磷脂酶A1對大豆毛油脫膠效果的影響

姜碧若，曾裕，呂光勇，劉鵬飛，鄺永燕，李軍，畢艷蘭*

（1.中儲糧油脂工業(yè)東莞有限公司，廣東東莞 523147；2.河南工業(yè)大學糧油食品學院，河南鄭州 450001）

在油脂制取過程中，部分膠雜如磷脂、黏液質、蛋白質和糖酯等伴隨油脂進入毛油中[1]。這些膠雜在毛油精煉的堿煉工序會引起乳化而導致油和皂難以分離，脫色工序會引起脫色劑部分活性位點被不可逆地占據（即部分失活），從而導致脫色效率降低，在脫臭工序因高溫被碳化而導致油脂色澤加深，最終使得成品油的穩(wěn)定性降低，如易水解和氧化[2]。因此，脫膠是油脂精煉過程中不可或缺的工序之一，且位于脫酸、脫色和脫臭等工序之前。

水化脫膠法基于可脫除大量水溶性膠雜物質的特點，成為毛油精煉脫膠的最典型方法之一[3]。但該方法僅能去除水化磷脂。酸化脫膠是在水化脫膠的基礎上，通過添加一定量的酸如磷酸和檸檬酸，進一步去除部分非水化磷脂[4]，但該方法耗酸量大且水耗高[5]。相比于傳統(tǒng)的脫膠，酶法脫膠更加符合國家提倡的綠色環(huán)保戰(zhàn)略[6?8]。因此，油脂加工行業(yè)正在逐漸轉向酶法脫膠。

磷脂酶A 能夠特異性地水解磷脂sn?1 和sn?2 位的酯鍵，生成溶血磷脂。溶血磷脂相較于磷脂，其親水性較好，因此更易被脫除，且會減少精煉加工時中性油的損失。目前，磷脂酶A 在不同植物油脫膠方面的研究主要關注脫膠后中性油中磷脂含量和油脂得率的變化[9?11]，對甘油酯、脂肪酸及油腳中磷脂組成和含量的變化關注較少。

本文采用磷脂酶A1 對油脂加工廠溶劑浸出的新鮮大豆毛油進行脫膠，考察磷脂酶A1 添加量、檸檬酸溶液添加量、脫膠溫度和脫膠時間對脫膠后中性油中磷脂、甘油酯和脂肪酸及油腳中磷脂組成和含量變化的影響，并采用正交試驗對工藝參數進行優(yōu)化，以期為酶法脫膠在油脂加工行業(yè)的推廣應用提供一定的數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮大豆毛油（水分及揮發(fā)物0.23%，酸價1.02 mg/g，過氧化值0.66 mmol/kg，含磷量808.75 mg/kg）：中儲糧（新鄭）油脂有限公司；磷脂酶A1（酶活度：10 KLU/g，規(guī)格：100 g）：Novozyme 投資有限公司；氧化鋅、鹽酸溶液、氫氧化鉀、硫酸聯氨、鉬酸鈉、正己烷（色譜純）、無水硫酸鈉、乙醚、異丙醇、三氯甲烷、冰乙酸、碘化鉀、可溶性淀粉、硫代硫酸鈉（其余均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

DF?101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責任公司；PHS?3C 數顯臺式酸度計：上海浦春計量儀器有限公司；CenLee16K 臺式高速離心機：湖南湘立科學儀器有限公司；TU?1810 紫外可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；8860 氣相色譜分析儀、Agilent 7890B 氣相色譜儀：美國Agilent 公司；AVANCE III 500 MHz 核磁：德國Bruker 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 脂肪酸組成測定

油樣的脂肪酸組成測定參考GB 5009.168—2016《食品安全國家標準食品中脂肪酸的測定》中的酯交換法和Bootello 等[12]報道的氣相色譜條件，最后采用面積歸一化法計算脂肪酸相對含量。

1.3.2 甘油酯組成測定

油樣的甘油酯組成測定參考宗蕾等[13]的方法。將1 滴油樣（約20 mg）溶于3 mL 色譜純正己烷，加入少許無水硫酸鈉脫除痕量水，經濾膜過濾后，采用氣相色譜分析儀進行分析。

氣相色譜條件：進樣量為1μL，分流比為20∶1；色譜柱型號為DB?1ht（30.0 m×250 μm×0.1 μm）；載氣為高純氮氣，流速為3 mL/min；進樣口溫度為350 ℃；柱溫箱初始溫度為100 ℃，以50 ℃/min 升至300 ℃后保持5 min，以20 ℃/min 再升至360 ℃后保持15 min；檢測器為氫火焰離子化檢測器，溫度為350 ℃。最后采用面積歸一化法計算甘油酯相對含量。

