槲皮素通過p53-p21-Rb通路緩解慢性阻塞性肺疾病的肺衰老*

高露洋 羅丹 王文軍

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,四川 瀘州 646000)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種以持續(xù)性氣流受限為特征的呼吸系統(tǒng)常見病,早期病變可能僅局限于肺部,但隨著病情進(jìn)展,可逐漸累及全身多個(gè)系統(tǒng)[1],具有較高的致殘率和致死率。肺是與外界環(huán)境相通的器官之一,特別是中老年人,他們暴露于有害氣體或粉塵等外界環(huán)境的時(shí)間更長(zhǎng),同時(shí)個(gè)體進(jìn)入老年期后神經(jīng)體液因子及免疫調(diào)節(jié)功能等會(huì)逐步下降,這將導(dǎo)致肺部結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生與年齡相關(guān)的病理性變化[2],對(duì)COPD等慢性肺部疾病的易感性增加[3],使得COPD好發(fā)于中老年人,且發(fā)病率隨著年齡的增長(zhǎng)而逐漸升高[4],均提示衰老與COPD等年齡相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前臨床上COPD的治療藥物以支氣管擴(kuò)張劑、糖皮質(zhì)激素等為主,然而這些藥物只能緩解癥狀,不能抑制疾病進(jìn)展[5]。COPD作為一種肺部加速衰老的疾病,肺中衰老細(xì)胞的積累會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)疾病進(jìn)展[6],清除衰老細(xì)胞可能是防治COPD的有效方法?？顾ダ纤幬?Senolytics)是一類能夠清除衰老細(xì)胞的化合物,已被發(fā)現(xiàn)的藥物有白藜蘆醇、槲皮素、非瑟酮、雷帕霉素、二甲雙胍、達(dá)沙替尼等[7]。槲皮素(Quercetin,Q)是一種自然界廣泛存在的黃酮類化合物,作為抗衰老藥物之一[8],其可有效清除衰老的巨噬細(xì)胞和脂肪細(xì)胞[9-10]。然而槲皮素能否通過減少COPD患者肺內(nèi)的衰老細(xì)胞改善COPD病情進(jìn)展尚不清楚。因此,本研究通過構(gòu)建COPD小鼠模型,觀察槲皮素是否對(duì)COPD小鼠肺組織具有抗衰老的作用,并研究其可能的機(jī)制,從而為COPD的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只清潔級(jí)C57BL/6雄性小鼠,6～8周齡,體重20～25 g,自由飲水和進(jìn)食,待適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方案通過動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(川)2018-17。

1.2 主要試劑 槲皮素、脂多糖(Lipase, LPS)(美國MCE公司);HE染色液(美國sigma公司);SA-β-gal染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);Bcl-2抗體、Bax抗體(美國Abcam公司);RIPA裂解液、BCA試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司);兔抗p53抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)、兔抗p21抗體(美國Abcam公司)、兔抗Rb抗體(美國CST公司)、兔抗β-actin抗體(武漢科鹿生物科技有限責(zé)任公司)、山羊抗兔HRP標(biāo)記的IgG二抗(武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 COPD小鼠動(dòng)物模型建立及分組 將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、槲皮素組,每組10只。模型組和槲皮素組采用煙熏聯(lián)合氣道內(nèi)滴注LPS的方法建立COPD小鼠模型,具體方法參考文獻(xiàn)[11]。在造模的第1、14 d氣管內(nèi)滴入脂多糖(25 μg/50 μL),第2 ～30 d(除第14 d)進(jìn)行被動(dòng)吸煙,將小鼠放入煙熏裝置中,每次10支香煙,每天2次,每次持續(xù)30 min(兩次間隔4 h以上),共煙熏28 d。對(duì)照組在第1 d和第14 d經(jīng)氣道內(nèi)滴入相同量的生理鹽水,不做煙熏處理。通過肺組織HE染色判斷是否造模成功[12]。若實(shí)驗(yàn)過程中造模失敗或有小鼠死亡,則重新補(bǔ)齊小鼠維持每組樣本量為10只。

1.3.2 給藥方式 造模成功后,槲皮素組給予槲皮素(50 mg/kg)灌胃給藥,1次/d,持續(xù)4周。對(duì)照組和模型組接受等體積生理鹽水溶液灌胃。

