西紅花提取物調(diào)控免疫細(xì)胞，提高程序性死亡受體-1抑制劑治療肺腺癌效果的實驗研究

李詩穎 李存雅 張雪 鐘薏

摘 要 目的：多項研究提示，西紅花提取物能影響腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。本實驗探究西紅花提取物在肺腺癌小鼠模型中對腫瘤免疫微環(huán)境和免疫治療的影響，為西紅花提取物抗腫瘤研究提供更多基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。方法：構(gòu)建Lewis肺癌細(xì)胞和螢光素酶穩(wěn)定結(jié)合的小鼠皮下瘤模型，觀察西紅花提取物對小鼠皮下瘤和腫瘤免疫微環(huán)境的影響：運用活體成像技術(shù)跟蹤腫瘤生長情況；運用流式細(xì)胞技術(shù)檢測小鼠CD4+、CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量及占比；運用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)檢測程序性死亡受體配體1、含有T細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域的蛋白3（T cell immunoglobulin and mucin domaincontaining protein 3， TIM3）、淋巴細(xì)胞活化基因-3（lymphocyte-activation gene-3， LAG3）、具有免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域的T細(xì)胞免疫受體（T cell immunoreceptor with immunoglobulin and ITIM domain， TIGIT）、胸腺細(xì)胞選擇相關(guān)的高遷移率族蛋白（thymocyte selection-associated high mobility group box， TOX）1、TOX2、TOX3基因的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果：與對照組相比，給予西紅花提取物能一定程度地抑制小鼠皮下瘤的生長（P<0.05），且小鼠CD4+、CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量及占比均增加（P<0.05），TIM3、LAG3、TIGIT、TOX1、TOX2、TOX3的基因表達(dá)均上調(diào)（P<0.05）。結(jié)論：西紅花提取物能提高肺腺癌免疫微環(huán)境中的CD4+、CD8+ T細(xì)胞的占比，增強(qiáng)免疫治療的抗腫瘤作用，進(jìn)而提高肺癌免疫治療效果，抑制肺癌發(fā)展。

關(guān)鍵詞 西紅花 免疫微環(huán)境 肺腺癌 免疫治療

中圖分類號：R965； R282.71 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-1533（2024）01-0003-09

引用本文 李詩穎， 李存雅， 張雪， 等. 西紅花提取物調(diào)控免疫細(xì)胞，提高程序性死亡受體-1抑制劑治療肺腺癌效果的實驗研究[J]. 上海醫(yī)藥， 2024， 45（1）： 3-11； 28.

基金項目：上海市2022年度“科技創(chuàng)新行動計劃”醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究專項項目（22Y31920104）；上海市虹口區(qū)第二輪“國醫(yī)強(qiáng)優(yōu)”三年行動計劃（2022—2024年）中西醫(yī)結(jié)合重點?？?、薄弱?？平ㄔO(shè)項目（HKGYQYXM-2022-10）；上海市2021年度“科技創(chuàng)新行動計劃”揚(yáng)帆計劃項目（21YF444400）；上海市2022年度“科技創(chuàng)新行動計劃”啟明星培育（揚(yáng)帆專項）項目（22YF1444900）；山東省鄉(xiāng)村振興基金會張秀蘭慈善基金項目

Experimental study of saffron extracts to modulate immune cells to improve the efficacy of a programmed death-1 inhibitor in the treatment of lung adenocarcinoma

LI Shiying1， LI Cunya1， ZHANG Xue2， ZHONG Yi1

（1. Department of Oncology， Shanghai TCM-Integrated Hospital， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200082， China； 2. Shanghai Traditional Chinese Medicine Co.， Ltd.， Shanghai 200082， China）

ABSTRACT Objective： A number of studies have shown that saffron extracts can affect the development of tumor. This study explored the effect of saffron extract on tumor immune microenvironment and immunotherapy in a mouse model of lung adenocarcinoma so as to provide more basic data for the anti-tumor research of saffron extracts. Methods： The transplanted tumor model of Lewis lung carcinoma-luciferase in mice was established to detect the effect of saffron extracts on the transplanted tumor in vivo. At the same time， the tumor growth was tracked by in vivo imaging technique. The number and proportion of CD4+ and CD8+ T cells were determined by flow cytometry. The mRNA levels of programmed death-ligand 1， T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3 （TIM3）， lymphocyte-activation gene-3 （LAG3）， T cell immunoreceptor with immunoglobulin and ITIM domain （TIGIT）， thymocyte selection-associated high mobility group box （TOX） 1， TOX2 and TOX3 were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） and immunohistochemical techniques to verify the effect of saffron extracts on the regulation of tumor immune microenvironment. Results： Compared with the control group， the administration of saffron extracts could inhibit the growth of subcutaneous tumor in mice to a certain extent， and the number and proportion of CD4+ and CD8+ T cells were increased （P<0.05）， and the expression of genes encoding TIM3， LAG3， TIGIT， TOX1， TOX2 and TOX3 was up-regulated （P<0.05）. Conclusion： The saffron extracts can increase the proportion of CD4+ and CD8+ T cells in tumor microenvironment， enhance the anti-tumor effect of immunotherapy， thereby improving the effect of lung cancer immunotherapy and inhibiting the development of lung cancer.

