中藥皂苷類化合物生物轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

李憶紅，梁雨璐，解嘉琪，王 燦，黃建梅

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488

皂苷是由皂苷元與糖基通過糖苷鍵連接而成的糖苷類化合物，在水溶液中可形成肥皂狀泡沫，故得皂苷之名。皂苷類化合物廣泛分布于陸生植物中，少量存在于海綿、海星、珊瑚等海洋生物中[1]，皂苷按其苷元碳骨架結(jié)構(gòu)可分為三萜和甾體皂苷。三萜皂苷在豆科（甘草、黃芪等）、五加科（人參、三七等）、桔?？疲ń酃５龋?、遠(yuǎn)志科（遠(yuǎn)志等）、傘形科（柴胡等）和石竹科等植物中分布較多；甾體皂苷大部分分布于百合科（知母、重樓等）、薯蕷科（薯蕷等）和玄參科等植物中。皂苷在中藥中廣泛存在，具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗菌、解熱、鎮(zhèn)靜等生物活性[2]。與生物堿、黃酮等其他天然產(chǎn)物不同，皂苷原型成分口服后生物利用度相對較低，但通過生物轉(zhuǎn)化可以獲得生物利用度相對較高的次級皂苷和苷元，其生物學(xué)活性增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷藥效活性與人參皂苷分子糖基數(shù)量有關(guān)，如稀有人參皂苷具有更高的藥理活性，藥動學(xué)性質(zhì)優(yōu)于原型人參皂苷[3-4]，稀有人參皂苷與人參皂苷具有相同的母核結(jié)構(gòu)，只是糖基的數(shù)量不同，說明修飾皂苷分子中的糖基部分，對提高其藥理活性及生物利用度具有重要意義。

天然皂苷可以通過水解而獲得次級皂苷及其衍生物、苷元，常見的方法有物理（加熱）、化學(xué)（酸、堿水解）和生物轉(zhuǎn)化等方法，其中生物轉(zhuǎn)化包括腸道菌群轉(zhuǎn)化、微生物轉(zhuǎn)化和體外酶催化。酸水解反應(yīng)條件劇烈，易使苷元發(fā)生脫水、雙鍵移位和環(huán)合等結(jié)構(gòu)變化[5-6]，無法控制糖基的選擇性水解。另外，利用酸堿水解皂苷的方法副反應(yīng)產(chǎn)物較多，水解產(chǎn)物仍需進(jìn)一步處理。因此，近年來皂苷成分轉(zhuǎn)化生成次級皂苷及苷元的研究主要集中于生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，由于其反應(yīng)條件溫和，具有更強(qiáng)的位置選擇性和立體選擇性，被廣泛應(yīng)用于研究和生產(chǎn)中。生物轉(zhuǎn)化主要反應(yīng)類型包括糖基水解反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、羥基化及斷裂重排反應(yīng)等[7-8]，其中以糖基水解反應(yīng)應(yīng)用最為廣泛。本文結(jié)合國內(nèi)外近年研究成果，對不同類型的皂苷化合物通過生物轉(zhuǎn)化的方式水解糖基的文獻(xiàn)進(jìn)行整理，為后續(xù)皂苷定向修飾糖基的研發(fā)和利用的研究提供思路和參考。

1 三萜皂苷的生物轉(zhuǎn)化

1.1 四環(huán)三萜

1.1.1 人參皂苷 人參皂苷根據(jù)其苷元骨架可分為達(dá)瑪烷、奧克梯隆醇和齊墩果烷型，其中大多數(shù)人參皂苷母核結(jié)構(gòu)屬于達(dá)瑪烷型[9]，且是人參的主要活性成分，根據(jù)苷元羥基位置的不同進(jìn)一步將達(dá)瑪烷型人參皂苷分為原人參二醇（protopanaxadiol，PPD）和原人參三醇（protopanaxatriol，PPT）型，PPD 型人參皂苷的糖基位于達(dá)瑪烷的C-3 和C-20位，PPT 型人參皂苷的糖基位于C-6 和C-20 位[10]。人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg1等皂苷側(cè)鏈含有多個糖基，占人參總皂苷的80%以上，被認(rèn)為是人參皂苷的主要成分[11-12]。相比之下，次級人參皂苷F2、CK、Rg3、Rh2占人參總皂苷的比例不到0.1%[13]。綜合文獻(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)，人參皂苷的糖基水解反應(yīng)主要發(fā)生在C-3、C-6 和C-20 位，水解脫去葡萄糖基、鼠李糖基、呋喃型阿拉伯糖基和吡喃型阿拉伯糖基。人參皂苷在體內(nèi)主要的代謝途徑為逐級脫糖基，將PPD 型人參皂苷Rd、F2、Rg3、CK、Rh2與人源腸道菌群離體孵育培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rd 的主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為人參皂苷F2、Rg3、Rh2、CK 和PPD；人參皂苷F2主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為人參皂苷CK 和PPD；人參皂苷Rg3主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為人參皂苷Rh2和PPD；而人參皂苷Rh2和人參皂苷CK 又可以生成PPD[14-15]。離體大鼠腸道菌群對人參皂苷Rb1的水解也是逐級脫糖基的過程[16]。人參總皂苷在體內(nèi)腸道菌群中的代謝同離體腸道菌群一致，Guo 等[17]驗(yàn)證了腸道菌群轉(zhuǎn)化三七皂苷的過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在常規(guī)飼養(yǎng)大鼠血漿中檢測到人參皂苷F1、Rh2、CK 3 個次級皂苷和PPT，而在無菌大鼠血漿中未檢測到，因此推斷人參皂苷體內(nèi)的代謝基本規(guī)律為四糖皂苷→三糖皂苷→二糖皂苷→單糖皂苷→皂苷元[18]。

