特征主要是體內總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量升高，以及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）降低[1]。高脂血癥主要由飲食失調、肥胖、遺傳性疾病或其他疾病引起[2]。此外，高脂血癥可導致脂肪肝[3]、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病[4]、糖尿病[5]、動脈粥樣硬化[6]等疾病。目前，臨床上有許多藥物用于治療高脂血癥，包括他汀類藥物、膽汁酸螯合劑、依折麥布片等，但這些藥物可能引起肝臟毒性、腹痛、便秘等不良反應[7]。中醫(yī)藥治療高脂血癥具有其獨特的優(yōu)勢，因而受到越來越多的關注。

紅花（CarthamustinctoriusL.）為菊科植物紅花干燥的花，具有活血通經、化瘀止痛功效，是傳統(tǒng)活血化瘀類中藥[8]?；钛鲱愔兴幣c高脂血癥關系緊密，大量研究表明，活血化瘀類中藥具有調節(jié)血脂作用[9-11]。從紅花中提取分離得到的羥基紅花黃色素A（HSYA），該成分是紅花活血化瘀功效的主要有效成分[12]。現(xiàn)代藥理實驗表明，HSYA 具有調節(jié)脂肪代謝、保護肝臟作用[13-14]。在2017年《紅花黃色素臨床應用中國專家共識》中明確HSYA 具有調脂作用，有研究表明HSYA 可以通過促進小鼠3T3-LI前脂肪細胞激素敏感脂肪增殖分化、減少前脂肪細胞數(shù)量達到降低血脂的目的[15-16]。為了進一步了解HSYA 對高脂血癥的作用機制，本實驗基于脂質組學技術，采用高脂飼料誘導LDLR-/-小鼠構建高脂血癥模型，研究HSYA 對高脂飼料誘導的高脂血癥LDLR-/-小鼠脂質代謝的調節(jié)作用，旨在為臨床應用HSYA 提供科學實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性LDLR-/-小鼠，7 周齡，購于北京維通達生物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0002。動物飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學動物中心動物屏障系統(tǒng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度、濕度和換氣次數(shù)由中央系統(tǒng)自動控制，溫度維持在20～26 ℃，相對濕度維持在40%～70%，光照為12 h 明暗交替。適應性喂養(yǎng)1 周，期間大鼠自由進食飲水。實驗方案符合天津中醫(yī)藥大學動物倫理委員會的規(guī)定，倫理編號：TCM-LAEC2022083。

1.2 主要儀器 小型臺式冷凍離心機（德國Eppendorf 公司），渦旋混合器（美國Labnet 公司），全自動生化儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司），熒光顯微鏡（德國蔡司公司），-80 ℃冰箱（日本Sanyo 公司）；AB sciex6500+（美國SCIEX 公司）。

1.3 主要藥品與試劑 HSYA（悅康藥業(yè)集團股份有限公司），AST、ALT、TG、TC 和LDL-C 全自動生化試劑盒（深圳邁瑞生物醫(yī)療股份有限公司，批號：140222011、140121004、141720007、141621008、142020006），辛伐他?。ū本┧魅R寶公司，批號：1109F021），異丙醇（天津市風船化學試劑科技有限公司，批號：20200722）。

1.4 分組與干預 適應性喂養(yǎng)1 周后，將28 只雄性LDLR-/-小鼠分為對照組（n=5）與高脂組（n=23）。對照組喂養(yǎng)普通飼料，高脂組喂養(yǎng)高脂飼料（TD88137），高脂飼料喂養(yǎng)6 周后，全自動生化儀檢測小鼠血清中LDL-C 含量，根據LDL-C 水平平均分為4 組，即模型組、辛伐他汀組、HSYA 低劑量（3.8 mg/kg）組、HSYA 高劑量（7.6 mg/kg）組。對照組、模型組腹腔注射生理鹽水，HSYA 低劑量組、HSYA 高劑量組均腹腔注射相應劑量HSYA，辛伐他汀組灌胃給藥，給藥11 周，給藥期間同時給予高脂飼料飼養(yǎng)。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 全自動生化儀檢測小鼠血清中ALT、AST、TG、TC、LDL-C 含量 將小鼠全血置于離心機離心，離心條件為4 ℃，3 500 r/min，離心15 min，分離血清，離心半徑為10 cm，使用全自動生化分析儀檢測小鼠血清中AST、ALT、TG、TC、LDL-C 含量。

1.5.2 蘇木精-伊紅（HE）染色 將小鼠肝臟用10%的福爾馬林進行固定，固定時間為48 h，然后將其用石蠟進行包埋處理后，切成厚度為5 μm 的切片，將切片進行HE 染色，用光學顯微鏡對染色后的切片進行觀察。