KEY WORDS saffron； immune microenvironment； lung adenocarcinoma； immunotherapy

腫瘤是一類惡性疾病，2018年全球腫瘤死亡病例數(shù)達(dá)約960萬人，較2008年增加26.3%，其中男性腫瘤死亡病例數(shù)增加最多的是肺癌，增加了23.4萬人[1-2]。肺癌是腫瘤防治工作的重點之一。腫瘤免疫治療是一種基于腫瘤生長受到免疫系統(tǒng)監(jiān)視的理論而產(chǎn)生并不斷發(fā)展的腫瘤治療方法，其中免疫檢查點抑制劑如程序性死亡受體-1（programmed death-1， PD-1）/程序性死亡受體配體1（programmed death-ligand 1， PD-L1）抑制劑、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4抑制劑等，已廣泛用于多種腫瘤治療，包括非小細(xì)胞肺癌治療[3]，但免疫治療仍存在耐藥性和毒副反應(yīng)問題。

西紅花（saffron）為我國傳統(tǒng)中藥，其是鳶尾科番紅花屬多年生球莖草本植物番紅花（Crocus sativus L.）的干燥柱頭。目前，西紅花的多種活性成分已被分離出來，主要包括西紅花酸、西紅花醛、西紅花苷和西紅花素等[4]。有研究顯示，西紅花提取物能影響腫瘤的發(fā)展進(jìn)程，如西紅花醛可通過下調(diào)核因子κB-κB抑制因子激酶和蛋白激酶B信號通路，抑制人前列腺癌細(xì)胞PC-3裸鼠皮下移植瘤的生長[5]。另有研究顯示，西紅花苷具有通過提高B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）蛋白相關(guān)X蛋白與Bcl-2蛋白的比值而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長和靶向p53蛋白而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的作用[6-7]。

聯(lián)合中醫(yī)藥或中藥有效單體進(jìn)行抗腫瘤治療，提高腫瘤免疫治療效果、降低毒副反應(yīng)風(fēng)險，這是當(dāng)下中西醫(yī)結(jié)合防治腫瘤領(lǐng)域的主要研究方向之一。本實驗基于腫瘤微環(huán)境學(xué)說，探究西紅花提取物在肺腺癌小鼠模型中對腫瘤免疫微環(huán)境和免疫治療效果的影響，為西紅花提取物抗腫瘤研究提供更多基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)

Lewis肺癌（Lewis lung carcinoma， LLC）細(xì)胞來源于中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，所有LLC細(xì)胞系傳代不超過6個月。

取LLC細(xì)胞構(gòu)建LLC-螢光素酶（luciferase）細(xì)胞。

將LLC- luciferase細(xì)胞置于含有10%胎牛血清和0.1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，放入37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，連續(xù)傳代至細(xì)胞到達(dá)對數(shù)生長期后待用。

1.2 主要試劑與儀器

胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline， PBS）購自美國GIBCO公司；D-熒光素鉀鹽（XenoLight D-luciferin potassium salt）購自美國Perkin Elmer公司；異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗小鼠CD3單克隆抗體、藻紅蛋白標(biāo)記的抗小鼠CD4單克隆抗體、別藻青蛋白標(biāo)記的抗小鼠CD8單克隆抗體購自美國BioLegend公司；Trizol試劑購自美國Thermo Science公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒購自大連的Takara公司；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction， RT-PCR）引物由上海的Sangon Biotech公司設(shè)計并提供。

Lumina XR活體成像系統(tǒng)（軟件：Lumina Ⅱ Living Image 4.3）購自美國Perkin Elmer公司；實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀（型號：7500 Fast）購自美國ABI公司。

1.3 藥物制備

西紅花醇提物由上海市藥材有限公司提供。該醇提物的提取率為45%，根據(jù)西紅花飲片用量推算，小鼠用量為175.5 mg/kg，用生理鹽水配制成濃度為21.9 mg/mL的溶液，保存于4 ℃冰箱中待用。

