流感病毒性肺炎線粒體相關(guān)生物標(biāo)志物識(shí)別及銀翹敗毒散潛在作用機(jī)制

吳貞琳，吳煜佳，張悅瑤，馮文文，劉金元，徐培平*

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué) 科技創(chuàng)新中心，廣東 廣州 510405

2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405

流感病毒性肺炎（influenza viral pneumonia，IVP）是一種由甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）感染引起的肺部炎癥，會(huì)導(dǎo)致肺部通氣功能障礙，并具有較高的感染率和死亡率[1]。IVP 的治療策略側(cè)重于癥狀的緩解（如使用糖皮質(zhì)激素）和抗病毒治療（如使用奧司他韋）[2]。由于IAV 表現(xiàn)出抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)化病毒的持續(xù)變異，導(dǎo)致對(duì)抗病毒藥物的耐藥性和嚴(yán)重的藥物不良反應(yīng)[3]。而中醫(yī)藥已被廣泛用于治療IVP[4]。

銀翹敗毒散（Yinqiao Anti-infective Powder，YQAIP）是一種中藥復(fù)方，由銀翹散、麻杏石甘湯、荊防敗毒散、柴葛解毒湯、白虎湯5 個(gè)經(jīng)典方加減而成，組成中藥有19 種：白芍、薄荷、蒼術(shù)、柴胡、川芎、防風(fēng)、茯苓、葛根、廣藿香、金銀花、荊芥、桔梗、連翹、麻黃、羌活、升麻、前胡、知母、生石膏。銀翹敗毒散在臨床上用于治療上呼吸道病毒感染和病毒性肺炎[5-8]，其組方已獲得國(guó)家發(fā)明專利（專利號(hào)：ZL2019111180871），但其治療IVP 的作用機(jī)制尚未闡明。

生物信息學(xué)是一門利用生物學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和信息技術(shù)來(lái)分析生物測(cè)序數(shù)據(jù)集以幫助解決生物問(wèn)題的學(xué)科。測(cè)序技術(shù)的顯著進(jìn)步使生物信息學(xué)在許多領(lǐng)域應(yīng)用于藥物靶點(diǎn)的識(shí)別和驗(yàn)證成為可能[15]。通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)識(shí)別疾病中潛在的生物標(biāo)志物可以幫助醫(yī)生預(yù)測(cè)疾病預(yù)后和對(duì)治療的反應(yīng)[16-17]。例如，差異基因表達(dá)分析[15]和機(jī)器學(xué)習(xí)算法［如隨機(jī)森林（random forest，RF）模型、支持向量機(jī)（support vector machines，SVM）模型和拉索回歸（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）分析］用于分析病理過(guò)程和相關(guān)特征基因，以識(shí)別潛在的生物標(biāo)志物[18]。

本研究使用4 個(gè)IVP 相關(guān)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集（GSE63786、GSE37572、GSE43302、GSE97555），并使用機(jī)器學(xué)習(xí)算法分析線粒體基因表達(dá)數(shù)據(jù)，鑒定識(shí)別與IVP 和線粒體相關(guān)的關(guān)鍵基因。通過(guò)計(jì)算機(jī)分子對(duì)接模擬分析銀翹敗毒散中1 831 種活性成分與關(guān)鍵基因的結(jié)合作用，并進(jìn)行銀翹敗毒散體內(nèi)抗IVP 作用及對(duì)相關(guān)線粒體關(guān)鍵基因的影響研究，探討銀翹敗毒散治療IVP 可能的線粒體相關(guān)機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 藥物