1.5.3 油紅O 染色 將肝臟組織固定，切片厚度為5 μm。油紅O 染色法進行肝組織染色，并在顯微鏡下觀察肝細胞脂質蓄積病理學變化。

1.5.4 血清脂質組學研究 血清樣本處理：取100 μL血清于1.5 mL 的離心管中，加入300 μL 預冷的異丙醇，渦旋5 min 后，放入-20 ℃冰箱孵育1 h，14 000 r/min，4 ℃離心20 min（離心半徑為10 cm），取上清至進樣小瓶，待測。質控樣品（QC）樣本：從每個樣本中取10 μL 血清至1.5 mL 的離心管中，渦旋5 min，加2 倍體積的異丙醇，同法處理，制備QC樣本。

實驗條件：儀器采用AB sciex6500+，方法為三重四極質譜儀的多反應監(jiān)測（MRM），每個樣品分別采用正負兩種模式分析（不同模式監(jiān)控不同離子對）。使用ACQUITY UPLC BEH C8色譜柱（Waters，1.7 μm，2.1 mm×100 mm）進行液相色譜分離。流動相由水相（A）和有機相（B）組成，A 相為水：甲醇：乙腈（3∶1∶1）+5 mmol/L 醋酸銨（質譜級），B 相為異丙醇+5 mmol/L 醋酸銨。梯度洗脫設置為：0～0.5 min，20%B；0.5 ～1.5 min，20%～40%B；1.5 ～3 min，40%～60%B；3～13 min，60%～100%B；13～14 min，100%B；流速0.3 mL/min，進樣量為2 μL。質譜（MS）通用參數(shù)設置為：氣溫400 ℃，離子噴霧電壓5 500 V，噴霧氣（GS1）、輔助加熱氣（GS2）均為50 psi，氣簾氣為35 psi。

數(shù)據處理：采用OS 軟件進行峰識別、脂質鑒定、峰提取、峰對齊及定量等處理，提取得到的數(shù)據。對OS 提取得到的數(shù)據，進行總峰面積歸一化處理。將得到的數(shù)據矩陣導入SIMCA-P 14.1 軟件，進行主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判別分析（OPLSDA）、置換檢驗等多元統(tǒng)計分析。篩選差異代謝物的通用標準為：變量投影重要性值（VIP）＞1，同時P＜0.05。其中P來源于單變量分析方法（t檢驗），而VIP來源于多變量分析方法（OPLS-DA 模型），物質的VIP越大，說明該物質對造成組間差異的貢獻度越大。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析進行組間比較，方差齊時選用LSD 檢驗方法，方差不齊時選用Dunnett’s T3 檢驗方法，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HSYA 對高脂血癥LDLR-/-小鼠血脂含量的影響 與對照組比較，模型組LDLR-/-小鼠血清中LDL-C、TC、TG 含量升高（P＜0.05）。與模型組比較，HSYA 低、高劑量組LDLR-/-小鼠血清中LDL-C、TC、TG 含量降低（P＜0.05）。結果表明，HSYA 可以降低高脂血癥LDLR-/-小鼠血清中LDL-C、TC、TG 含量，發(fā)揮降低血脂的作用。見表1。

表1 HSYA 對高脂血癥LDLR-/-小鼠LDL-C、TC、TG含量的影響（±s）mmol/L

表1 HSYA 對高脂血癥LDLR-/-小鼠LDL-C、TC、TG含量的影響（±s）mmol/L

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別動物數(shù)LDL-CTCTG對照組52.05±0.546.70± 1.17 1.12±0.34模型組68.64±3.15* 25.53±10.08* 3.70±1.86*辛伐他汀組64.16±1.73# 11.58± 4.33# 1.93±1.11#HSYA 低劑量組52.72±0.65#7.81± 2.00# 1.41±1.59#HSYA 高劑量組62.79±0.98#6.91± 3.39# 0.80±0.30#

2.2 HSYA 對高脂血癥LDLR-/-小鼠血清中ALT、AST 含量的影響 與對照組比較，模型組LDLR-/-小鼠血清中ALT、AST 含量升高（P＜0.05）。與模型組比較，HSYA 低劑量組LDLR-/-小鼠血清中ALT、AST含量降低（P＜0.05），HSYA 高劑量組LDLR-/-小鼠血清中ALT、AST 含量有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結果表明，低劑量HSYA 可以降低高脂血癥LDLR-/-小鼠血清中ALT、AST 含量，減輕高脂血癥引起的LDLR-/-小鼠肝臟損傷。見表2。

