駱駝骨髓蛋白的提取工藝優(yōu)化及功能特性

古麗米熱·阿巴拜克日，帕爾哈提·柔孜，*，劉源，陳艷萍，排則麗耶·阿不都熱依木，圖尼古麗·艾麥提，則拉萊·司瑪依，鄧杰

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院，上海 200240）

畜禽骨骼作為一種高營養(yǎng)的傳統(tǒng)食物，據(jù)傳統(tǒng)中藥學記載具有強筋壯骨、延年益壽、滋補等作用[1]。現(xiàn)代藥理學研究表明，動物骨骼提取物具有抗氧化、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、降血壓、保護骨健康等功效[2-3]，其可能與動物骨骼中的優(yōu)質(zhì)蛋白、礦物質(zhì)和脂肪等活性成分有關[4]。膠原蛋白獨特的生物相容性和生物可降解性在食品、美容、農(nóng)業(yè)等領域得到了廣泛的應用[5]，目前已從羊、豬、牛、牦牛、鹿、驢等禽畜骨中制備了膠原蛋白和膠原肽，開發(fā)了骨肽片、骨膠原蛋白肽、骨肽注射液、凍干粉、蛋白膠囊等產(chǎn)品[6-9]，同時開發(fā)了多種骨湯呈味產(chǎn)品[10-11]，骨類資源的開發(fā)日益增多。駱駝隨產(chǎn)業(yè)趨勢逐漸由役用轉(zhuǎn)向食用，但駱駝的可利用部分除了駝奶和肉以外，駱駝骨資源的開發(fā)利用較其它骨資源相比未能得到關注，針對其骨髓營養(yǎng)化學成分研究更為鮮見。

隨著我國的畜禽業(yè)規(guī)模和肉類需求越來越龐大，駱駝養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴大，2021年全國存欄數(shù)約有60 萬峰左右，新疆已成為養(yǎng)殖駱駝最多的地區(qū)之一，占全國總量的47.69%[12]。同年，新疆的駱駝存欄數(shù)19.6 萬峰，畜產(chǎn)品產(chǎn)量1.32 萬t[13]，按動物體重比例，骨骼的質(zhì)量約占體重的20%～30%，待開發(fā)的骨類蛋白資源較為豐富。目前國內(nèi)外已有部分關于動物膠原蛋白提取及功能特性的研究，如豬骨中蛋白提取率可達28.45%，酶解后羥自由基清除能力較強，在pH 值為5，濃度為2.5 mg/mL 時，其酶解物具有較高的乳化穩(wěn)定性[14-16]；羊骨的蛋白質(zhì)含量占總質(zhì)量的20.97%，羊骨多肽具有較好的抗氧化活性[17-18]；牛骨膠原蛋白肽提取率為12.45%，且分子量越小抗氧化能力越強[19]，牦牛骨的兩種膠原蛋白肽對DPPH·、ABTS+·、·OH 和·O2-均有較好的清除活性，可用于抗氧化產(chǎn)品開發(fā)[20]。隨著食品加工技術的進步，越來越多的學者關注動物骨類蛋白與相關產(chǎn)品在理化性質(zhì)上的應用，烏日古莫樂[21]發(fā)現(xiàn)牛骨蛋白在pH 值為8 時，理化性質(zhì)表現(xiàn)最佳；宋樂[22]前期分析駝掌膠原蛋白的理化性質(zhì)，表明等電點在pH7 附近，遠離等電點時具有較高的乳化性及乳化穩(wěn)定性，持油性為（6.22±0.44）g/g。

從駱駝骨髓中提取膠原蛋白和評價其功能特性及活性是有效利用駱駝骨資源的途徑之一，促進解決動物肉副產(chǎn)品的有效利用問題，同時也能豐富蛋白資源。

本文以駱駝骨髓為原料，蛋白含量為評價指標，在單因素試驗的基礎上利用響應面法對駱駝骨髓蛋白（camel bone marrow protein，CBMP）的提取條件進行優(yōu)化，得出最佳提取工藝，并探究其功能特性和抗氧化活性，旨在為動物骨髓中蛋白資源的高值化開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

駱駝骨：市售，經(jīng)新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院巴吐爾·阿不力克木教授鑒定為新疆雙峰駱駝骨，憑證標本保存于新疆農(nóng)業(yè)大學生物大分子實驗室。

1.2 試劑

牛血清蛋白E-BC-K318-M：武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；考馬斯亮藍G-250：上海藍季科技發(fā)展有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical，DPPH）：上海麥克林生化科技公司；十二烷基硫酸鈉：生工生物工程（上海）股份有限公司；花生油：益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司；石油醚、無水乙醇、氫氧化鈉、三氯化鐵、三氯乙酸、磷酸、鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司。