Chi 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，多種微生物協(xié)同作用可以通過人參皂苷Rd→人參皂苷F1→人參皂苷CK的途徑將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為人參皂苷CK、Rh2；通過人參皂苷Re→人參皂苷Rg2、Rg2→人參皂苷Rh1的途徑將人參皂苷Re 轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rh1。從韓國主食泡菜中提取的各種菌株，如LeuconostoccitreumLH1，可以很好地將PPD 型人參皂苷轉(zhuǎn)化為人參皂苷CK[20]。Kim 等[21]篩選出12 種菌株，其中M.trithecenlyticum可將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rh2。Zhou 等[22-23]研究表明，A.niger3.3883 和A.oryzae3.591 菌株的混合孢子液在7%海藻酸鈉培養(yǎng)基中能夠?qū)⑷藚⒃碥誖b1轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rd、Rg3，利用Lactobacillusparacaseisubsp. tolerans，可以水解人參皂苷Rg3中C-3 位葡萄糖基，獲得人參皂苷Rh2[24]。 Hu 等[25]利用來自Bifidobacterium adolescentisATCC15703 的β-葡萄糖苷酶研究人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化，以人參皂苷Rb1和Rd 為底物，人參皂苷Rb1的C-3 葡萄糖基部分水解生成絞股藍(lán)皂苷-XVII（gypenoside-XVII，Gyp-ⅩⅤⅡ），人參皂苷Rd 脫去C-3 外側(cè)葡萄糖基生成人參皂苷F2；人參皂苷Rb1脫去C-3 和C-20 外側(cè)葡萄糖基水解生成Gyp-XVII 和人參皂苷Rd。

人參皂苷結(jié)構(gòu)包括1～4 個糖苷鍵，常見的糖基有β-葡萄糖基、L-阿拉伯糖基和L-鼠李糖基。因此，通過使用特定糖苷酶（如α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶、α-L-吡喃型阿拉伯糖苷酶、β-葡萄糖苷酶或果膠酶）選擇性水解不同位置的糖基，將人參皂苷水解制備次級人參皂苷是可行的[26]。Zhang 等[27]從枯草芽孢桿菌中克隆并優(yōu)化了呋喃型阿拉伯糖苷酶基因，能特異性水解人參皂苷Rc 阿拉伯糖糖基，將其轉(zhuǎn)化生成人參皂苷Rd，Kim 等[28]報道了一種重組酶α-L-吡喃型阿拉伯糖苷酶，通過選擇性水解C-20 位的吡喃型阿拉伯糖基，可高效催化人參皂苷Rb2轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rd。α-鼠李糖苷酶能夠水解PPT 型人參皂苷C-6 位的鼠李糖產(chǎn)生人參皂苷Rg1、Rh1[29]，此外，Chang等[30]對來自AspergillusnigerKCCM 11239 的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行優(yōu)化，該酶在人參皂苷Rb1的C-20 位水解葡萄糖基生成人參皂苷Rd 和Rg3，在C-3 位水解葡萄糖基生成人參皂苷F2，β-葡萄糖苷酶MT619 利用2 種轉(zhuǎn)化途徑將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為次級人參皂苷 CK 和 PPD[31]：人參皂苷Rb1→Gyp-XVII→Gyp-LXXV→人參皂苷 CK→PPD；人參皂苷Rb1→Gyp-XVII→人參皂苷F2→人參皂苷CK→ PPD，果膠酶可將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rd[32]。對人參皂苷轉(zhuǎn)化途徑及生物轉(zhuǎn)化情況見圖1。

圖1 人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化途徑Fig.1 Biotransformation pathway of ginsenosides