表2 HSYA 對高脂血癥LDLR-/-小鼠血清中ALT、AST含量的影響（±s）U/L

表2 HSYA 對高脂血癥LDLR-/-小鼠血清中ALT、AST含量的影響（±s）U/L

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別動物數(shù)ALTAST對照組535.68± 5.6761.16± 3.63模型組6419.78±138.26*393.73±112.49*辛伐他汀組6174.63± 68.87#190.63± 49.36#HSYA 低劑量組5113.24± 77.80#163.20± 65.52#HSYA 高劑量組6231.81±142.72374.37±290.18

2.3 HSYA 對高脂血癥LDLR-/-小鼠肝臟病理形態(tài)的影響 對照組LDLR-/-小鼠肝細胞形態(tài)正常，細胞內無脂滴分布，肝索排列整齊，肝竇清晰。模型組LDLR-/-小鼠可見肝組織脂肪變性明顯，出現(xiàn)大小不等的脂滴浸潤，肝細胞排列紊亂。HSYA 低、高劑量組LDLR-/-小鼠脂滴浸潤減少，肝細胞圍繞中央靜脈排列規(guī)則，肝細胞結構完整，脂肪變性改善。見圖1。

圖1 各組LDLR-/-小鼠肝臟組織HE 染色結果（×100）

2.4 HSYA 對LDLR-/-小鼠肝臟脂肪變性的影響 對照組LDLR-/-小鼠肝臟組織中未見橘紅色脂滴；模型組肝臟組織內出現(xiàn)大量橘紅色脂滴，體積較大，且部分脂滴融合成片，提示肝組織內存在大量脂質蓄積；HSYA 各劑量組LDLR-/-小鼠肝臟組織內脂滴密度有所減少，脂質蓄積情況得到改善。見圖2。

圖2 各組LDLR-/-小鼠肝臟組織油紅O 染色結果（×100）

2.5 HSYA 對高脂血癥LDLR-/-小鼠血清脂質含量的影響 脂質亞類相對含量分析結果顯示，與對照組比較，模型組LDLR-/-小鼠血清中磷脂酸（PA）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰甘油（PG）、磷脂酰肌醇（PI）、二氫神經酰胺（DCER）、己糖神經酰胺（HCER）、乳糖神經酰胺（LacCer）、葡萄糖基神經酰胺（GluCer）、二酰甘油（DAG）、鞘磷脂（SM）、TG 等含量升高（P＜0.05）。與模型組比較，HSYA 高劑量組LDLR-/-小鼠血清中磷脂酰膽堿（PC）、溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）、溶血磷脂酰肌醇（LPI）、PA、PE、PI、DCER、DAG 含量下降（P＜0.05）。初步表明HSYA 具有改善高脂血癥LDLR-/-小鼠血清脂質代謝紊亂的作用。見圖3。

圖3 HSYA 對高脂血癥LDLR-/-小鼠血清脂質含量的影響（±s，n=5 或6）

2.6 HSYA 對高脂血癥LDLR-/-小鼠血清脂質分子的影響 OPLS-DA 分析顯示，各組樣本代謝譜分離度較高，提示組間脂質代謝差異明顯（圖4A 與圖4C）。使用置換檢驗（n=200）對模型進行過擬合分析，以保證模型的有效性。結果顯示Q2均小于0，提示模型不存在過擬合現(xiàn)象（圖4B 與圖4D），模型可以較好地解釋各組樣本間的差異。

圖4 各組OPLS-DA 得分圖和置換檢驗擬合圖

經分析，模型組和對照組篩選的差異性脂質分子（VIP＞1，P＜0.05）共有14 種，其中FFA（20∶2）呈下降趨勢，升高的脂質分子有13 種，根據亞類進行歸屬，可分為PE 類5 個、FFA 類1 個、PI 類3 個、PG 類3 個、PA 類1 個。其中HSYA 治療后與模型組出現(xiàn)相反趨勢的脂質分子有19 種，具有差異性的脂質分子包括PE（18∶0/18∶1）、PE（18∶0/18∶2）、PE（18∶0/20∶3）、PE（18∶0/20∶4）、PE（O-18∶0/18∶1）、PE（O-18∶0/20∶4）、LPE（18∶1）、LPE（20∶4）、FFA（22∶4）、PI（18∶0/18∶2）、PI（16∶0/18∶1）、PI（18∶1/18∶1）、LPI（18∶0）、PG（18∶1/16∶1）、PG（18∶1/18∶1）、PG（18∶1/18∶2）、PA（18∶1/18∶1）（VIP＞1，P＜0.05），其中FFA（20∶2）、FFA（22∶5）（VIP＞1，P＞0.05）差異無統(tǒng)計學意義，提示HSYA 可以通過調節(jié)LDLR-/-小鼠血清中PE、LPE、FFA、PI、LPI、PG、PA 等脂質分子改善高脂血癥LDLR-/-小鼠脂質代謝紊亂情況。見圖5。