1.3 主要儀器

電子天平（FA1004）：常州市幸運電子設備有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S）：上海興創(chuàng)科學儀器設備有限公司；冷藏冷凍箱（BCD-208JDE）：浙江星星冷鏈集成股份有限公司；紫外可見分光光度計（T6 新世紀）：北京普析通用儀器有限責任公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52）：上海亞榮生化儀器有限公司；離心機（SF-TDL-40D）：上海菲恰爾分析儀器股份有限公司；高速分散器（XHF-DY）：寧波新芝生物有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品預處理

取出冷凍的駱駝骨，將骨髓與骨質(zhì)分開，初步洗凈，除去骨髓中的殘留碎片和多余的肉渣并洗去血跡，將所得的駱駝骨髓冷凍至-20 ℃下硬化，再放置于搗藥罐中按照1∶6（g/mL）的固液比加入液氮進行冷凍粉碎，保存在-40 ℃冰箱，備用。

1.4.2 CBMP 的提取

參照文獻[23]并略作修改，取30 g 駱駝骨髓粉末，按1∶20（g/mL）固液比加入蒸餾水，攪拌，充分混合，45 ℃下磁力攪拌回流提取2 h，重復3 次，用分液漏斗分離油水層，收集并混合下層提取液，用石油醚萃取脫脂，濾過，再適當濃縮，透析（截留量為3 000 Da）48 h，真空冷凍干燥，得到CBMP 粉末。根據(jù)公式（1）計算CBMP 提取率。

式中：C為CBMP 提取率，%；M為水提蛋白粉末質(zhì)量，g；m為駱駝骨髓粉末質(zhì)量，g；n為駱駝骨髓粉末油含量，%。

1.4.3 蛋白含量測定

標準曲線的繪制[24]：將1 mL 不同濃度的（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）牛血清蛋白質(zhì)溶液分別加入到3 mL 考馬斯亮藍溶液，避光靜置反應5 min。在595 nm 處測吸光度，以蛋白濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程：Y=1.010 8X+0.694 2（R2=0.999 7）。取濃度為1 mg/mL 的蛋白提取液，按照上述步驟測定其蛋白含量。

1.4.4 單因素試驗

以蛋白含量為指標，分別以提取溫度、料液比、時間、提取次數(shù)為影響因素設計單因素試驗。通過單因素試驗考察各因素對CBMP 含量的影響，從而得到合適的自變量水平，進行Box-Behnken 試驗設計，單因素試驗水平見表1。

表1 單因素試驗水平Table 1 Factor levels in single factor experiments

1.4.5 Box-Behnken 法優(yōu)化CBMP 提取工藝

利用Design-Expert 設定四因素三水平試驗，對試驗數(shù)據(jù)進行回歸性分析，擬合響應值與各因素的數(shù)學回歸模型。因素及水平見表2。

表2 響應面優(yōu)化試驗水平Table 2 Factors and levels of response surface design

1.4.6 CBMP 功能特性的測定

1.4.6.1 蛋白溶解性

準確稱取CBMP 樣品10 mg 于離心管中，加入鹽酸（0.5 mol/L）或氫氧化鈉（0.5 mol/L）分別配制pH 值為2、4、6、8、10 的10 mL 溶液，漩渦混合6 min，3 500 r/min 離心25 min，測定其蛋白含量[25]，按公式（2）計算蛋白溶解性。

式中：S為CBMP 溶解性，%；M1為懸浮液中加入的蛋白含量，%；M2為離心后上清液蛋白含量，%。

1.4.6.2 蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性

參照文獻[26]測定CBMP 的乳化性（emulsification，EAI）與乳化穩(wěn)定性（emulsion stability，ESI），準確稱取CBMP 樣品10 mg 于燒杯中，加入鹽酸（0.5 mol/L）或氫氧化鈉（0.5 mol/L）分別配制pH 值為2、4、6、8、10 的10 mL 溶液，再加5 mL 花生油，10 000 r/min 高速均質(zhì)2 min。分別在0 min（A0）和靜置10 min（A10）時從燒杯低部取50 μL 乳濁液與5 mL 十二烷基硫酸鈉（1%）溶液混合均勻，在500 nm 處測定吸光度。用以下公式計算乳化性（A，m2/g）和乳化穩(wěn)定性（S，%）。

式中：W為樣品稀釋倍數(shù)；C為蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；Φ為光程，設定為0.01；θ為乳狀液的油體積分數(shù)，0.25。