1.1.2 Gyp 目前，Gyp 的生物轉(zhuǎn)化研究部分和人參皂苷重合，如Gyp-XVII、LXXV 轉(zhuǎn)化途徑，Gyp生物轉(zhuǎn)化途徑見圖2。Chen 等[33]研究發(fā)現(xiàn)給予大鼠Gyp-LVI 后，其在大鼠體內(nèi)的主要轉(zhuǎn)化代謝過程是脫糖基和脫水，5 個代謝物分別是Gyp-XLVI、Gyp-L、Gyp-LI、達(dá)木林B 和A。保加利亞乳桿菌對Gyp-XLVI 的主要轉(zhuǎn)化物與大鼠胃腸道轉(zhuǎn)化產(chǎn)物一致，分別為Gyp-L、Gyp-LI、達(dá)木林A 和B[34]。

圖2 絞股藍(lán)皂苷的生物轉(zhuǎn)化途徑Fig.2 Biotransformation pathway of gypenosides

利用高效液相色譜對比分析，發(fā)現(xiàn)Gyp 經(jīng)微生物Aspergullusglaucus轉(zhuǎn)化后，產(chǎn)生低極性的次級皂苷，陳良華等[35]利用微生物FFCDL-90 菌株得到的鼠李糖苷酶將Gyp-5 轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rd。以多糖基原型Gyp 為底物，篩選出高產(chǎn)Gyp 糖苷酶的菌株Absidasp. GYP4r，采用離子交換色譜法分離純化得到Gyp 糖苷酶能夠特異性水解Gyp，對pNP-α-D-Glc、pNP-β-D-Glc、pNP-α-D-Gal 均具有水解能力[36-38]。

通過使用FervidobateriumpennivoransDSM9078產(chǎn)生的重組酶將Gyp-XLIX 脫去C-21 位葡萄糖基水解轉(zhuǎn)化生成gylongiposide I[39]，Gyp-XLVI 通過柚皮苷酶轉(zhuǎn)化生成Gyp-TN-1[40]。劉玥[41]利用NLZ-R和NLZ-X 特異性水解Gyp-NPLC0394 的鼠李糖糖基和木糖糖基，生成化合物A～C；利用蝸牛酶可以水解Gyp-LVI 和Gyp-XLVI 的葡萄糖基，生成2-羥基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(20S)-原人參二醇-20-O-[β-D-吡喃木糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷（I）、2-羥基-(20S)-原人參二醇-20-O-[β-D-吡喃木糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷（II）、2-羥基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(20S)-原人參二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（III）、2-羥基-(20S)-原人參二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（IV）。

1.1.3 黃芪皂苷 黃芪皂苷是黃芪的主要藥效成分，在黃芪研究中占有重要地位。目前關(guān)于黃芪皂苷生物轉(zhuǎn)化的研究較少，但對其皂苷結(jié)構(gòu)的修飾，如脫乙?；?、脫糖基途徑的規(guī)律總結(jié)較充分。黃芪皂苷在腸道菌群中的主要轉(zhuǎn)化途徑包括脫糖基、脫乙?；?、脫氫等，共同轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為環(huán)黃芪醇（cycloastragenol，CA）。孟欣桐等[42]研究表明黃芪甲苷（astragaloside-IV，AS-IV）可經(jīng)人源腸道菌群脫糖基后，轉(zhuǎn)化成易吸收入血的CA，大鼠腸道菌也可將ASI 脫去C-3 和C-6 位的木糖基和葡萄糖基生成環(huán)黃芪醇-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和CA[43]。AS-IV 與大鼠腸道菌群離體孵育4 h，脫去C-3 和C-6 位糖基，水解生成環(huán)黃芪醇-6-O-β-D-葡萄糖苷（brachyoside B，Bra B）、cyclogaleginoside B（Cyc B）、CA 和氧化型CA[44]。

