雞蛋中氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留分析方法

郭宏斌，彭侃霖，吳金玲，楊舒嫻，林玲，葉劍芝，劉元靖*，王曉芳

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（湛江），廣東湛江 524001；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院，云南普洱 665000）

氟蟲(chóng)腈及其主要代謝物（氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜與氟蟲(chóng)腈亞砜）屬于苯基吡唑類(lèi)殺蟲(chóng)劑的一種[1-2]，具有接觸毒性、胃毒性和一定的內(nèi)吸作用，該類(lèi)藥物具有慢性神經(jīng)毒性作用[3]，其中氟蟲(chóng)腈被定為C 類(lèi)致癌物質(zhì)[4-5]。有研究表明，氟蟲(chóng)腈在正常使用條件下，其代謝產(chǎn)物也有毒性，甚至有的遠(yuǎn)高于母體[6-8]。

生產(chǎn)中，經(jīng)常使用氟蟲(chóng)腈滅殺蛋雞養(yǎng)殖過(guò)程中的蚜蟲(chóng)和蠅類(lèi)[9]。鑒于氟蟲(chóng)腈及其代謝物的高風(fēng)險(xiǎn)及其高破壞性，氟蟲(chóng)腈在雞蛋中的殘留也已引起世界各國(guó)的重視，各國(guó)均制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)[10-11]。

Li 等[12]采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品中的農(nóng)藥殘留，分析方法不僅耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)復(fù)雜基質(zhì)雞蛋提取效率低。美國(guó)食品藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）[13]在開(kāi)展雞蛋樣品農(nóng)殘檢測(cè)中必須通過(guò)凈化和脫溶劑處理，才能用氣相色譜儀分析，以獲得較寬的農(nóng)藥檢測(cè)譜[14-18]。超臨界流體抽提（supercritical fluid extraction，SFE）法在雞蛋檢測(cè)中可以免去后續(xù)的凈化過(guò)程，具有選擇性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)[19]，但極性范圍窄，超臨界流體抽提法僅適用于檢測(cè)雞蛋食品中游離的膽固醇[20]。

本研究以雞蛋為研究對(duì)象，采用中性氧化鋁柱進(jìn)行凈化，其成本顯著低于常規(guī)的C18 固相萃取柱、弗洛里矽硅土固相萃取柱，樣品前處理流程簡(jiǎn)潔，以期建立一種高效、靈敏、可靠的雞蛋中氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

乙酸乙酯、正己烷、氧化鋁、丙酮等（均為分析純）：廣州化學(xué)試劑廠；水為超純水；正己烷、乙腈、甲酸、甲醇、乙酸銨（均為色譜純）：美國(guó)賽默飛世爾科技公司；弗洛里矽硅土固相萃取柱：美國(guó)Agilent 有限公司；氟蟲(chóng)腈、氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜和氟蟲(chóng)腈亞砜4 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液：天津環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究所，純度大于98%。

雞蛋：市售。

1.1.2 儀器設(shè)備

UNIVERAL 32R 離心機(jī)：日本Hettich 公司；Waters TQS 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國(guó)沃特世公司；R-200 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生；N-EVAP 氮吹儀：美國(guó)Organomation 公司；中性氧化鋁柱：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（湛江）自制。

1.1.3 儀器條件

超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）色譜柱：Waters C18 柱（50 mm×2.1 mm×1.7 μm）；流動(dòng)相：流動(dòng)相A 為乙腈，流動(dòng)相B 為5 mmol/L 的乙酸銨溶液；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量1 μL。梯度洗脫比例及流速見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫比例及流速Table 1 Mobile phase gradient and flow rate

質(zhì)譜條件為電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），負(fù)離子模式；離子源溫度：110 ℃；毛細(xì)管電壓：4.0 kV；脫溶劑氣溫度350 ℃；錐孔反吹氣流量50 L/h；脫溶劑氣流量：800 L/h；錐孔電壓：40 V；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）。每種農(nóng)藥優(yōu)化的去簇電壓和碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 氟蟲(chóng)腈及其代謝物特征離子質(zhì)譜條件Table 2 UPLC-MS/MS parameters for fipronil and its metabolites