1.4.6.3 蛋白持水性

準確稱取10 mg CBMP 記為m0，將CBMP 放入離心管中記質(zhì)量為m1，加入鹽酸（0.5 mol/L）或氫氧化鈉（0.5 mol/L）分別配制pH 值為2、4、6、8、10 的10 mL 溶液，漩渦混合6 min 并于30 ℃恒溫箱恒溫30 min，4 000 r/min 離心30 min，除去上層清液，稱重記為m2[27]，持水性（W，g/g）計算公式如下。

1.4.6.4 蛋白持油性

準確稱取10 mg CBMP 記為m0，將CBMP 放入離心管中記質(zhì)量為m1，加入10 mL 花生油，再漩渦混合5 min，直到樣品被油飽和，靜置30 min，4 000 r/min 離心20 min，將上清液的油去掉，稱離心管質(zhì)量記為m2[28]，持油性（O，g/g）計算公式如下。

1.4.7 CBMP 抗氧化活性的測定

1.4.7.1 DPPH·清除能力

將不同濃度的（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）CBMP 溶液各準確吸取2 mL 于具塞試管中分別加入2 mL 已配制好的DPPH 溶液（0.2 mmol/L）搖勻，37 ℃恒溫30 min，于517 nm 處測定吸光度?？瞻捉M由等量蒸餾水代替，以抗壞血酸為陽性對照[29]。CBMP 對DPPH·的清除率按下式計算。

式中：T1為DPPH·清除率，%；A0為空白組吸光度；A1為樣品組吸光度；A2為對照品組吸光度。

1.4.7.2 ·OH 清除能力

將不同濃度的（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）CBMP 溶液各1 mL 于試管中，分別加入各1 mL 配制好的FeSO4·7H2O 溶液（6 mmol/L）、水楊酸-乙醇溶液（6 mmol/L）和H2O2（0.1%）溶液，反應30 min，于510 nm 處測吸光度[30]。CBMP 對·OH 清除率計算公式如下。

式中：T2為·OH 清除率，%；A0為空白組吸光度；A1為樣品組吸光度；A2為對照品組吸光度。

1.4.7.3 總還原能力

準確吸取不同濃度的（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）CBMP 溶液0.8 mL 于具塞試管中，分別加入0.2 mol/L 的pH 值為6.6 的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）0.4 mL，再加入1%的鐵氰化鉀0.4 mL，在50 ℃水浴20 min，冷卻，加10% 的C2HCl3O2水溶液0.4 mL，再加入蒸餾水1.6 mL 和0.1%的FeCl3水溶液0.4 mL，室溫放置10 min，700 nm 處測吸光度[31]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

每個樣品至少重復測定3 次，取平均值，采用SPSS 16.0、Origin 9.0、Design-Expert 8.0.6 進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

各因素對CBMP 含量的影響如圖1所示。

圖1 各因素對CBMP 含量的影響Fig.1 Effects of various factors on the content of camel bone marrow protein（CBMP）

由圖1A 可知，當提取溫度達到45 ℃時，CBMP 含量達到最高值（P＜0.05），為（34.65±0.23）%。然而，繼續(xù)升高溫度可能導致蛋白的變性，從而導致蛋白含量降低[32-33]。因此，選擇40、45、50 ℃3 個水平進行響應面研究。

由圖1B 可知，當料液比為1∶20（g/mL）時，CBMP含量達到最高值（P＜0.05），為（34.35±0.31）%，進一步升高溶劑量，CBMP 含量逐漸減小。當溶劑量較少時，提取溶液的黏度高，分子擴散速率較低，影響蛋白的溶出；隨著溶劑的增加，溶液逐漸稀釋，蛋白溶解量增加，蛋白含量升高；然而，溶劑量過多導致蛋白含量的降低，這可能是由于太多的溶劑使溶液分散太多，使蛋白損失增加，蛋白含量降低[34]。因此，選擇1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）3 個水平進行響應面研究。

由圖1C 可知，當提取時間為120 min 時，CBMP含量達到最大值（P＜0.05），為（35.13±0.05）%。提取時間較短，蛋白和其他成分分離程度小，導致蛋白含量降低；然而提取時間延長，可能引起蛋白和非蛋白成分的沉淀，從而降低蛋白的含量。因此，選擇90、120、150 min 3 個水平進行響應面研究。

由圖1D 可知，當提取次數(shù)為2 次時CBMP 含量達到最大（P＜0.05），為（35.14±0.18）%。此后，隨著提取次數(shù)的增加，蛋白含量逐步降低，這原因可能是提取次數(shù)過多，可能會導致非蛋白類雜質(zhì)與蛋白一起溶出，因此蛋白含量降低。因此，選擇1、2、3 次3 個水平進行響應面研究。