銀翹敗毒散由19 味中藥組成：白芍10 g、薄荷5 g、蒼術(shù)10 g、柴胡10 g、川芎10 g、防風(fēng)10 g、茯苓15 g、葛根15 g、廣藿香10 g、金銀花15 g、荊芥10 g、桔梗10 g、連翹15 g、麻黃10 g、前胡10 g、羌活10 g、升麻10 g、知母10 g，生石膏30 g，所有藥材飲片均購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房，由藥學(xué)室胡英杰研究員鑒定，見(jiàn)表1。將銀翹敗毒散的組成中藥飲片放入1 000 mL 燒杯中，加入純水至藥物表面上方約5 cm 處，在水中浸泡30 min，用大火（240 ℃左右）煮沸，并在小火（60 ℃左右）下保持沸騰30 min。收集藥液，繼續(xù)加入適量純水煮沸15 min，合并2 次煮沸的溶液，過(guò)濾濃縮至300 mL（藥物質(zhì)量濃度0.7 g/mL），4 ℃保存?zhèn)溆谩＠晚f林購(gòu)自浙江瑞新藥業(yè)股份有限公司（批號(hào)20230206）；奧司他韋膠囊購(gòu)自羅氏制藥有限公司（批號(hào)M1050）。

表1 銀翹敗毒散組成中藥的基原及其活性成分?jǐn)?shù)量Table 1 Origin and active ingredients quantity of traditional Chinese medicine composed of YQAIP

1.2 試劑、病毒和動(dòng)物

放射免疫沉淀緩沖液（RIPA，中國(guó)Exon 生物技術(shù)公司）；抗Pnpt1（批號(hào)37838）、抗Mthfd2（批號(hào)27411-1）抗體均購(gòu)自美國(guó)Signalway Antibody LLC.；抗Lactb 抗體（批號(hào)A13145-1）購(gòu)自中國(guó)博斯特生物科技有限公司；抗磷酸甘油醛脫氫酶（reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)KC-5G4，中國(guó)康辰生物技術(shù)公司）。聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（美國(guó)Millipore Corporation）。甲型流感病毒（A/FM/1/47H1N1，F(xiàn)M1）由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心捐贈(zèng)，通過(guò)在9 d 大的雞胚中傳代48 h，用Reed-Muench 法測(cè)定小鼠 FM1 半數(shù)致死劑量（LD50）＝1×10-3.6。病毒在使用前儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中。雌性BALB/c 小鼠，SPF 級(jí)，體質(zhì)量13～15 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心（質(zhì)量合格證號(hào)440072000122745）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合《廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，并經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物福利委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)20230328002）。

1.3 儀器

ELx800 酶聯(lián)檢測(cè)儀（美國(guó)Bio-Tek 公司）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）檢測(cè)試劑盒（上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司）；PrimeScriptTM 第1 鏈cDNA 合成試劑盒（日本Takara 公司）；化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（天津冠橋醫(yī)療器械有限公）。

1.4 生物信息學(xué)研究材料

芯片數(shù)據(jù)集從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載。機(jī)器學(xué)習(xí)算法采用相關(guān)R 包（R＝4.03）。銀翹敗毒散藥物成分及結(jié)構(gòu)來(lái)自中醫(yī)藥整合藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)計(jì)算研究平臺(tái)（TCMIP，http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/home/login/login.html ） 和 PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（ http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；Pymol 2.3 軟件；Autodock vina 1.1 軟件。線粒體基因數(shù)據(jù)庫(kù)（MitoCarta 3.0 database，https://www.broadinstitute.org/mitocarta/mitocarta30-inventory-mammalian-mitochondrial-proteins-andpathways）。蛋白配體相互作用分析軟件Ligplot＋v2.2 。 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（ PDB ， https://www.rcsb.org/）。分子對(duì)接軟件AutoDock Vina 1.0。

2 方法

2.1 線粒體基因集下載

從MitoCarta 3.0 數(shù)據(jù)庫(kù)中收集了1 140 只小鼠的線粒體相關(guān)基因[19]。該數(shù)據(jù)庫(kù)包括149 個(gè)線粒體功能術(shù)語(yǔ)，如線粒體凋亡、線粒體自噬、線粒體免疫、線粒體氧化應(yīng)激、線粒體電子轉(zhuǎn)移、線粒體銅代謝等。