1.3.3 酶法脫膠和酸法脫膠

稱取100 g 大豆毛油置于500 mL 三頸燒瓶中，水浴加熱攪拌，升溫至80 ℃后，添加濃度為45%的檸檬酸溶液0.11～0.17 mL 保溫攪拌25 min 后，控制脫膠溫度為45～60 ℃，加入2% 蒸餾水和不同質量的磷脂酶A1（10～25 mg）后保溫攪拌1～4 h。反應停止后，90 ℃水浴滅酶10 min。將油樣置于高速離心機1 000 r/min離心15 min，上層油相置于103 ℃烘箱中干燥1 h 后，放入干燥器中冷卻至室溫，用減重法計算脫膠油得率；對下層油腳進行核磁磷譜檢測并分析磷脂的組成。酸法脫膠的步驟和過程，除不添加磷脂酶A1 外，其他步驟同上。采用正交試驗優(yōu)化脫膠工藝參數。

1.3.4 含磷量測定

油樣的含磷量測定參考GB/T 5537—2008《糧油檢驗磷脂含量的測定》鉬藍比色法中含磷量的測定部分，計算公式如下。

式中：X為含磷量，mg/kg；P為標準曲線查得的被測液的含磷量，mg；M為試樣質量，g；V1為樣品灰化后稀釋的體積，mL；V2為比色時所吸取的被測液的體積，mL。

1.3.5 油相pH 值的測定

油相pH 值的測定參考文獻[14]：將2 mL 去離子水與2 mL 待測油水乳化液充分混合后，10 000 r/min離心10 min，收集下層水相，測定其pH 值。

1.3.6 油腳中磷脂成分測定

油腳中磷脂的提取方法參考李軍等[15]的方法，將30～50 mg 左右油腳于1.2 mL 氘代氯仿和甲醇（體積比為1∶1）混合液中溶解，并調節(jié)溶液pH 值至8.5，漩渦混合1 min 后，3 000 r/min 離心10 min 收集下層清液進行核磁分析。核磁參數：脈沖序列為zgpg30、探頭為5 mm PABBO、脈沖等待時間為2 s、采用次數為1 024。

1.4 數據處理

所有試驗至少重復2 次。數據以平均值±標準差表示，采用SPSS 16.0 軟件進行顯著性分析，P＜0.05 表示差異性顯著。

2 結果與分析

2.1 大豆毛油脂肪酸和甘油酯組成分析

大豆毛油脂肪酸和甘油酯組成如圖1所示。

圖1 大豆毛油脂肪酸和甘油酯組成Fig.1 Fatty acid composition and glyceride composition of crude soybean oil

由圖1 可知，大豆毛油脂肪酸組成中不飽和脂肪酸（油酸、亞油酸和亞麻酸）占82.84%，且以亞油酸（54.87%）為主，飽和脂肪酸（豆蔻酸、棕櫚酸和硬脂酸）占15.12%，這與GB/T 1535—2017《大豆油》中規(guī)定的大豆油脂肪酸組成和百分含量一致；甘油酯組成以甘三酯（97.31%）為主。

2.2 脫膠溫度對脫膠油中含磷量的影響

在100 g 大豆毛油、0.15 mL 檸檬酸溶液（45% 濃度）、20 mg/100 g 油的磷脂酶A1、2% 蒸餾水和4 h 反應時間的固定條件下，考察脫膠溫度40～55 ℃對脫膠油含磷量的影響。

脫膠溫度對脫膠油含磷量的影響如圖2所示。

圖2 脫膠溫度對脫膠油含磷量的影響Fig.2 Effect of degumming te mperature on phosphorus content in degummed oil

由圖2 可知，脫膠油中的含磷量隨脫膠溫度的升高先減小后增加，在45 ℃時最低，為0.52 mg/kg。孫靜瑤等[16]采用超聲輔助磷脂酶A1 對沙棘果油進行酶法脫膠時也發(fā)現相同的規(guī)律。這主要是由于酶的活性受溫度影響較大，即低于或者高于最適溫度時均會降低酶活或者使酶失活，只有最適溫度下酶的活性最高。當溫度從40 ℃增加至45 ℃時，酶的活性增加且分子運動加快，使得體系中酶與磷脂間的有效碰撞次數增加，從而導致更多的磷脂被脫除；當溫度從45 ℃增加至50 ℃時，分子運動進一步加快，但因溫度超過酶的最適反應溫度而使得酶活性降低，磷脂脫除量減少。因此，選擇45 ℃為磷脂酶A1 的最適脫膠溫度。