劉曉會[45]從不同來源的霉菌中篩選到能夠轉(zhuǎn)化黃芪總皂苷生成 AS-IV 的菌種——Absidia corymbiferaAS2。采用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，以黃芪總皂苷作為底物，通過發(fā)酵轉(zhuǎn)化提高AS-IV 含量，并在黃芪總皂苷中鑒定出4 個可以轉(zhuǎn)化為AS-IV 的化合物，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定分別為黃芪皂苷I（astragaloside I，ASI）、異ASI（isoASI）、ASII 和isoASII，進(jìn)一步研究該菌株生物轉(zhuǎn)化的機(jī)制發(fā)現(xiàn)，其所表達(dá)的乙酰酯酶可有效水解ASII 中C-3 位吡喃木糖基殘基的乙?；?， 轉(zhuǎn)化途徑分別是 ASII→ASI 、isoASII→ASII→AS-IV、ASI→（ASII、isoASII）→ASIV、isoASI→ASII→AS-IV[46-47]。利用Penicillium canescens也可將黃芪總皂苷向AS-IV 轉(zhuǎn)化，使AS-IV 含量顯著升高，是未轉(zhuǎn)化前的5.51 倍[48]。8種不同的菌株進(jìn)行AS-IV 的生物轉(zhuǎn)化研究，發(fā)現(xiàn)A.nigerM85 生物轉(zhuǎn)化活性最強(qiáng)，轉(zhuǎn)化后AS-IV 含量是未轉(zhuǎn)化前的11.7 倍[49]。阮鳴[50]使用不同的藥（食）用真菌發(fā)酵黃芪，發(fā)現(xiàn)均可以將ASI 轉(zhuǎn)化成異AS-IV，推測其轉(zhuǎn)化機(jī)制為菌株生長過程中所產(chǎn)生的木糖苷酶水解AS-IV C-3 位木糖基后將其轉(zhuǎn)化成異AS-IV。Wang 等[51]利用Bacillussp. LG-502成功將ASI 轉(zhuǎn)化為CA，經(jīng)核磁和質(zhì)譜分析，推測其對AS-IV 的轉(zhuǎn)化途徑與腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化相似，轉(zhuǎn)化機(jī)制為Bacillussp. LG-502 分泌的葡萄糖苷酶和木糖苷酶，AS-IV 在活性更高的葡萄糖苷酶的作用下優(yōu)先脫去C-6 位葡萄糖基，隨后脫去C-3 位木糖基生成CA，黃芪皂苷類化合物的生物轉(zhuǎn)化途徑見圖3。

圖3 黃芪皂苷的生物轉(zhuǎn)化途徑Fig.3 Biotransformation pathway of astragalosides

Cheng 等[52]使用來自Trichodermareesei的2 種酶（β-木糖苷酶、β-葡萄糖苷酶）將AS-IV 轉(zhuǎn)化生成CA。來源于Dictyoglomusthermophilum的β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶也能將AS-IV 轉(zhuǎn)化生成CA[53-54]。商品化的β-葡萄糖苷酶可以將黃芪甲苷C-3 位木糖基脫去生成Bra B[55]。從Absidasp. A3r、A84r、A9r、A8r、A38r、ARr 6 種株菌中篩選出了黃芪皂苷糖苷酶高產(chǎn)菌株，可以將多糖基的黃芪皂苷轉(zhuǎn)化生成低糖基的次級皂苷[56-57]，研究還發(fā)現(xiàn)，來自Absidiasp. A3r 的黃芪皂苷糖苷酶特異性強(qiáng)，底物為人參皂苷Re、ASI 和柴胡皂苷等均未發(fā)生脫糖基的水解反應(yīng)，該酶只水解四環(huán)三萜環(huán)阿屯烷型的黃芪皂苷C-16 位的α-鼠李糖基[58]。

1.1.4 羅漢果皂苷類成分 Zhou 等[59]在ig 羅漢果皂苷V 于大鼠后，在血漿、尿液、膽汁和糞便樣品中發(fā)現(xiàn)羅漢果皂苷V 的脫糖基代謝物，其轉(zhuǎn)化是依次脫去不同數(shù)量和位置上的葡萄糖，李典鵬等[60]在大鼠體外代謝研究中得出相同結(jié)論。經(jīng)人源腸道菌群孵育，羅漢果皂苷III 依次脫去C-3 位葡萄糖基和C-24 位龍膽二糖基水解生成次級皂苷羅漢果皂苷IIA1和皂苷元羅漢果醇[61]。

采用產(chǎn)高活性β-葡萄糖苷酶的青霉屬真菌J-9對羅漢果總皂苷進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化生成次級皂苷產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)：羅漢果醇-24-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷（A）、B 為羅漢果皂苷IIIE（B）、11-酮-羅漢果醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-24-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷（C）[62-63]。羅漢果總皂苷經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解1 次的產(chǎn)物以三糖皂苷和四糖皂苷為主；水解2 次的產(chǎn)物經(jīng)鑒定結(jié)構(gòu)為C-3 或C-24 位連接1 個β-葡萄糖基的單糖皂苷及少量二糖皂苷為主[64]，利用β-葡聚糖酶水解轉(zhuǎn)化羅漢果皂苷V，生成連接不同數(shù)量糖基的羅漢果皂苷IIIE、III、IVE 和賽門苷I 等次級皂苷[65]，生物轉(zhuǎn)化途徑見圖4。