大腸癌是消化道常見(jiàn)惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率居第3位［1］。為有效提高大腸癌生存率，衛(wèi)生部頒布的結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2010版)［2］已將術(shù)后化療列入了晚期或轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的輔助治療原則，且術(shù)后化療為1個(gè)療程連續(xù)6次用藥的方案。面對(duì)連續(xù)多次化療的化療方案，患者不僅會(huì)擔(dān)心化療反應(yīng)和不良反應(yīng)，也會(huì)產(chǎn)生負(fù)性心理狀態(tài)并發(fā)生累積效應(yīng)，嚴(yán)重影響患者治療和康復(fù)效果。本文通過(guò)對(duì)結(jié)腸癌術(shù)后連續(xù)多次入院化療患者的焦慮狀況進(jìn)行連續(xù)評(píng)估，旨在了解患者在1個(gè)療程內(nèi)每次接受化療前的焦慮狀況，從而為結(jié)腸癌術(shù)后化療患者的心理評(píng)估及護(hù)理對(duì)策提供科學(xué)依據(jù)。

2.2 通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)算法篩選IVP 潛在的線粒體相關(guān)標(biāo)志物

從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得4 個(gè)IVP 相關(guān)基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集（GSE63786、GSE37572、GSE43302、GSE97555）。GSE63786 作為分析的測(cè)試集，GSE37572、GSE43302 和GSE97555 作為驗(yàn)證集。數(shù)據(jù)集使用R 包“sva”和“l(fā)imma”進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。使用R 軟件包“l(fā)imma”分析組間差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）［|log2fold change (FC) |＝0.5，P＜0.05］。

4 種機(jī)器學(xué)習(xí)算法［RF、支持向量機(jī)（support vector machines，SVM）、分布式梯度增強(qiáng)模型（eXtreme gradient boosting，XGBoost）、廣義線性模型（generalize linear model，GLM）］基于GSE63786數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析。使用“DALEX” R 包的解釋函數(shù)來(lái)分析上述4 個(gè)模型，繪制殘差的分布圖，并基于測(cè)試集提取最佳模型。分析每個(gè)變量的顯著性，并選擇每個(gè)模型的前10 個(gè)最重要的解釋變量進(jìn)行進(jìn)一步研究[20]。使用“root-mean-square”方法建立預(yù)測(cè)IVP 發(fā)生的列線圖模型。通過(guò)決策曲線分析評(píng)價(jià)模型的診斷價(jià)值。在外部芯片驗(yàn)證集（GSE37572、GSE43302 和GSE97555）中驗(yàn)證。同時(shí)，使用“pROC” R 軟件包對(duì)top 10 基因進(jìn)行評(píng)估。

2.3 分子對(duì)接分析

從TCMSP（https://www.tcmsp-e.com/）、PubMed（ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/ ）、 中國(guó)知網(wǎng)（https://www.cnki.net/）數(shù)據(jù)庫(kù)搜索銀翹敗毒散組成藥物的活性成分[21]。3 種主要的線粒體晶體結(jié)構(gòu)蛋白已被確定為潛在的藥物靶點(diǎn)，從PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)下載其蛋白質(zhì)的3D 結(jié)構(gòu)（PDB 格式）。利用AutoDock Vina 軟件進(jìn)行分子對(duì)接模擬[22]。蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)包括 β-內(nèi)酰胺酶狀絲氨酸蛋白酶（serine betalactamase-like protein，Lactb，PDB：7V1Y；以13.91、10.98、15.60 nm 為中心的對(duì)接盒子）、多核苷酸磷酸化酶1（polynucleotide phosphorylase 1，Pnpt1；PDB：3U1K；以0.526 1、-2.225 5、-0.401 0 nm 為中心的對(duì)接盒子）和亞甲基四氫葉酸脫氫酶 2（methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 2，Mthfd2，PDB：6S4E；以9.857 5、1.939 9、0.186 0 nm 為中心的對(duì)接盒子）。使用AutoDockTools（v1.5.6）制備蛋白質(zhì)和分子。使用PyMOL（v2.3）軟件構(gòu)建分子圖譜[23]。使用Ligplot＋v2.2 分析蛋白質(zhì)與配體的相互作用[24]。

2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及給藥

將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、銀翹敗毒散組、奧司他韋組（10 mg/kg），每組10 只。經(jīng)過(guò)急毒實(shí)驗(yàn)，獲得小鼠對(duì)銀翹敗毒散的最大耐受劑量為120 g 生藥/kg，按銀翹敗毒散成人臨床劑量為3 g/(kg·d)，10 倍劑量（30 g/kg）設(shè)置為小鼠銀翹敗毒散中劑量，設(shè)置3 個(gè)劑量組即低劑量（15 g/kg）、中劑量（30 g/kg）、高劑量（60 g/kg）。對(duì)照組和模型組小鼠ig 蒸餾水，給藥體積20 mL/kg。