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

按照NY/T 1897—2010《動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品獸藥殘留監(jiān)控抽樣規(guī)范》的要求，將采集的雞蛋樣品打碎，使用打蛋器進(jìn)行充分混合和均勻漿化，混勻后的樣品將被存放在聚乙烯瓶中，并在-18 ℃的低溫條件下進(jìn)行冷凍保存。

1.2.2 樣品提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)步驟1.2.1 勻漿的雞蛋樣品2 g，置于50 mL 聚丙烯離心管中，加入2 g 無(wú)水硫酸鈉，加入5 mL 乙腈作為粗提取液，均質(zhì)1 min 后，振蕩10 min，在4 ℃，以8 000 r/min 離心，提取上清液于雞心瓶中，得提取液；沉淀物用5 mL 乙腈重復(fù)提取1 次，合并兩次提取液，將2mL 異丙醇加入到溶液中，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50 ℃下進(jìn)行濃縮，直至溶液接近干燥，得到濃縮液。接著，加入2.0 mL 的甲醇與二氯甲烷混合溶液（體積比為1∶99），將殘?jiān)芙?，并充分混勻。得待凈化溶液?/p>

1.2.3 樣品凈化

將中性氧化鋁柱首先使用5 mL 的甲醇進(jìn)行預(yù)淋洗，接著用5 mL 的甲醇與二氯甲烷混合溶液（體積比為1∶99）進(jìn)行活化。凈化后，利用15 mL 刻度離心管收集洗脫液。隨后，用5 mL 的甲醇與二氯甲烷混合溶液（體積比為1∶99）沖洗燒杯，并再次洗脫固相萃取柱，此步驟需重復(fù)一次。將含有10 mL 洗脫液的刻度離心管放置在氮吹儀上，于50 ℃水浴溫度下使用氮?dú)膺M(jìn)行吹干處理，再使用乙腈與超純水的混合溶液（體積比為1∶1）將其定容至1.0 mL。在旋渦混合器上進(jìn)行充分混合后，通過(guò)0.22 μm 有機(jī)濾膜進(jìn)行過(guò)濾，最終供超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行分析測(cè)定。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.4.1 氟蟲(chóng)腈、氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜和氟蟲(chóng)腈亞砜4 種混合儲(chǔ)備液

分別吸取體積為1.00 mL、濃度為100 μg/mL 氟蟲(chóng)腈、氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜和氟蟲(chóng)腈亞砜標(biāo)準(zhǔn)溶液至容量瓶，用甲醇溶解并定容至10.0 mL。此溶液每毫升相當(dāng)于含氟蟲(chóng)腈、氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜和氟蟲(chóng)腈亞砜10.00 μg。

1.2.4.2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液

分別準(zhǔn)確吸取氟蟲(chóng)腈、氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜和氟蟲(chóng)腈亞砜4 種混合儲(chǔ)備液，將其稀釋成氟蟲(chóng)腈及其代謝物含量分別為0.001、0.002、0.005、0.010、0.020、0.050 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 回收率實(shí)驗(yàn)

在篩選出的空白雞蛋液中，添加相應(yīng)濃度的氟蟲(chóng)腈、氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜和氟蟲(chóng)腈亞砜4 種混合工作液，進(jìn)行不同提取溶劑以及不同固相萃取條件下的回收試驗(yàn)。

式中：R為回收率，%；C0為添加待測(cè)物的濃度，μg/kg；C1為實(shí)際測(cè)出待測(cè)物濃度，μg/kg；C2為空白基質(zhì)待測(cè)物濃度，μg/kg。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 軟件，對(duì)提取雞蛋中氟蟲(chóng)腈及其代謝物的6 個(gè)平行樣回收率的平均值數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理方法的優(yōu)化