1.3.3 HE染色觀察小鼠肺組織病理變化 麻醉所有小鼠并處死,取出小鼠的左肺組織用4%多聚甲醛固定24 h,再用乙醇梯度脫水,包埋在石蠟中,制成厚度為2～3 μm的組織玻片標(biāo)本。采用HE染色,中性樹膠封片,在光鏡下觀察組織切片,并進(jìn)行肺組織病理損傷評(píng)分[13]。評(píng)分指標(biāo):①支氣管粘膜上皮纖毛病變:粘連、倒伏或脫失。②支氣管粘膜上皮病變:糜爛、脫落或鱗化。③支氣管粘膜杯狀細(xì)胞增生情況。④支氣管壁炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。⑤肺泡腔內(nèi)炎性滲出。⑥肺泡氣腫或萎陷。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)病變程度分為正常、輕度異常、中度異常、重度異常,分別評(píng)為0、1、2、3分。每個(gè)切片任取5個(gè)視野,根據(jù)以上指標(biāo)對(duì)觀察到的病變進(jìn)行評(píng)分,將各項(xiàng)分值相加,即為每個(gè)標(biāo)本得分總分。

1.3.4 衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色(SA-β-gal染色)法 將肺組織用4%多聚甲醛固定24 h后,再用30%蔗糖溶液4 ℃低溫脫水,取出后用OCT包埋劑在-40 ℃冷凍包埋后進(jìn)行冰凍切片;取一張肺組織的冰凍組織切片室溫復(fù)溫,PBS洗滌后用β-gal染色固定液室溫固定,傾去固定液,PBS洗3次,每次5 min,滴加適量的β-gal染色工作液(A液10 μL+B液體10 μL+C液930 μL +X-Gal溶液50 μL),37 ℃孵育過夜后,傾去工作液,PBS洗后封片,將切片置于光鏡(200×)下觀察組織染色,藍(lán)染面積為陽性面積,每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野,用Image-Pro Plus分析系統(tǒng)測(cè)定陽性面積的積分光密度(IOD)。

1.3.5 免疫組化染色檢測(cè)各組小鼠Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá) 將肺組織用4%多聚甲醛固定24 h后取出,經(jīng)脫水后進(jìn)行石蠟包埋切片,肺組織的石蠟切片進(jìn)行脫蠟和水化處理后,用檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行熱抗原修復(fù),冷卻至室溫后PBS洗3次,每次5 min,加3%的過氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過氧化氫酶,PBS洗3次,每次5 min,再進(jìn)行一抗4 ℃過夜,二抗37 ℃孵育30 min,加入DAB顯色,最后用蘇木精復(fù)染后進(jìn)行脫水封片。在光鏡下觀察呈棕黃色的陽性細(xì)胞,每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野,采用Image-Pro Plus分析系統(tǒng)測(cè)定視野內(nèi)陽性細(xì)胞的積分光密度(IOD)。

1.3.6 Western blot檢測(cè)各組小鼠肺組織p53、p21、Rb蛋白的表達(dá) 將3組的肺組織用PBS清洗3次,加入蛋白裂解液裂解提取總蛋白,使用BCA試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度。配制適宜濃度的SDS-PAGE膠,隨后進(jìn)行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,在4 ℃條件下孵育一抗過夜,用TBST洗3次后加入二抗室溫孵育1 h,最后滴加ECL進(jìn)行曝光顯影。用AlphaEaseFC軟件對(duì)目的條帶和內(nèi)參條帶的灰度值進(jìn)行量化分析,并計(jì)算目的條帶和內(nèi)參條帶灰度值的比值。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn) HE染色結(jié)果顯示,對(duì)照組可見肺泡結(jié)構(gòu)正常完整,支氣管形態(tài)規(guī)則,支氣管黏膜柱狀上皮細(xì)胞排列整齊,無杯狀細(xì)胞增生,管壁未見變厚,未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn);模型組可見肺泡結(jié)構(gòu)被破壞,肺泡腔內(nèi)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和出血,支氣管管腔變形,管壁增厚,支氣管黏膜上皮變性、壞死或脫落,杯狀細(xì)胞增多,管壁周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);槲皮素組肺組織損傷程度較模型組減輕(見圖1)。對(duì)照組、模型組、槲皮素組肺組織損傷評(píng)分分別為(1.40±0.55)分 、(12.00±1.58)分 、(7.20±0.84)分,經(jīng)方差分析,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=120.743,P<0.001)。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果:與對(duì)照組比較,模型組小鼠肺組織損傷評(píng)分顯著升高(P<0.05);與模型組比較,槲皮素組小鼠肺組織損傷評(píng)分均顯著降低(P<0.05),見圖2。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色病理學(xué)表現(xiàn)(標(biāo)尺=100 μm)Figure 1 Pathological changes of mice lung tissue in each group