2.5 肺指數(shù)的測(cè)定

除對(duì)照組外，其他各組小鼠麻醉后滴鼻感染流感病毒A/FM/1/47（FM1，H1N1）15LD50的劑量。感染4 h 后，各組小鼠開(kāi)始ig 給藥，每天1 次，持續(xù)4 d，并在感染后第5 天斷頸處死小鼠，并收集肺樣本進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。測(cè)量小鼠體質(zhì)量和肺質(zhì)量，計(jì)算肺指數(shù)。

肺指數(shù)＝肺質(zhì)量/體質(zhì)量

2.6 生存保護(hù)實(shí)驗(yàn)

除對(duì)照組外，其他各組小鼠麻醉后滴鼻感染流感病毒A/FM/1/47（FM1，H1N1）5LD50的劑量。感染4 h 后，各組小鼠開(kāi)始ig 給藥，每天1 次，持續(xù)4 d。觀察小鼠死亡情況，15 d 內(nèi)存活者以15 d 計(jì)。

2.7 肺組織病理變化的檢測(cè)

取“2.5”項(xiàng)各組小鼠肺組織，將肺固定在10%福爾馬林中，包埋在石蠟中，切成5 μm 的切片，并用蘇木精和伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色。隨機(jī)選擇肺切片區(qū)域，并分別用光學(xué)顯微鏡放大100 倍。肺組織的病理評(píng)分以0～3 的半定量方式進(jìn)行分級(jí)[4]。

2.8 肺組織炎癥因子的測(cè)定

取“2.5”項(xiàng)各組小鼠肺組織按1∶10 比例加入PBS 緩沖液，進(jìn)行無(wú)菌研磨。將組織勻漿液3 000 r/min離心15 min，收集上清液。通過(guò)Bio-Tek ELx800酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定450 nm 處的吸光度（A）測(cè)定肺組織中TNF-α、IL-1β和IFN-γ的水平。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

2.9 實(shí)時(shí)定量PCR 測(cè)定肺組織相關(guān)基因的表達(dá)

取“2.5”項(xiàng)各組小鼠肺組織，使用Prime ScriptTM 第1 鏈cDNA 合成試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。病毒載量檢測(cè)A/FM/1/47H1N1 的基質(zhì)基因，其引物參考Liao等[25]報(bào)道。Pnpt1、Lactb、Mthfd2引物通過(guò)NCBI Primer-BLAST 設(shè)計(jì)。Pnpt1引物，正向：5’-CACTATGGAGTAGCGCAGGG-3’，反向：5’-CTGCAGTGTCACCTGACTGTA-3’；Lactb引物，正向：5’-TCCTATGTGAAAAGGAACTAAGAGA-3’，反向：5’-GAACTCCTCAGTCATTCCTCCT-3’；Mthfd2引物，正向：5’-TTATCATAGTGATGGAGAGCAGTT-3’，反向：5’-GGCCTGTGATCTCTCAGTGT-3’；內(nèi)參β-actin正向：5’-ACAGAGCCTCGCCTTTGC-3’，反向：5’-GATATCATCATCCATGGTGAGCTGG-3’。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)模式（2-ΔΔCt）分析PCR 產(chǎn)物表達(dá)水平。基因相對(duì)表達(dá)量（relative expression，RQ）與對(duì)照組結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化為1。

2.10 Western blotting 分析肺組織線粒體相關(guān)蛋白的表達(dá)

取“2.5”項(xiàng)各組小鼠肺組織用放射免疫沉淀緩沖液（RIPA）均化，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）樣品緩沖液裂解，煮沸，離心并收集上清液。4 ℃、12 000×g離心勻漿5 min。通過(guò)10% SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)樣品（50 μg），并將其轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。將膜浸泡在甲醇中1～2 min，分別加入抗Pnpt1（1∶200）、抗Lactb（1∶500）、抗Mthfd2（1∶300）和抗GAPDH（1∶5 000）抗體，過(guò)夜。使用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒進(jìn)行免疫測(cè)定。將相對(duì)蛋白質(zhì)水平標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH。通過(guò)使用凝膠分析軟件（GelPro5.0，Media Cybernetics，Bethesda，美國(guó)）計(jì)算每個(gè)區(qū)域的平均光密度來(lái)進(jìn)行量化。