2.1.1 樣品提取的優(yōu)化

由于氟蟲(chóng)腈及其代謝物的分子結(jié)構(gòu)中有較多數(shù)量的極性原子，為了實(shí)現(xiàn)雞蛋中氟蟲(chóng)腈及其代謝物的有效提取，比較了乙腈、乙酸乙酯、正己烷、甲醇和酸化乙酸乙酯（pH2.5）不同提取溶劑的提取效果，并研究了它們對(duì)氟蟲(chóng)腈及其代謝物的凈化效果和回收率的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同溶劑提取雞蛋樣品中的氟蟲(chóng)腈及其代謝物回收率Table 3 Recovery of fipronil and its metabolites from egg samples using various solvents

表3 結(jié)果表明，甲醇、乙酸乙酯、正己烷與酸性環(huán)境（pH2.5）中的乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí)，雞蛋樣品中的氟蟲(chóng)腈、氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜和氟蟲(chóng)腈亞砜回收率較低，難以滿足殘留檢測(cè)要求；當(dāng)選用乙腈作為雞蛋中氟蟲(chóng)腈及其代謝物的提取溶劑時(shí)，回收率在84.8%～89.3% 之間；因此，本文選擇乙腈作為提取溶劑，能夠有效提取雞蛋中的氟蟲(chóng)腈及其代謝物。

2.1.2 固相萃取柱的選擇

為有效減少雜質(zhì)對(duì)農(nóng)藥的干擾，比較了3 種不同類(lèi)型的固相萃取柱，包括中性氧化鋁柱、C18 固相萃取柱與弗洛里矽硅土固相萃取柱。通過(guò)氟蟲(chóng)腈及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液過(guò)柱試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同固相萃取柱過(guò)柱試驗(yàn)提取雞蛋樣品中的氟蟲(chóng)腈及其代謝物回收率Table 4 Recovery of fipronil and its metabolites in egg samples extracted by different solid phase extraction columns

表4 結(jié)果表明，中性氧化鋁柱與弗洛里矽硅土固相萃取柱的回收率達(dá)到87.2%～96.3%，而C18 固相萃取小柱的回收率僅達(dá)70%左右。由于自中性氧化鋁柱填料為普通的試劑中性氧化鋁，價(jià)格方面遠(yuǎn)低于C18 填料與弗洛里矽硅土，成本更有優(yōu)勢(shì)，故本方法選擇中性氧化鋁柱固相萃取小柱作為凈化小柱。

樣品中添加氟蟲(chóng)腈及其代謝物試驗(yàn)結(jié)果也證明，選用中性氧化鋁柱后試驗(yàn)的準(zhǔn)確度與精密度參數(shù)均符合要求，且在氟蟲(chóng)腈組分保留時(shí)間周?chē)鷽](méi)有雜質(zhì)峰的干擾，完全適用于本方法。

2.1.3 色譜條件的優(yōu)化

分別選擇乙腈-5 mmol/L 乙酸銨溶液、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-5 mmol/L 乙酸銨溶液和甲醇-0.1% 甲酸水作為流動(dòng)相，對(duì)樣品進(jìn)行分離試驗(yàn)。

試驗(yàn)表明，當(dāng)乙腈-5 mmol/L 乙酸銨溶液的比例采用表1 的條件時(shí)，氟蟲(chóng)腈及其代謝物的峰形對(duì)稱(chēng)、尖銳，且與樣品本底分離良好，乙腈-5 mmol/L 乙酸銨溶液分離體系優(yōu)于其他體系，所以選擇乙腈-5 mmol/L 乙酸銨溶液作為分離氟蟲(chóng)腈及其代謝物的流動(dòng)相。

2.2 空白試驗(yàn)