圖2 各組小鼠肺組織損傷評(píng)分Figure 2 Lung tissue injury scores of mice in each group注:與對(duì)照組相比, ①P<0.05;與模型組相比,②P<0.05。

2.2 各組小鼠肺組織衰老相關(guān)-β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色陽性面積半定量分析 衰老細(xì)胞經(jīng)SA-β-gal染色后呈藍(lán)色,在光鏡下觀察切片組織藍(lán)染的陽性細(xì)胞(見圖3)。與對(duì)照組相比,模型組藍(lán)染陽性面積IOD值明顯增加(P<0.05);與模型組相比,槲皮素組陽性面積顯著減少(P<0.05),這說明槲皮素能有效延緩肺組織的衰老。見表1。

表1 各組小鼠肺組織SA-β-gal染色陽性面積IOD值Table 1 IOD value of SA-β-gal staining area of mice lung tissue in each group

圖3 各組小鼠肺組織SA-β-gal染色(200×)Figure 3 SA-β-gal chemical staining of mice lung tissue in each group

2.3 各組小鼠肺組織中Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá) 與對(duì)照組相比,模型組小鼠肺組織中Bcl-2表達(dá)明顯下降、Bax蛋白表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,經(jīng)給藥處理后,槲皮素組小鼠肺組織中Bcl-2表達(dá)顯著升高,而Bax蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖4、表2。

表2 各組小鼠肺組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的IOD值Table 2 IOD value of Bcl-2 and Bax protein expression in mice lung tissue of each group

圖4 各組小鼠肺組織Bcl-2、Bax蛋白免疫組化染色(200×)Figure 4 Immunohistochemical staining of Bcl-2 and Bax proteins in mice lung tissues of each group注:Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)于胞質(zhì),陽性細(xì)胞呈棕黃色。

2.4 各組小鼠肺組織中p53、p21、Rb蛋白的相對(duì)表達(dá)量 各組小鼠肺組織中p53、p21、Rb蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較,經(jīng)方差分析,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步兩兩比較:與對(duì)照組相比,模型組小鼠肺組織中p53、p21、Rb蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯增高(P<0.05);槲皮素組中小鼠肺組織中p53、p21、Rb蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于模型組(P<0.05)。見表3、圖5。

表3 各組小鼠肺組織 p53、p21、Rb蛋白的相對(duì)表達(dá)量Table 3 Expression of protein p53, p21 and Rb in each group

圖5 各組衰老相關(guān)蛋白western blot檢測(cè)Figure 5 Western blot detects expression of aging-related protein p53, p21, Rb注:A.對(duì)照組;B.模型組;C.槲皮素組。