2.11 統(tǒng)計(jì)分析

使用統(tǒng)計(jì)軟件PASW（版本18.0：IBM SPSS，美國(guó)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用Wilcoxon 檢驗(yàn)對(duì)各組之間基因表達(dá)水平的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行多組比較，進(jìn)行LSD 檢驗(yàn)以確定組間的差異。GraphPad Prism 軟件（版本5.0）用于繪圖。

3 結(jié)果

3.1 基于機(jī)器學(xué)習(xí)算法的線粒體關(guān)鍵基因識(shí)別與驗(yàn)證

測(cè)試集（GSE63786）中包含36 個(gè)IVP 和42 個(gè)對(duì)照小鼠肺組織的mRNA 表達(dá)譜。按照Padj＜0.05和|log2FC|＞0.5 標(biāo)準(zhǔn)篩選對(duì)照組和IVP 組之間的DEGs 與線粒體的相關(guān)基因。在對(duì)IVP 的線粒體基因和DEGs 進(jìn)行聯(lián)合分析后，篩選出190 個(gè)基因作為IVP 中的線粒體相關(guān)差異基因（mitochondriarelated differential genes，MRDGs），其中125 個(gè)下調(diào)基因和65 個(gè)上調(diào)基因（圖1）。

圖1 線粒體相關(guān)差異基因火山圖Fig.1 Volcano plot of mitochondrial related differentially expressed genes

為了進(jìn)一步縮小線粒體關(guān)鍵基因的范圍，建立了4 個(gè)基于機(jī)器學(xué)習(xí)算法的模型。選擇190 個(gè)MRDGs 作為構(gòu)建機(jī)器學(xué)習(xí)模型的候選基因。在GSE63786 數(shù)據(jù)集上進(jìn)行RF、SVM、XGB 和GLM模型分析。如圖2 所示，GLM 模型被確定為最差的模型，因?yàn)槠渚哂泻艽蟮臉颖練埐睿▓D2-A、B），并且曲線下面積（area under curve，AUC）值小于0.7（圖2-D）。SVM 模型被認(rèn)為是最好的模型，因?yàn)槠渚哂凶钚〉臉颖練埐?，AUC 值為1.000（圖2-D）。最后從RF、SVM 和XGB 模型中選擇30 個(gè)最重要基因在驗(yàn)證集中進(jìn)一步分析（圖2-C）。在驗(yàn)證集中，發(fā)現(xiàn)IVP 組中只有Lactb、胞苷單磷酸激酶2（cytidine monophosphate kinase 2，Cmpk2）、Pnpt1、Mthfd2、線粒體核糖體蛋白21（mitochondrial ribosomal protein 21，Mrpl21）、Mrpl45和線粒體內(nèi)膜翻譯酶23（translatase of inner mitochondrial membrane 23，Timm23）表達(dá)水平增加，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3-A～C）。隨后進(jìn)行接受者操作特性曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析，以確認(rèn)上述7 個(gè)關(guān)鍵基因的診斷意義（圖3-D～F）。ROC 值通常在0.5～1.0。該值越接近1，模型估計(jì)越準(zhǔn)確。在驗(yàn)證集中，有3 個(gè)關(guān)鍵基因的AUC 值均大于0.9，ROC 值范圍為0.920～1.000（圖3-D～F）。結(jié)果表明，在3 個(gè)驗(yàn)證數(shù)據(jù)集中，這7 個(gè)關(guān)鍵基因的預(yù)測(cè)精度非常高。

圖2 機(jī)器學(xué)習(xí)模型的構(gòu)建和評(píng)估Fig.2 Construction and evaluation of machine learning models