圖4 羅漢果皂苷類成分的生物轉(zhuǎn)化途徑Fig.4 Biotransformation pathway of mogrosides

1.1.5 酸棗仁皂苷類成分 杜晨暉等[66]利用UPLC-Q-Orbitrap-MS 分析發(fā)現(xiàn)，酸棗仁皂苷類成分在正常人源腸道菌群中的主要轉(zhuǎn)化途徑為脫糖基反應(yīng)，依次脫去皂苷元外側(cè)糖基，脫糖基順序不同會生成不同的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。酸棗仁皂苷在大鼠腸道菌群中的轉(zhuǎn)化途徑與人源相似，均會產(chǎn)生及次生皂苷和酸棗仁皂苷元。酸棗仁皂苷A（jujuboside A，Ju A）被茯苓真菌中的葡萄糖苷酶水解脫去C-3 位葡萄糖基，生成Ju B[67]，Ju A 在離體人源腸道菌群中也會轉(zhuǎn)化生成為酸棗仁皂苷B[68-69]，酸棗仁皂苷在腸道菌群和微生物中的轉(zhuǎn)化途徑見圖5。Matsuda 等[70]通過酶解法將原酸棗仁皂苷A、B、B1 C-23 位的葡萄糖基脫去，轉(zhuǎn)化生成為已知的酸棗仁皂苷。

圖5 酸棗仁皂苷類成分的生物轉(zhuǎn)化途徑Fig.5 Biotransformation of jujubosides

1.2 五環(huán)三萜

1.2.1 甘草酸 多數(shù)甘草皂苷類成分均具有五環(huán)三萜結(jié)構(gòu)母核，甘草酸是其中含量最高的成分，也是甘草皂苷類成分的代表性化合物。GL 為齊墩果烷型三萜皂苷，在C-3 位有2 分子葡萄糖醛酸基[71]。Akao 團(tuán)隊[72-74]闡明甘草酸的腸道菌群轉(zhuǎn)化途徑主要有2 種，見圖6。（1）甘草酸1 次性水解脫去2個葡萄糖醛酸，直接生成甘草次酸；（2）先水解掉C-3 位末端的1 個葡萄糖醛酸基，生成中間體單葡萄糖醛酸甘草次酸（ glycyrrhetinic acid monoglucuronide，GAMG），再水解脫去1 個葡萄糖醛酸生成甘草次酸。有研究發(fā)現(xiàn)無菌大鼠無法將甘草酸吸收入血且未發(fā)生脫糖基的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，說明腸道菌的轉(zhuǎn)化作用是將甘草皂苷類成分吸收入血的必要環(huán)節(jié)，隨后研究團(tuán)隊從人源糞便中分離篩選到參與甘草酸轉(zhuǎn)化的菌株，如Eubacteriumsp. GLH、Ruminococcussp. PO1-3 和Streptococcussp. LJ-22等，其中Streptococcussp. LJ-22 被證實(shí)可特異性地水解甘草酸C-3 位末端的1 個葡萄糖醛酸基生成GAMG[75]。Huang 等[76]將甘草提取物與人源腸道菌群體外孵育，研究結(jié)果表明甘草皂苷A3、E2、G2、22-β-乙酰氧基甘草酸等三萜皂苷的腸道菌群轉(zhuǎn)化方式與甘草酸相同，均為脫糖基后生成次級皂苷及苷元。

圖6 甘草酸的生物轉(zhuǎn)化途徑Fig.6 Biotransformation pathway of glycyrrhizic acid

近些年，研究者對甘草酸的微生物轉(zhuǎn)化的相關(guān)研究較多[77-79]，發(fā)現(xiàn)了許多能成功轉(zhuǎn)化甘草酸的菌種，但甘草酸的轉(zhuǎn)化途徑簡單，與腸道菌群轉(zhuǎn)化途徑一致。用于微生物轉(zhuǎn)化的菌株產(chǎn)β-D-葡萄糖醛酸苷酶，不同來源的酶對脫糖基的位置具有立體選擇性， 從StreptococcusLJ-22[80]、Penicillium purpurogenumLi-3[81]和TalaromycespinophilusLi-93[82]中分離純化的葡萄糖醛酸苷酶僅水解甘草酸C-3 位末端葡萄糖醛酸基生成GAMG，水解生成甘草次酸。來源于Aspergillusniger[83]和EubacteriumL-8[84]的葡萄糖醛酸苷酶可將甘草酸徹底水解生成甘草次酸。

1.2.2 柴胡皂苷類成分 Shimizu 等[85]研究表明柴胡皂苷A、B1、B2、D、G 等在大鼠腸道中主要發(fā)生脫糖基反應(yīng)，首先脫去C-3 位末端的葡萄糖基生成次級苷原柴胡皂苷F、A、H、G、D，然后脫去C-3位巖藻糖生成皂苷元F、A、H、G、D，Kida 等[86]將柴胡皂苷類成分與人糞便共同培養(yǎng)后，也得到相同的結(jié)論，并從人源腸內(nèi)菌株中篩選出Eubacteriumsp. A-44，研究該菌株參與生物轉(zhuǎn)化的機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)從E. sp. A-44 中分離得到的酶（β-葡萄糖苷酶和β-巖藻糖苷酶）可逐級脫去柴胡皂苷C-3 位的巖藻糖和葡萄糖，最終生成柴胡皂苷元。Yu 等[87]發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷C 在人源腸道菌群中的轉(zhuǎn)化途徑與柴胡皂苷A、B1、B2、D、G 類似，在體內(nèi)均為逐步脫糖基的轉(zhuǎn)化。國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷A 經(jīng)大鼠腸道菌群轉(zhuǎn)化生成柴胡次皂苷F 和柴胡皂苷元F[88]，進(jìn)一步證明了柴胡皂苷在腸內(nèi)菌的轉(zhuǎn)化途徑。