西紅花醛由上海市藥材有限公司提供。根據(jù)大鼠常規(guī)用量0.4 mg/kg和大、小鼠體表面積換算，小鼠常規(guī)用量為0.58 mg/kg，用生理鹽水配制成濃度為0.145 mg/mL的溶液，保存于4 ℃冰箱中待用。

PD-1抑制劑卡瑞利珠單抗購自蘇州盛迪亞生物醫(yī)藥有限公司。該藥的常規(guī)用量為8 mg/kg，用生理鹽水配制成濃度為2 mg/mL的溶液，保存于4 ℃冰箱中待用。

1.4 小鼠皮下瘤模型建立

54只C57BL/6J小鼠（雄性，4～6周齡，20～25 g），購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[許可證號：SCXK（滬）2013-0016]，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心[實驗單位使用許可證號：SYXK（滬）2014-0008]，“無特定病原體”環(huán)境，溫度（22±2）℃，相對濕度（55±5）%，光照/黑暗周期12/12 h。本實驗通過上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審查（倫理審查編號：PZSHUTCM210402011）。

為建立荷瘤小鼠模型，先將對數(shù)生長期的LLCluciferase細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，然后細(xì)胞計數(shù)，1 000 r/min離心處理5 min，棄上清液，再用PBS稀釋至5×10⁶個細(xì)胞/mL濃度，取0.1 mL細(xì)胞懸液接種于小鼠右側(cè)腋下。若接種后第5天，小鼠右側(cè)腋下可觸及大小均一的腫塊，即造模成功。

根據(jù)實驗?zāi)康?，將荷瘤小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分組，共分為空白對照組、模型對照組、免疫治療組、西紅花醇提物組、西紅花醇提物聯(lián)合免疫治療組、西紅花醛組、西紅花醛聯(lián)合免疫治療組7組，每組6只。對每組小鼠分別給予相應(yīng)治療共28 d。其中，對空白對照組和模型對照組，分別給予生理鹽水灌胃[0.2 mL/（次？d）]和腹腔注射[0.1 mL/（次？3 d）]；對免疫治療組，給予卡瑞利珠單抗腹腔注射[0.1 mL/（次？3 d）]；對西紅花醇提物組，灌胃給藥[0.2 mL/（次？d）]；對西紅花醛組，腹腔給藥[0.1 mL/（次？d）]；對西紅花醇提物聯(lián)合免疫治療組，灌胃給予西紅花醇提物[0.2 mL/（次？d）]和腹腔注射卡瑞利珠單抗[0.1 mL/（次？3 d）]；對西紅花醛聯(lián)合免疫治療組，腹腔注射西紅花醛[0.1 mL/（次？d）]和卡瑞利珠單抗[0.1 mL/（次？3 d）]。每天測量小鼠皮下瘤的長度和寬度，并稱重。實驗結(jié)束后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，分離出移植瘤并稱重。

1.5 活體成像檢查

運用Lumina XR活體成像系統(tǒng)對荷瘤小鼠進(jìn)行活體成像檢查。檢查前給小鼠腹腔或尾靜脈注射螢光素酶10μL/g。注射后將小鼠置于麻醉機(jī)內(nèi)，用2%異氟烷進(jìn)行預(yù)麻醉，然后將小鼠放入活體成像設(shè)備內(nèi)，用1%異氟烷維持麻醉狀態(tài)，在距注射螢光素酶后約10 min小鼠熒光信號達(dá)到最強(qiáng)穩(wěn)定平臺期時，進(jìn)行活體成像檢查。

1.6 流式細(xì)胞檢測

研磨制備各組小鼠脾臟組織的單細(xì)胞懸液，加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，清洗、離心處理并用PBS洗滌多次后，分別加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗小鼠CD3單克隆抗體、藻紅蛋白標(biāo)記的抗小鼠CD4單克隆抗體、別藻青蛋白標(biāo)記的抗小鼠CD8單克隆抗體，4 ℃下孵育1 h，細(xì)胞再用PBS洗滌3次，加入PBS混勻，運用流式細(xì)胞儀（型號：BD FACSCantoⅡ）進(jìn)行檢測。