2.2 響應面法提取條件的優(yōu)化

2.2.1 響應面試驗設計與結果

根據(jù)中心復合試驗設計原理和單因素試驗結果，選擇了對CBMP 含量影響顯著的4 個因素（提取溫度、料液比、提取時間和提取次數(shù)）設計四因素三水平的響應面試驗，結果如表3所示。

表3 響應面分析試驗結果Table 3 Results of response surface test

采用Design-Expert 8.0.6 軟件，分別以提取溫度、料液比、提取時間、提取次數(shù)為變量，經(jīng)多元回歸分析，得到CBMP 提取工藝含量（Y）對4 個因素（A、B、C、D）的二次回歸模型：Y=35.32+1.01A-0.042B+0.76C+0.66D-0.32AB-0.18AC+0.24AD+0.30BC+0.020BD-0.38CD-7.22A2-6.63B2-2.47C2-3.57D2。

以CBMP 含量為響應值對數(shù)據(jù)進行分析，方差分析結果見表4。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equation

回歸模型方差分析表明，A、C、D、A2、B2、C2、D2對CBMP 含量的線性效應極顯著（P＜0.01）；B、AB、AC、AD、BC、BD、CD均不顯著（P＞0.05）；該模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P＞0.05），R2=0.992 0，說明實際試驗與該模型擬合度良好，證明響應面法優(yōu)化CBMP 提取工藝是可行的。F值的大小反映因素對試驗指標（因變量）的重要程度，結果為FA＞FC＞FD＞FB。

2.2.2 各因素交互作用對CBMP 含量的影響

利用Design-Expert 8.0 軟件對工藝參數(shù)組合進行優(yōu)化，等高線的形狀與疏密程度反映因素相互作用的強度，橢圓形且曲線密集對響應值有顯著影響，而圓形和曲線稀疏對響應值沒有顯著影響。各因素交互作用對CBMP 含量的影響如圖2～圖5所示。

圖2 提取溫度與料液比的交互作用Fig.2 Interaction between extraction temperature and solid-liquid ratio

圖3 提取溫度與提取時間的交互作用Fig.3 Interaction between extraction temperature and extraction time

圖4 提取溫度與提取次數(shù)的交互作用Fig.4 Interaction between extraction temperature and extraction times

圖5 提取時間與提取次數(shù)的交互作用Fig.5 Interaction between extraction time and extraction times

由圖2～圖5 可知，提取溫度、料液比、提取時間、提取次數(shù)兩兩交互作用的等高線接近橢圓，說明交互作用明顯。

2.2.3 提取工藝條件的確定和驗證

優(yōu)化得到的CBMP 提取的最優(yōu)提取條件為提取溫度45.35 ℃、料液比1∶19.99（g/mL），提取時間124.36 min、提取次數(shù)2.09，最佳CBMP 含量為35.4357%。考慮到實際運用時的可操作性，將提取工藝參數(shù)修正為提取溫度45℃、料液比1∶20（g/mL）、提取時間120 min、提取2 次。采用修正參數(shù)進行3 次平行試驗，CBMP 含量為（36.56±0.24）%，提取率為（18.26±1.23）%。

2.3 CBMP 功能特性分析

2.3.1 溶解性

溶解性是蛋白質(zhì)十分重要的功能性質(zhì)，pH 值對CBMP 溶解性的影響如圖6所示。

圖6 pH 值對CBMP 溶解性的影響Fig.6 Effect of pH on the solubility of camel bone marrow protein（CBMP）

由圖6 可知，CBMP 在較低或較高的pH 值時，溶解性較好，當pH 值為6 時溶解性最低（P＜0.05），為（23.29±1.58）%，這是由于等電點處在pH6 左右。蛋白質(zhì)在等電點附近時分子間會聚集而發(fā)生沉降，導致溶解度降低[35]，這與楊恒[28]研究中雞肺膠原蛋白在等電點附近溶解度最小，偏離等電點溶解度增大的結果一致。

2.3.2 乳化性及乳化穩(wěn)定性

pH 值對CBMP 乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響如圖7所示。

圖7 pH 值對CBMP 乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effects of pH on the emulsibility and emulsification stability of camel bone marrow protein（CBMP）

CBMP 的乳化性及乳化穩(wěn)定性隨pH 的增加先降后升，pH 值為6 時最低（P＜0.05），為（0.50±0.03）m2/g、（60.55±0.29）%，和溶解性表現(xiàn)出相似的曲線圖，在等電點附近乳化性及乳化穩(wěn)定性較差。堿性條件下CBMP 的乳化性及乳化穩(wěn)定性表現(xiàn)較佳[36]。