徐金麗和富瑤瑤發(fā)現(xiàn)sp.c42、Microbacteriumsp.GS514-saiko 和Rhodanobactersp.GS3054 所產(chǎn)的酶都能將柴胡皂苷轉(zhuǎn)化為低糖基的次級皂苷[89-90]。重組酶ABQ 與柴胡皂苷A 反應(yīng)使C-3 位的葡萄糖水解生成柴胡次皂苷F，繼續(xù)水解C-3 位的巖藻糖生成柴胡皂苷元F[91]，纖維素酶可以將柴胡皂苷B2脫糖基生成前柴胡皂苷D，蝸牛酶可以將柴胡皂苷B1、A、D 脫糖基分別生成前柴胡皂苷A、F、G[92]，柴胡皂苷的生物轉(zhuǎn)化途徑見圖7。

圖7 柴胡皂苷類成分的生物轉(zhuǎn)化途徑Fig.7 Biotransformation pathway of saikosaponins

1.2.3 白頭翁皂苷類成分 白頭翁皂苷 B4（anemoside B4，B4）與不同腸段的腸道菌群孵育共鑒定得到10 個代謝物，其中9 個產(chǎn)物均是脫糖基生成，B4 母核為2,3-羥基白樺脂酸皂苷元，含有5個糖基，在腸道菌群中逐級脫糖基，生成含有2～4個不同數(shù)量糖基的次級皂苷及2,3-羥基白樺酸[93]。白頭翁皂苷D、B7 和BD 在體外腸道菌群中也發(fā)生類似的脫糖基反應(yīng)，得到次級皂苷及常春藤皂苷元[94-95]。

當(dāng)前，對于白頭翁皂苷糖苷酶的生物轉(zhuǎn)化已有大量研究，并從中分離出多種能轉(zhuǎn)化白頭翁皂苷的糖苷酶[96-97]，利用來自Absidiasp.P00r 的酶，將六糖基白頭翁皂苷轉(zhuǎn)化生成含有2 個糖基的次級皂苷常春藤皂苷元-3-O-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-L-吡喃阿拉伯糖苷[98]。利用菌株Absidiasp.P39r 生成的水解酶，水解白頭翁皂苷H C-28 位末端鼠李糖基，得到白頭翁皂苷PS-I；C-3 和C-28 位分別脫去葡萄糖基，得到白頭翁皂苷PS-II；進(jìn)一步水解脫去C-28位葡萄糖基，得到白頭翁皂苷A，白頭翁皂苷在腸內(nèi)菌及其酶的轉(zhuǎn)化見圖8。

圖8 白頭翁皂苷類成分的生物轉(zhuǎn)化途徑Fig.8 Biotransformation pathway of anemosides

1.2.4 走馬胎皂苷類成分 走馬胎為紫金?？浦参铮殴?jié)龍皂苷-I（ardipusilloside-I，ADS-I）和走馬胎皂苷Ag3是該藥材中2 個代表性的皂苷成分。體外模擬人腸道菌群對ADS-I 進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化研究，初步推斷出M1～M4 4 個代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)[99]。其中代謝產(chǎn)物M1、M2、M4 與ADS-I 在大鼠腸內(nèi)菌的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物相同[100]，均為ADS-I 分別脫去C-3 位葡萄糖基（M1）、葡萄糖基和鼠李糖基（M2）及C-3 位全部糖基脫去后生成的苷元（M4）。脫去3 個糖基的M3 是人體腸道菌獨(dú)有的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，脫去C-3 位末端鼠李糖基的M5 是大鼠腸道菌獨(dú)有的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，提示人和動物菌群的組成不同，ADS-I 的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物也會發(fā)生變化。

張靜[101]在內(nèi)生菌和土壤菌種篩選得到3 株對走馬胎皂苷Ag3具有轉(zhuǎn)化能力的菌株，分別是SphingomonasyabuuchiaeGTC868T（AB071955）、BacilluslicheniformisATCC14580T（AE017333）和BacillusasahiiMA001T（AB109209）。該團(tuán)隊也發(fā)現(xiàn)果膠酶也可以轉(zhuǎn)化走馬胎皂苷Ag3生成次級皂苷A-1、A-2、A-3 及苷元。ADS-I 和走馬胎皂苷Ag3生物轉(zhuǎn)化途徑見圖9。