圖3 驗(yàn)證集GSE37572、GSE43302 和GSE97555 中關(guān)鍵基因診斷價(jià)值的鑒定和驗(yàn)證Fig.3 Identification and validation of diagnostic value of key genes in validation sets GSE37572, GSE43302 and GSE97555

3.2 預(yù)測(cè)銀翹敗毒散治療IVP 可能的線粒體潛在機(jī)制

通過(guò)檢索TCMSP、PubMed、中國(guó)知網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫(kù)，從銀翹敗毒散中共篩選出1 831 種活性成分（表1）。利用分子對(duì)接分析，基于7 種IVP 相關(guān)的線粒體生物標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)銀翹敗毒散治療IVP 潛在機(jī)制。選擇了3 種具有3D 蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)（Lactb、Pnpt1 和Mthfd2）進(jìn)行分子對(duì)接分析，并計(jì)算銀翹敗毒散活性成分與3 種潛在靶蛋白的結(jié)合能。1 093 個(gè)銀翹敗毒散生物活性成分對(duì)關(guān)鍵基因Lactb、Pnpt1和Mthfd2具有良好的結(jié)合親和力（＜-5.0 kcal/mol，1 kcal＝4.2 kJ）。表2 列舉了具有最高結(jié)合能（≤-9.0 kcal/mol）的小分子化合物，它們對(duì)Lactb、Pnpt1和Mthfd2表現(xiàn)出較高的結(jié)合親和力，這些可能是潛在的IVP 抑制劑。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，化合物的結(jié)合自由能大于-5.5 kcal/mol，表明該化合物處于非活性狀態(tài)[26]。Lactb-eugenin、Pnpt1-穗花杉雙黃酮和Mthfd2-原金絲桃素復(fù)合物的結(jié)合能分別是-9.8、-11.4 和-10.4 kcal/mol。3 個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)和藥物的最佳結(jié)合模式（最佳結(jié)合能）如圖4 所示。Eugenin 和Lactb催化結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合模式分析結(jié)果表明，其殘基Asp286、Thr486、Gly488、Phe287、Ser527、Lys394、Val528、Ser493、Thr325、His222和Ser453 參與了氫鍵相互作用并貢獻(xiàn)了14 個(gè)氫鍵（圖4-A、B）。穗花杉雙黃酮與Pnpt1的結(jié)合模式表明，Ile418、Lys456、Arg192、Asn215、Asn416 和Asp420 6 個(gè)氨基酸殘基參與了7 個(gè)氫鍵的形成（圖4-C、D）。原金絲桃素和Mthfd2之間的相互作用表明，殘基Lys88、Val274 和Ile276 與原金絲桃堿處于氫鍵接觸，并且它們共享4 個(gè)氫鍵（圖4-E、F）。

圖4 Lactb、Mthfd2、Pnpt1 和活性成分之間的相互作用Fig.4 Interactions between Lactb, Mthfd2, Pnpt1 and active ingredients

表2 銀翹敗毒散活性成分與3 種線粒體關(guān)鍵基因分子對(duì)接情況 (結(jié)合能≤-9.5 kcal·mol-1)Table 2 Docking status of active ingredients in YQAIP with three key genes of mitochondria (binding energy ≤ -9.5 kcal·mol-1)

3.3 銀翹敗毒散對(duì)IVP 小鼠肺部損傷的影響

為了評(píng)估銀翹敗毒散對(duì)IVP 小鼠的治療作用，本研究進(jìn)行了肺指數(shù)和生存保護(hù)作用研究。模型組小鼠肺部出現(xiàn)炎癥，細(xì)支氣管和肺間質(zhì)有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管積液，大面積出血（圖5，紅色箭頭所示）。相比之下，3 個(gè)劑量銀翹敗毒散給藥后，這些病變得到了不同程度的改善（圖5-A、B）。與模型組相比，銀翹敗毒散中、高劑量組和奧司他韋組小鼠的肺指數(shù)及病毒載量顯著下降（P＜0.01、0.001）（圖5-C、D）。生存保護(hù)實(shí)驗(yàn)表明，銀翹敗毒散高劑量組小鼠存活率為50%，中、高劑量組能延長(zhǎng)小鼠生存時(shí)間，與模型組相比差異顯著（P＜0.05、0.01、0.001）（圖5-E、F）。結(jié)果表明，銀翹敗毒散可以有效改善IAV 引起的肺損傷。