1.7 RT-PCR檢測

使用Trizol試劑從荷瘤小鼠的腫瘤組織中提取總RNA，然后進(jìn)行濃度和純度檢測。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg總核糖核酸反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。使用表1所示引物，對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，按以下步驟得到目的基因的擴(kuò)增曲線和熔融曲線：95 ℃預(yù)變性10 min后，進(jìn)入變性-退火-延伸循環(huán)。其中，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。檢測并記錄各基因的Ct值。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH）基因表達(dá)水平作為內(nèi)源性對照，采用2-ΔΔCt方法計算相對基因表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 西紅花提取物抑制荷瘤小鼠腫瘤發(fā)展

2.1.1 小鼠體質(zhì)量

實驗結(jié)束時，與空白對照組相比，各組小鼠的體質(zhì)量均減輕，表明腫瘤是消耗性疾病。此外，與模型對照組相比，免疫治療組小鼠的體質(zhì)量增加，其余各治療組小鼠的體質(zhì)量減輕，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（表2，P>0.05），表明西紅花提取物的使用對荷瘤小鼠體質(zhì)量沒有顯著影響，實驗劑量的西紅花提取物對小鼠安全。

2.1.2 瘤體質(zhì)量

2.1.2.1 西紅花醇提物

實驗結(jié)束時，與模型對照組相比，免疫治療組、西紅花醇提物組、西紅花醇提物聯(lián)合免疫治療組小鼠的瘤體質(zhì)量均減輕，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（表3，P>0.05）。小鼠瘤體質(zhì)量符合實驗動物福利倫理最新規(guī)定的要求[8]。

2.1.2.2 西紅花醛

實驗結(jié)束時，與模型對照組相比，西紅花醛聯(lián)合免疫治療組小鼠的瘤體質(zhì)量顯著減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表4，P<0.05），表明西紅花醛有一定的抑制腫瘤發(fā)展作用。小鼠瘤體質(zhì)量符合實驗動物福利倫理最新規(guī)定的要求[8]。

2.2 西紅花提取物調(diào)節(jié)荷瘤小鼠免疫系統(tǒng)

2.2.1 西紅花醇提物

實驗結(jié)束時，與模型對照組相比，免疫治療組小鼠脾臟組織中CD4+ T細(xì)胞的數(shù)量和CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量及占比均增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；西紅花醇提物組和西紅花醇提物聯(lián)合免疫治療組小鼠脾臟組織中CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量及占比均增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這些數(shù)據(jù)（圖1、2）表明，單獨使用西紅花醇提物、聯(lián)合使用西紅花醇提物和免疫治療均能有效改善荷瘤小鼠機(jī)體的免疫功能。

2.2.2 西紅花醛

實驗結(jié)束時，與模型對照組相比，免疫治療組小鼠脾臟組織中CD4+、CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量均增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；西紅花醛聯(lián)合免疫治療組小鼠脾臟組織中CD4+ T細(xì)胞數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。此外，與免疫治療組相比，西紅花醛組小鼠脾臟組織中CD4+、CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量均減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；西紅花醛聯(lián)合免疫治療組小鼠脾臟組織中CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量及占比均減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這些數(shù)據(jù)（圖3、4）表明，西紅花醛調(diào)節(jié)荷瘤小鼠免疫功能的作用與西紅花醇提物不同，有待進(jìn)一步的實驗研究。

2.3 西紅花提取物調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)免疫抑制受體基因mRNA表達(dá)水平

2.3.1 西紅花醇提物

實驗結(jié)束時，與模型對照組相比，免疫治療組小鼠TIGIT、TOX1、TOX2、TOX3的mRNA表達(dá)均上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；西紅花醇提物組小鼠LAG3、TIGIT、TOX1、TOX2的mRNA表達(dá)均上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；西紅花醇提物聯(lián)合免疫治療組小鼠LAG3、TIGIT、TOX1、TOX2、TOX3的mRNA表達(dá)均上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。此外，與免疫治療組相比，西紅花醇提物組小鼠PD-L1 mRNA表達(dá)下調(diào)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；LAG3 mRNA表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。詳情見圖5。

2.3.2 西紅花醛

實驗結(jié)束時，與模型對照組相比，西紅花醛組小鼠LAG3、TIGIT、TOX1、TOX2的mRNA表達(dá)均上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；西紅花醛聯(lián)合免疫治療組小鼠LAG3、TIGIT、TOX1的mRNA表達(dá)均上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。此外，與免疫治療組相比，西紅花醛組和西紅花醛聯(lián)合免疫治療組小鼠PD-L1 mRNA表達(dá)均下調(diào)，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。詳情見圖6。