圖9 ADS-I 和Ag3 生物轉(zhuǎn)化途徑Fig.9 Biotransformation pathway of ADS-I and Ag3

1.2.5 其他五環(huán)三萜類皂苷 桔梗皂苷腸內(nèi)菌的轉(zhuǎn)化途徑主要是脫去C-3 位糖基[102]。經(jīng)黑曲霉與黑根霉轉(zhuǎn)化后桔?？傇碥盏纳V峰明顯后移，說明皂苷糖基脫去生成次級皂苷或苷元[103]。Shin 等[104-105]發(fā)現(xiàn)耐酸性果膠酶Cytolase PCL5 可以水解桔梗皂苷E C-3 位葡萄糖基和C-28 位的木糖基和芹糖基，具有底物特異性，Cytolase PCL5 是一種混合酶，因此可能對多種糖基具有特異性。同樣，來自黑曲霉的Pluszyme 2000P 僅水解桔梗皂苷C-3 位葡萄糖基[106]。利用蝸牛酶水解桔梗總皂苷[107]，可以將結(jié)構(gòu)相近的桔梗皂苷E、D3 等轉(zhuǎn)化為桔梗皂苷D；從Trichodermareesei、Aspergillusoryzae[108]、AspergillususamiiKFRI 1004[109]、P.grandiflorus[110]和Aspergillusaculeatus[111]分離純化得到的纖維素酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和果膠酶均能將桔梗皂苷E 和D3 轉(zhuǎn)化為桔梗皂苷D。

商陸的主要活性成分之一為商陸皂苷甲（esculentoside A，EsA），研究發(fā)現(xiàn)EsA 具有抗炎、抗菌和利尿等多種活性[112]，但EsA 的溶血性限制了其應(yīng)用。EsA 經(jīng)生物轉(zhuǎn)化脫糖基后，生成EsB，該化合物溶血性降低，增強(qiáng)了抗炎活性[113-114]。EsA經(jīng)微生物StreptomycesgriseusATCC 13273 脫去C-3 位木糖基和葡萄糖基，生成EsB 和苷元-商陸酸甲酯[115]。

重組糖苷酶和蝸牛酶與EsA 反應(yīng)均使C-3 位末端葡萄糖基被水解，生成 EsB[91]，蝸牛酶在48.28 ℃、pH 值為6.4 時產(chǎn)率最高[116]。賴道萬[117]使用黑曲霉β-葡萄糖苷酶、苦杏仁酶、蝸牛酶等酶也能使EsA 中的葡萄糖基發(fā)生水解，生成EsB，其中只有蝸牛酶能使EsA C-3 位糖基側(cè)鏈完全水解，得到其皂苷元。

Watanabe 等[118-119]從AspergillusoryzaePF1224、N.vasinfectavar.vasinfectaP F1225 和EupenicilliumbrefeldianumPF1226 中純化出大豆皂苷水解酶，顯示該酶不僅可以水解大豆皂苷I 的C-3位連接的鼠李糖基和半乳糖基，還可以進(jìn)一步水解其內(nèi)端的葡萄糖醛酸基生成大豆甾醇B。Abdel 等[120]篩選了5 種菌株，發(fā)現(xiàn)A.terreusII 能將大豆總皂苷最大效率地轉(zhuǎn)化為大豆甾醇B。田晶等[121]利用8 種霉菌菌株對大豆皂苷糖基的水解能力進(jìn)行探討，得到米曲霉A.oryzae39s、A.oryzaeslows 和黑曲霉A.niger848s 3 種具有較高活性的菌種，均使大豆皂苷部分糖基水解生成低糖基皂苷及苷元。

牛膝三萜皂苷和大鼠腸道菌群共培養(yǎng)，產(chǎn)生39個轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，結(jié)果顯示牛膝皂苷在腸內(nèi)的主要轉(zhuǎn)化途徑是去糖基化，竹節(jié)參皂苷V、IV、IVa 等原型皂苷的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為姜狀三七皂苷R1、28-去葡萄糖基竹節(jié)參皂苷IVa 和齊墩果酸等。根據(jù)產(chǎn)物特征碎片推斷，脫糖基反應(yīng)主要發(fā)生在C-3 和C-28 位的糖苷鍵[122]。

在人參皂苷、黃芪皂苷和甘草皂苷等三萜皂苷的生物轉(zhuǎn)化中，反應(yīng)機(jī)制主要為脫糖基的水解反應(yīng)，通常發(fā)生在C-3、C-6、C-20、C-21、C-23、C-24 和C-28 位。轉(zhuǎn)化生成的次級皂苷和苷元不僅可以提高生物利用度，也能增強(qiáng)抗炎、抗病毒和抗癌等藥效[79,123]。