圖5 銀翹敗毒散對(duì)IVP 小鼠肺部損傷的影響 (n = 10）Fig.5 Effect of Yinqiao Xidu Powder on lung injury of IVP mice (n = 10)

3.4 銀翹敗毒散對(duì)IVP 小鼠肺組織細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響

流感病毒引起的肺部炎癥和隨后的急性肺損傷與多種促炎細(xì)胞因子的過(guò)度分泌密切相關(guān)。IL-1β、IFN-γ和TNF-α 是炎癥過(guò)程中的關(guān)鍵促炎細(xì)胞因子。如圖6所示，模型組小鼠肺組織IL-1β、IFN-γ和TNFα 水平顯著增加；銀翹敗毒散中、高劑量能顯著抑制促炎細(xì)胞因子IL-1β、IFN-γ和TNF-α 的過(guò)度分泌。

圖6 銀翹敗毒散對(duì)IVP 小鼠肺組織TNF-α (A)、IL-1β (B)、IFN-γ (C) 水平的影響 (±s , n=10)Fig.6 Effect of YQAIP on levels of TNF-α (A), IL-1β (B) and IFN-γ (C) in lung tissue of IVP mice (±s , n=10)

3.5 銀翹敗毒散對(duì)IVP 小鼠肺組織線粒體相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

如圖7 所示，模型組小鼠肺組織Lactb、Pnpt1和Mthfd2mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著增加，而銀翹敗毒散高劑量（60 g/kg）可顯著抑制Lactb、Pnpt1和Mthfd2mRNA 和蛋白的表達(dá)（圖7-A～C）（P＜0.01、0.001）。

圖7 銀翹敗毒散對(duì)IVP 小鼠肺組織線粒體相關(guān)基因mRNA (A) 和蛋白 (B) 表達(dá)水平的影響 (±s , n=6)Fig.7 Effect of YQAIP on mRNA (A) and protein (B) expression levels of mitochondria-related genes in lung tissue of IVP mice (±s , n=6)

4 討論

本研究使用4 種機(jī)器學(xué)習(xí)方法（RF、SVM、GLM 和XGB）對(duì)GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)的4 個(gè)小鼠IVP 數(shù)據(jù)集鑒定識(shí)別了與IVP 發(fā)病相關(guān)的線粒體關(guān)鍵基因。共識(shí)別出Lactb、Cmpk2、Pnpt1、Mthfd2、Mrpl21、Mrpl45和Timm237 個(gè)關(guān)鍵基因，它們可能在IVP的進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并被確定為IVP 的潛在治療靶點(diǎn)。

Lactb是一種參與肽聚糖合成的線粒體膜蛋白[27]。Lactb可在膜間空間形成纖維狀線粒體膜，影響磷脂酰絲氨酸向磷脂酰乙醇胺的轉(zhuǎn)化，并直接或間接調(diào)節(jié)線粒體磷脂代謝[28]。Lactb可誘導(dǎo)線粒體ROS 的產(chǎn)生、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）水平增加和線粒體膜電位的降低，導(dǎo)致DNA損傷、線粒體功能障礙和/或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡[29]。同時(shí)，Lactb誘導(dǎo)核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路促進(jìn)NF-κB 介導(dǎo)的促炎反應(yīng)[30]。

Cmpk2是一種線粒體核苷酸激酶[31]。Cmpk2依賴性mtDNA 合成對(duì)于暴露于NLRP3 激活劑后產(chǎn)生氧化的mtDNA 片段是必要的[32]。作為一種線粒體蛋白，Cmpk2在登革熱病毒（dengue virus，DENV）誘導(dǎo)的線粒體操作中至關(guān)重要[33]。在病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞器中，線粒體是觸發(fā)抗病毒免疫的關(guān)鍵細(xì)胞器，有時(shí)可能成為病毒逃避免疫監(jiān)視的目標(biāo)[34]。