3 討論

COPD是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見慢性疾病,已成為全球第三大死因,COPD的發(fā)病率隨著年齡的增加呈上升趨勢(shì)[14],常常與其他年齡相關(guān)的疾病同時(shí)存在,如動(dòng)脈粥樣硬化、2型糖尿病、慢性腎臟病、骨質(zhì)疏松等[15-16],嚴(yán)重影響患者心理[17]及身體健康,且衰老對(duì)許多年齡相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展具有一定影響。研究[18-19]發(fā)現(xiàn),在COPD肺中氣道上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞中均顯示出細(xì)胞衰老增加,這說明細(xì)胞衰老在COPD的發(fā)病機(jī)制中起到至關(guān)重要的作用。研究[20]發(fā)現(xiàn),在衰老小鼠模型中使用抗衰老藥物,能夠有效清除衰老細(xì)胞,從而起到治療作用。目前COPD仍缺乏有效的治療手段。因此,在COPD中給予抗衰老治療可能是一種很有潛力的治療方法?？顾ダ纤幬镩纹に芈?lián)合達(dá)沙替尼可通過消除衰老細(xì)胞改善小鼠與年齡相關(guān)的功能障礙并延長(zhǎng)壽命[21],但目前聯(lián)合用藥的安全性尚不明確,槲皮素聯(lián)合達(dá)沙替尼使用仍為時(shí)過早[22]。近年來研究發(fā)現(xiàn)槲皮素單一用藥仍具有抗衰老的作用,在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中已得到了驗(yàn)證。在體外,槲皮素可清除衰老的人類主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞減輕動(dòng)脈粥樣硬化[23];在體內(nèi),其也可以通過減少肺中的衰老細(xì)胞改善博萊霉素誘導(dǎo)的老年小鼠肺纖維化[24]。本研究首先通過煙熏和氣道內(nèi)滴注脂多糖構(gòu)建COPD小鼠模型,并連續(xù)4周給予槲皮素以探究其對(duì)肺衰老的治療作用及可能機(jī)制。HE染色結(jié)果顯示,模型組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)被破壞,肺泡腔內(nèi)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和出血,支氣管黏膜上皮變性、壞死或脫落,杯狀細(xì)胞增多,支氣管管壁增厚,周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),且模型組小鼠肺組織損傷評(píng)分顯著升高,均提示COPD小鼠模型構(gòu)建成功。SA-β-gal作為細(xì)胞衰老的標(biāo)志之一,在衰老細(xì)胞中表達(dá)升高[25],模型組小鼠肺組織經(jīng)SA-β-gal染色后的藍(lán)染陽性面積較對(duì)照組小鼠明顯增加,證實(shí)了COPD小鼠肺組織發(fā)生了衰老。給予槲皮素進(jìn)行干預(yù)后,發(fā)現(xiàn)小鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞程度和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯減輕,小鼠肺組織病理損傷明顯減輕,SA-β-gal染色的陽性面積減少,但不能完全恢復(fù)到對(duì)照組的狀態(tài),表明槲皮素只能起到緩解肺損傷、延緩衰老的作用。

細(xì)胞衰老與細(xì)胞凋亡是緊密相關(guān)的。Bcl-2蛋白家族介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程,Bcl-2是重要的抗凋亡蛋白,能阻遏細(xì)胞凋亡的發(fā)生,使得細(xì)胞存活;Bax為促凋亡蛋白,當(dāng)其表達(dá)過量時(shí),可促進(jìn)凋亡的發(fā)生[26]。有研究發(fā)現(xiàn),衰老小鼠的Bcl-2表達(dá)減少、Bax表達(dá)增加,這會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡,使得組織功能受損。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組的Bcl-2蛋白表達(dá)下降、Bax蛋白表達(dá)增高;給予槲皮素后能上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá),下調(diào)Bax蛋白表達(dá),說明槲皮素能夠有效抑制肺內(nèi)的細(xì)胞凋亡,改善肺組織的結(jié)構(gòu)和功能。

p53-p21-Rb信號(hào)通路是重要的細(xì)胞衰老信號(hào)傳導(dǎo)通路[27],p53是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑,衰老狀態(tài)下,它可以激活下游的p21分子,而p21又能抑制CDK2/CyclinE復(fù)合體,使得磷酸化的pRb蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)槿チ姿峄腞b蛋白。去磷酸化的Rb蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子E2F,抑制了E2F下游的基因轉(zhuǎn)錄,從而使阻滯細(xì)胞進(jìn)入S期,使細(xì)胞退出細(xì)胞周期,啟動(dòng)細(xì)胞衰老過程[28-29]。本研究顯示,與對(duì)照組比較,COPD模型組小鼠肺組織的p53、p21、去磷酸化Rb蛋白表達(dá)顯著增加,槲皮素能顯著降低p53、p21、Rb蛋白的表達(dá),提示槲皮素可以下調(diào)p53-p21-Rb衰老信號(hào)通路,說明槲皮素緩解COPD小鼠肺衰老的機(jī)制可能與p53-p21-Rb信號(hào)通路有關(guān)。

4 結(jié)論

槲皮素可通過下調(diào)p53-p21-Rb信號(hào)通路,減輕肺組織病理損傷,抑制肺組織細(xì)胞凋亡,延緩肺組織的衰老,從而起到治療COPD的作用。