2 甾體皂苷的生物轉(zhuǎn)化

2.1 薯蕷皂苷

薯蕷皂苷在人源腸道菌群中糖基被逐個水解，形成相應(yīng)的次級皂苷和薯蕷皂苷元[8,124]。Tang等[125]表征了給藥后大鼠體內(nèi)總薯蕷皂苷、薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元的代謝輪廓，結(jié)果表明薯蕷皂苷的逐級脫糖基是最重要的轉(zhuǎn)化過程。

Chen 等[126]利用Lactobacilluscasei脫去薯蕷皂苷C-3 位糖基生成薯蕷皂苷元，Liu 等[127]從米曲霉Aspergillusoryzae中分離純化的水解酶，可以水解原薯蕷皂苷中C-3 位末端α-1,4-鼠李糖基和C-26 位葡萄糖基生成薯蕷次皂苷 A。從新月彎孢霉Curvularialunata中分離純化出的α-L-鼠李糖苷酶能夠水解C-3 位末端α-1,2-鼠李糖基，生成progenin V[128]。從新鮮牛肝中分離得到的鼠李糖苷酶能夠水解2 個鼠李糖基生成C-3 位連有1 個葡萄糖基的次級薯蕷皂苷[129]。Jin 等[130]則從Absidiasp. d38 中分離純化出了薯蕷皂苷水解酶，可將薯蕷皂苷側(cè)鏈糖基全部脫去，水解生成薯蕷皂苷元。

2.2 知母皂苷B-II/III

在大鼠腸道菌群中，知母皂苷B-II 和B-III 發(fā)生的轉(zhuǎn)化反應(yīng)主要有脫糖基化、脫水、羥基化、E環(huán)裂解和氧化反應(yīng)[7,131-133]，脫糖基是我們重點(diǎn)關(guān)注的途徑，轉(zhuǎn)化途徑為知母皂苷B-II 的C-3 位依次脫去葡萄糖基及半乳糖基，得到次級知母皂苷B-II-a和B-II-b；C-26 位脫去葡萄糖基，生成知母皂苷A-III；知母皂苷B-III 的C-3 位脫去葡萄糖基及半乳糖基，得到次級知母皂苷B-III-a、B-III-b。利用微生物AspergillusnigerAS 3.0739[134]和Colletotrichumgloeosporioideis[135]轉(zhuǎn)化知母皂苷B-II，均會水解脫去C-3 和C-26 位糖基，得到次級皂苷。

甾體皂苷的生物轉(zhuǎn)化中，大多以皂苷與皂苷元之間的相互轉(zhuǎn)化為主，脫糖基水解反應(yīng)主要發(fā)生在C-3 和C-26 位。與三萜皂苷類化合物相比，甾體皂苷的生物轉(zhuǎn)化機(jī)制更簡單，涉及到的反應(yīng)類型少。

3 結(jié)語與展望

以幾種具有代表性的三萜皂苷和甾體皂苷為例，綜述了中藥中皂苷類成分生物轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展。其中，腸道菌群種類多樣，逐級脫糖基是最主要的轉(zhuǎn)化方式，即生成一系列次級皂苷及對應(yīng)的皂苷元。另外，腸內(nèi)菌還可以使皂苷發(fā)生羥基化、氧化和去甲基化等反應(yīng)，是次要的腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化途徑。因人體腸道菌群與模型動物在物種組成及多樣性上的差異，皂苷的腸內(nèi)轉(zhuǎn)化也存在物種差異。如ADS-I 在人和大鼠腸道菌群中轉(zhuǎn)化產(chǎn)物部分一致[99-100]。從微生物中篩選合適的菌株或酶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，是制備次級皂苷的有效途徑。大多數(shù)生物轉(zhuǎn)化研究所選用的菌株主要包括4 個來源：（1）從人源或大鼠的腸道菌群中篩選出能夠轉(zhuǎn)化皂苷的優(yōu)良菌株；（2）從產(chǎn)生糖苷酶的已知菌株中篩選出轉(zhuǎn)化特異性高的優(yōu)良菌株[79]；（3）從藥用植物生長土壤中篩選出具有轉(zhuǎn)化優(yōu)勢的優(yōu)良菌株；（4）從植物內(nèi)生菌中篩選優(yōu)良菌株。隨著酶工程和基因工程研究的發(fā)展，部分課題組儲有用于生物轉(zhuǎn)化的特異性純化酶或重組酶，若能將特異性高的糖苷酶轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品，實(shí)現(xiàn)水解酶的工業(yè)化生產(chǎn)，對皂苷類化合物的生物轉(zhuǎn)化研究和經(jīng)濟(jì)效益具有深遠(yuǎn)意義，以滿足后續(xù)成藥性研究和新藥開發(fā)的需求。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突