稱(chēng)取雞蛋（不添加氟蟲(chóng)腈及其代謝物）10.0 g，按照1.2 所述的方法，對(duì)樣品進(jìn)行前處理和凈化過(guò)柱后，進(jìn)行定容處理。隨后，使用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，所得的檢測(cè)圖譜如圖1所示。

圖1 氟蟲(chóng)腈及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of fipronil and its metabolite standards

由圖1 可知，在氟蟲(chóng)腈及其代謝物對(duì)照品的出峰保留時(shí)間范圍為1.64～1.70 min 時(shí)，未出現(xiàn)任何干擾峰。這一結(jié)果表明，雞蛋樣品中并未含有氟蟲(chóng)腈及其代謝物，不影響氟蟲(chóng)腈及其代謝物的檢測(cè)。

2.3 方法的評(píng)價(jià)

2.3.1 回收率與精密度

稱(chēng)取2.0 g 的空白雞蛋樣品（精確至0.01 g），添加適量的氟蟲(chóng)腈及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)工作液，以實(shí)現(xiàn)加標(biāo)水平分別為0.005、0.010 mg/kg 和0.020 mg/kg。隨后對(duì)樣品按照1.2 方法開(kāi)展檢測(cè)，每個(gè)添加水平重復(fù)5 次，計(jì)算雞蛋樣品中4 種氟蟲(chóng)腈及其代謝物的殘留量、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 雞蛋樣品中不同添加水平中的氟蟲(chóng)腈及其代謝物回收率Table 5 Recovery of fipronil and its metabolites in egg samples with different additions

由表5 可知，4 種氟蟲(chóng)腈及其代謝物的回收率在81.3%～92.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于5.5%。典型空白雞蛋樣品添加氟蟲(chóng)腈及其代謝物的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 空白雞蛋加入氟蟲(chóng)腈及其代謝物總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of add fiproni and its metabolites to blank eggs

由2 可知，該色譜峰形分離度好，周邊無(wú)雜質(zhì)峰干擾。

2.3.2 方法線性與檢出限

針對(duì)4 種農(nóng)藥制備不同濃度梯度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度分別為 0.001、0.002、0.005、0.010、0.020、0.050 μg/mL），并對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)樣分析。以溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出了4 種農(nóng)藥的回歸系數(shù)，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表6。

表6 方法的線性范圍及標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程Table 6 Linear range and linear equation of the method

由表6 可知，在濃度范圍為0.001～0.050 μg/mL內(nèi)，這4 種農(nóng)藥的相關(guān)系數(shù)均大于0.990 4，顯示出良好的線性關(guān)系。根據(jù)3 倍信噪比來(lái)計(jì)算出方法的檢出限，氟蟲(chóng)腈的檢出限為0.001 mg/kg，而氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜和氟蟲(chóng)腈亞砜的檢出限均為0.002 mg/kg，與GB 2763—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定的雞蛋中氟蟲(chóng)腈殘留限量0.02 mg/kg 相比，所開(kāi)發(fā)方法中檢出限能夠滿足檢測(cè)要求。

3 討論與結(jié)論

本研究建立了快速、高效、成本低的一種超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，適用于雞蛋中氟蟲(chóng)腈及其代謝物藥物殘留的分析。對(duì)比胡貝貞等[21]采用液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定茶葉中氟蟲(chóng)腈的含量；安瓊等[22]采用氣相色譜法測(cè)定禽蛋中有機(jī)氯農(nóng)藥含量；本研究對(duì)雞蛋中氟蟲(chóng)腈及其代謝物的藥物殘留進(jìn)行了全面、詳細(xì)的分析，采用了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定氟蟲(chóng)腈、氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜和氟蟲(chóng)腈亞砜，樣品前處理成本低，方法檢出限滿足要求，加標(biāo)回收率范圍為81.3%～92.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于5.5%。這表明該方法可應(yīng)用于雞蛋樣品中4 種農(nóng)藥的高靈敏度檢測(cè)，結(jié)果具有準(zhǔn)確性和可靠性。