圖5 HSYA 對高脂血癥LDLR-/-小鼠血清脂質分子的影響（±s，n=5 或6）

3 討論

高脂血癥是一種脂質代謝紊亂性疾病，被認為是發(fā)生代謝綜合征和增加動脈粥樣硬化風險的主要因素之一[17]。目前可以通過調節(jié)血脂活性成分和降低血脂，改善肝臟脂質蓄積和脂肪變性，保護肝功能，從而達到治療效果[18]。能量攝入過多與消耗減少失衡是導致高脂血癥的主要原因，持續(xù)攝入高能量、高脂肪食物可能會引起脂質代謝紊亂，并且會誘導慢性代謝疾病。高膽固醇飲食是導致高脂血癥的主要危險因素[19]，通過高脂飼料喂養(yǎng)構建高脂血癥小鼠模型是目前用來篩選或評價降血脂藥物的常用方法[20-21]。本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)造成小鼠脂質代謝異常，構建小鼠高脂血癥模型，檢測小鼠血清中TC、TG、LDL-C、ALT、AST 含量，觀察肝臟組織病理變化，研究HSYA 對高脂血癥LDLR-/-小鼠血脂代謝異常的影響。結果顯示，與對照組比較，模型組LDLR-/-小鼠血清中TC、TG、LDL-C 含量升高，與相關文獻報道一致，證明LDLR-/-小鼠高脂血癥模型建立成功。肝臟是高脂血癥引起的血脂代謝紊亂直接連累的臟器，在血脂代謝中發(fā)揮重要作用。研究表明，高脂血癥能夠引起肝組織脂肪空泡和肝臟脂質蓄積，導致肝細胞出現(xiàn)不同程度損傷[22-23]。與對照組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST 含量升高，肝臟脂肪變性，脂質蓄積，表明高脂血癥LDLR-/-小鼠發(fā)生了肝臟損傷。與模型組比較，HSYA 兩組LDLR-/-小鼠血清中TC、TG、LDL-C、ALT、AST 含量降低，肝臟脂肪變性得到改善，脂質蓄積減少。以上結果表明，HSYA 對高脂血癥LDLR-/-小鼠脂質代謝紊亂和肝臟損傷具有一定防治作用。

脂質代謝紊亂可能引起機體代謝紊亂，導致脂質代謝效率低下，從而誘導肥胖與血脂異常，并導致高脂血癥的發(fā)生[24]。本研究通過脂質亞類結果分析，初步明確HSYA 對高脂血癥LDLR-/-小鼠血清中脂質代謝紊亂具有治療作用。高脂血癥與甘油磷脂代謝紊亂之間呈正相關關系[25-26]。甘油磷脂可以根據其取代基分為PC、PG、PE[27]。甘油磷脂代謝在炎癥性疾病和高脂血癥發(fā)展中起關鍵作用[28]。與對照組比較，模型組LDLR-/-小鼠血清中與甘油磷脂代謝相關的脂質異常增多，如PE（18∶0/18∶1）、PE（18∶0/20∶3）、PE（18∶0/20∶4）、PE（O-18∶0/18∶1）、PE（O-18∶0/20∶4）。同時發(fā)現(xiàn)LDLR-/-小鼠血清中甘油磷脂的種類和相對含量均高于其他脂質，與模型組比較，HSYA 組LDLR-/-小鼠血清中PE（18∶0/18∶1）、PE（18∶0/18∶2）、PE（18∶0/20∶3）、PE（18∶0/20∶4）、PE（O-18∶0/18∶1）、PE（O-18∶0/20∶4）的水平降低。HSYA 除通過調節(jié)PE 外，還可以通過對血清中LPE、PG、DAG 和PI進行調節(jié)影響甘油磷脂代謝，表明HSYA 在調節(jié)脂質紊亂中發(fā)揮關鍵作用，從而抑制高脂血癥的進展。

綜上所述，本研究通過高脂飼料模擬臨床高脂血癥病理狀態(tài)，在明確HSYA 具有治療高脂血癥LDLR-/-小鼠作用的基礎上，運用脂質組學技術闡明了HSYA 對高脂血癥LDLR-/-小鼠血清脂質代謝的影響，發(fā)現(xiàn)HSYA 通過調節(jié)甘油磷脂代謝改善高脂血癥LDLR-/-小鼠脂質代謝紊亂，進一步豐富了其治療高脂血癥LDLR-/-小鼠的作用機制，為其臨床應用提供了新依據。