3 討論

肺癌的發(fā)病率和死亡率均很高，其是腫瘤防治工作的重點和難點。免疫治療對肺癌有較好的效果，但仍存在耐藥性和毒副反應(yīng)問題。中醫(yī)藥作為中國傳統(tǒng)文化的瑰寶，如何發(fā)揮中醫(yī)藥的獨特優(yōu)勢來達(dá)到輔助提高免疫治療效果、降低毒副反應(yīng)的目的，是中西醫(yī)結(jié)合防治肺癌領(lǐng)域的重要研究方向之一。

西紅花在我國是珍稀藥材，臨床上用于多種疾病治療，包括抗腫瘤治療。西紅花苷作為西紅花的主要有效成分之一，已被證實可通過降低炎癥標(biāo)志物環(huán)氧合酶-2、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、核因子κB、腫瘤壞死因子-α及其受體的活性而呈現(xiàn)抗肝細(xì)胞癌作用[9]。Samarghandian等[10-12]通過實驗發(fā)現(xiàn)，西紅花提取物對肺癌細(xì)胞有細(xì)胞毒活性，對正常細(xì)胞生長則無明顯抑制作用。Liu等[13]驗證了西紅花提取物對肺癌細(xì)胞株A549和H446的抗增殖作用，并通過裸鼠皮下移植瘤模型從細(xì)胞凋亡的角度發(fā)現(xiàn)其可能是通過調(diào)控caspase-8/9/3通路而誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的。

本實驗以肺腺癌為切入點，挖掘西紅花提取物抑制肺癌發(fā)展的可能途經(jīng)和提高肺癌免疫治療效果的相關(guān)機(jī)制，以期為西紅花提取物抗腫瘤研究提供更多的基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。實驗結(jié)果顯示，與模型對照組相比，西紅花醛和西紅花醛聯(lián)合免疫治療均有一定的抑制肺癌模型小鼠瘤體生長的作用。此外，與模型 對照組相比，西紅花醛組小鼠的體質(zhì)量無明顯改變，表明實驗劑量的西紅花醛對小鼠安全。

CD4+、CD8+ T細(xì)胞是參與機(jī)體T細(xì)胞免疫應(yīng)答的細(xì)胞，是機(jī)體免疫微環(huán)境的主要組分之一，它們的占比能夠反映機(jī)體的免疫狀態(tài)，對機(jī)體的免疫功能起著重要作用。腫瘤患者的免疫功能與CD4+ T細(xì)胞與CD8+ T細(xì)胞的比值呈正相關(guān)關(guān)系[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)，西紅花醇提物可抑制7，12-二甲基苯并蒽誘導(dǎo)的小鼠皮膚腫瘤發(fā)展：小鼠在腫瘤化療的同時口服西紅花醇提物，其生存期延長，骨髓抑制減輕，免疫功能改善[16]。本實驗結(jié)果也顯示，西紅花提取物能提高肺癌模型小鼠的免疫功能，改善肺癌免疫微環(huán)境，從而抑制肺癌發(fā)展。

本實驗還進(jìn)行了基因?qū)用娴膶嶒炑芯?，結(jié)果顯示與免疫治療相比，西紅花提取物雖能下調(diào)PD-L1 mRNA表達(dá)，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，可能與本實驗采用PD-1抑制劑作為對照，致使西紅花提取物對腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)的影響不明顯有關(guān)。此外，與模型對照組相比，各治療組小鼠LAG3、TIGIT、TIM3的mRNA沒有下調(diào)趨勢，這可能與基因后續(xù)轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)有關(guān)。有研究表明，LAG3的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控[17]。另有研究發(fā)現(xiàn)，TIM3 mRNA表達(dá)與CD4+ T細(xì)胞的產(chǎn)生是同步的，TIM3 mRNA的表達(dá)可能會隨CD4+ T細(xì)胞數(shù)量及占比的增加而上調(diào)[18]。至于TOX1、TOX2、TOX3的mRNA水平呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，可能與CD8+ T細(xì)胞占比增高有關(guān)[19]。

綜上所述，西紅花提取物能抑制肺癌發(fā)展，可能的作用機(jī)制是：提高腫瘤免疫微環(huán)境中的CD4+、CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量及占比，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)，從而提高免疫治療效果，抑制肺癌發(fā)展。但本實驗未對西紅花提取物的作用靶點進(jìn)行蛋白層面的驗證。后續(xù)除通過實驗驗證西紅花提取物作用靶點的蛋白表達(dá)外，還將繼續(xù)深入挖掘西紅花提取物抑制肺癌發(fā)展的具體信號通路及其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，為西紅花提取物抗腫瘤研究提供更多基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

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