Mrp由1 個(gè)小的28S 亞基和1 個(gè)大的39S 亞基組成。部分Mrp參與多種細(xì)胞過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、體外核糖體循環(huán)調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡[35]。Mrp通過(guò)線粒體翻譯和有絲分裂核糖體蛋白誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞凋亡和增殖[36]。病毒是一種特殊的細(xì)胞內(nèi)“寄生蟲(chóng)”，其生存取決于它們?cè)隗w內(nèi)復(fù)制的能力，病毒與真核細(xì)胞周期的所有階段都相互作用。許多病毒通過(guò)與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期過(guò)程的宿主因子相互作用來(lái)促進(jìn)復(fù)制[37]。

Mthfd2是一種與葉酸偶聯(lián)的線粒體代謝酶[38]。Mthfd2參與葉酸單碳代謝和四氫葉酸輔因子循環(huán)，為維持細(xì)胞活力和增殖提供重要的前體，可誘導(dǎo)磷脂酰肌醇-3- 羥激酶（ phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路的激活，該通路在細(xì)胞代謝中起著至關(guān)重要的作用[39]。Mthfd2介導(dǎo)的Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以有效調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，支持病毒感染細(xì)胞的自我更新和增殖。

Timm基因編碼一種伴侶蛋白，屬于進(jìn)化上保守的Timm 家族，其有助于蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)骄€粒體[40]。Timm23可以阻止疏水性前體的聚集，并引導(dǎo)蛋白質(zhì)通過(guò)線粒體膜，這與過(guò)氧化物酶體脂質(zhì)代謝途徑有關(guān)[41]。

Pnpt1是一種I 型干擾素誘導(dǎo)的核糖核酸外切酶，可介導(dǎo)mRNA 降解[42]。Pnpt1的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了細(xì)胞凋亡[43]。

這7 個(gè)線粒體關(guān)鍵基因均參與了細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、增殖、細(xì)胞凋亡等環(huán)節(jié)，與病毒復(fù)制與感染等進(jìn)展密切相關(guān)，因此，這7 個(gè)線粒體相關(guān)基因可能是IVP 的關(guān)鍵基因和潛在的治療靶點(diǎn)。

本研究在體內(nèi)評(píng)估了銀翹敗毒散對(duì)IVP 的治療作用及對(duì)線粒體關(guān)鍵基因的影響，并使用分子對(duì)接技術(shù)來(lái)篩選和鑒定銀翹敗毒散作用于線粒體關(guān)鍵基因的活性成分。結(jié)果表明，銀翹敗毒散對(duì)IAV 引起的病毒性肺炎具有一定的保護(hù)作用，能改善IVP 小鼠肺組織的炎癥反應(yīng)，降低炎癥因子水平。分子對(duì)接結(jié)果表明，銀翹敗毒散的活性成分對(duì)3 個(gè)線粒體關(guān)鍵基因Lactb、Pnpt1和Mthfd2具有中等至較強(qiáng)的結(jié)合親和力（-9.5～-10.9 kcal/mol）。銀翹敗毒散中的1 093 種活性成分可以下調(diào)這3 個(gè)線粒體關(guān)鍵基因的表達(dá)。IVP 小鼠肺組織中3 個(gè)線粒體基因Lactb、Pnpt1和Mthfd2mRNA 和蛋白水平明顯上調(diào)，而銀翹敗毒散能有效降低3 個(gè)線粒體基因表達(dá)水平。

5 結(jié)論

本研究使用生物信息學(xué)和機(jī)器學(xué)習(xí)算法鑒定了7 種與IVP 和線粒體相關(guān)的生物標(biāo)志物。通過(guò)體內(nèi)抗病毒實(shí)驗(yàn)和分子對(duì)接技術(shù)研究表明銀翹敗毒散可能通過(guò)丁子芽鞣素、原金絲桃素和穗花杉黃酮等活性成分作用于Lactb、Pnpt1和Mthfd2，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等生物學(xué)過(guò)程，并在介導(dǎo)抗IVP 作用中發(fā)揮作用。3個(gè)線粒體關(guān)鍵基因Lactb、Pnpt1和Mthfd2在IVP 小鼠肺組織中高表達(dá)，而銀翹敗毒散則能抑制這種高表達(dá)，這可能是銀翹敗毒散治療IVP 的潛在機(jī)制之一。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突