2.3.3 持水性

pH 值對CBMP 持水性的影響如圖8所示。

圖8 pH 值對CBMP 持水性的影響Fig.8 Effect of pH on the water-holding capacity of camel bone marrow protein（CBMP）

當pH 值為6 時CBMP 的持水性最弱（P＜0.05），為（2.78±0.05）g/g，這是由于在等電點附近，蛋白間的相互作用較大，結合水的能力較小，在pH 值為8～10 時CBMP 的持水性得到了改善，是因為電離后蛋白間的相互作用變小，結合水的能力增大，表現(xiàn)為持水性增強[37]。

2.3.4 持油性

蛋白質(zhì)的吸油性在肉制品、乳制品以及餅干等食品配方及加工中起著非常重要的作用[38]，CBMP 的吸油性為（7.56±0.73）g/g，比駝掌蛋白高1.34 g/g[22]。

2.4 CBMP 抗氧化活性的分析

2.4.1 DPPH·清除能力

DPPH 法普遍應用于食品和生物試樣的抗氧化能力，能與氧化劑產(chǎn)生的質(zhì)子結合在一起，在最大吸收波長下的吸光度減少[39]。維生素C 與CBMP 對DPPH·清除能力的測定結果如圖9所示。

圖9 CBMP 對DPPH·清除率的影響Fig.9 DPPH·scavenging rate of camel bone marrow protein（CBMP）

由圖9 可知，在測定范圍內(nèi)維生素C 與CBMP 隨著濃度的增加，其清除能力逐漸增強，呈量效關系。不同濃度的對照組維生素C 的DPPH·清除率均高于CBMP。在濃度為1 mg/mL 時，CBMP 的DPPH·清除率最高（P＜0.05），為（53.39±1.09）%，其半抑制濃度IC50是0.75 mg/mL。

2.4.2 ·OH 清除能力

·OH 是體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧，能帶給細胞很大的傷害，因此清除羥自由基是很有必要的[40]，維生素C 與CBMP 對·OH 清除能力的測定結果如圖10所示。

圖10 CBMP 對·OH 清除率的影響Fig.10 ·OH scavenging rate of camel bone marrow protein(CBMP)

由圖10 可知，維生素C 與CBMP 對·OH 具有較強的清除能力，且在0～1.0 mg/mL 范圍內(nèi)，清除率均伴隨濃度的升高而逐漸增加，具有濃度依賴性。不同濃度的對照組維生素C 的·OH 清除率均高于CBMP。在濃度為1 mg/mL 時，·OH 清除能力最高（P＜0.05），為（40.02±1.17）%，其半抑制濃度IC50是1.46 mg/mL。

2.4.3 總還原能力

蛋白的總還原能力與抗氧化活性之間具有顯著的相關性[41]，維生素C 與CBMP 對總還原能力的測定結果如圖11所示。

圖11 CBMP 對總還原能力的影響Fig.11 Total reducing capacity of camel bone marrow protein（CBMP）

由圖11 可知，在濃度0～1.0 mg/mL 范圍內(nèi)總還原能力強弱與維生素C 和CBMP 的濃度呈劑量關系，隨著濃度的增加，總還原能力逐漸增強。不同濃度的對照組維生素C 的總還原能力均高于CBMP。在濃度為1.0 mg/mL 時，達到最大（P＜0.05），為1.11±0.03，表明CBMP 的還原能力較強。

3 結論

通過響應面法優(yōu)化CBMP 提取工藝，得出提取溫度45 ℃、料液比1∶20（g/mL）、提取時間120 min、提取次數(shù)為2 時，CBMP 含量達到（36.56±0.24）%，提取率為（18.26±1.23）%。在最優(yōu)條件下得到的CBMP 具有較好的功能特性及較強的抗氧化活性，pH 值為6 時溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性、持水性最低，分別為（23.29±1.58）%、（0.50±0.03）m2/g、（60.55±0.29）%、（2.78±0.05）g/g，表明等電點在pH6 附近，持油性比駝掌蛋白高，達（7.56±0.73）g/g，堿性條件下CBMP 的功能特性較好。CBMP 對DPPH·、·OH 清除能力IC50值分別為0.75、1.46 mg/mL，濃度為1.0 mg/mL 時，總還原能力為1.11±0.03，表明抗氧化活性較強。本研究為CBMP 的綜合利用提供理論基礎，對動物骨新資源產(chǎn)品的開發(fā)具有現(xiàn)實意義。