2.3 磷脂酶A1 添加量對脫膠油中含磷量的影響

在100 g 大豆毛油、0.15 mL 檸檬酸（45% 濃度）、2%去離子水、45 ℃反應溫度和4 h 反應時間的固定條件下，考察磷脂酶A1 添加量（0～25 mg/100 g 油）對脫膠油中含磷量的影響。

磷脂酶A1 添加量對脫膠油中含磷量的影響如圖3所示。

圖3 磷脂酶A1 添加量對脫膠油中含磷量的影響Fig.3 Effect of phospholipase A1 loading on phosphorus content in degummed oil

由圖3 可知，脫膠油中的含磷量隨磷脂酶A1 添加量的增加先減小后增加，在添加量為20 mg/100 g 油時最低，為0.52 mg/kg。王志遠等[17]采用磷脂酶A1 對蘋果籽油進行酶法脫膠，發(fā)現磷脂酶A1 添加量超過40 mg/kg 油時，脫膠油中的含磷量也呈現回升趨勢。王靈等[18]采用磷脂酶C 對葵花籽油進行脫膠時也發(fā)現相同的規(guī)律。這主要是由于磷脂酶A1 的活性受體系水分活度的影響。磷脂酶A1 添加量從0 增加至20 mg/100 g 油時，體系中酶與磷脂間的有效碰撞次數增多，從而更多的磷脂被水解而脫除；但當磷脂酶A1 添加量從20 mg/100 g 油增加至25 mg/100 g 油時，過度的磷脂酶引起體系水分活度降低而導致水解力下降。因此，選擇20 mg/100 g 油作為磷脂酶A1 的最佳添加量。

2.4 檸檬酸溶液添加量對脫膠油中含磷量的影響

在100 g 大豆毛油、20 mg/100 g 油的磷脂酶A1 添加量、2% 去離子水、45 ℃反應溫度和4 h 反應時間的固定條件下，考察檸檬酸溶液添加量（45%濃度，0.11～0.17 mL）對脫膠油中含磷量的影響。

檸檬酸溶液添加量對脫膠油中含磷量的影響如圖4所示。

圖4 檸檬酸溶液添加量（45%濃度）對脫膠油中含磷量的影響Fig.4 Effect of citric acid solution（45%）loading on phosphorus content in degummed oil

由圖4 可知，脫膠油中的含磷量隨檸檬酸溶液添加量的增加先減小后增加，在檸檬酸溶液添加量為0.15 mL（pH4.99）時最低，為0.52 mg/kg。汪增乾等[19]采用磷脂酶A1 對四級濃香菜籽油進行酶法脫膠時發(fā)現相同的規(guī)律。這主要是由于酶的活性極大地受體系pH 值影響，且檸檬酸的添加有利于螯合金屬離子；但過多的檸檬酸導致體系pH 值較低而降低酶的活性。因此，選擇0.15 mL 檸檬酸溶液添加量（pH4.99）用于維持體系的pH 值。

2.5 脫膠時間對脫膠油中含磷量的影響

在100 g 大豆毛油、20 mg/100 g 油的磷脂酶A1 添加量、0.15 mL 檸檬酸溶液添加量（45% 濃度）、2% 去離子水、45 ℃反應溫度和4 h 反應時間的固定條件下，考察脫膠時間1～4 h 對脫膠油中含磷量的影響。

脫膠時間對脫膠油中含磷量的影響如圖5所示。

圖5 脫膠時間對脫膠油中含磷量的影響Fig.5 Effect of degumming time on phosphorus content in degummed oil

由圖5 可知，脫膠油中的含磷量隨脫膠時間的延長呈下降趨勢，4 h 時降至0.52 mg/kg。這主要是由于隨著反應時間的延長，磷脂逐漸水解為溶血磷脂。相比于磷脂，溶血磷脂因少一分子脂肪?；H水性更強、更易于絮凝而被去除。因此，選擇4 h 作為最適脫膠時間。

2.6 酶法脫膠參數優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗（三因素三水平，脫膠時間固定在4 h）優(yōu)化脫膠工藝參數，結果如表1所示。

表1 酶法脫膠正交試驗結果Table 1 Orthogonal test results of enzyme?catalyzed degumming

由表1 可知，脫膠溫度對磷脂酶A1 脫膠的影響最大，其次為檸檬酸溶液添加量（pH 值）和磷脂酶A1添加量。通過比較k 值可以得到磷脂酶A1 脫膠的最佳反應條件為A3B2C2，即50 ℃脫膠溫度、20 mg/100 g油的磷脂酶A1、0.15 mL 檸檬酸溶液（45% 濃度）、4 h脫膠時間。此條件未出現在正交試驗中，將最佳反應條件A3B2C2與正交試驗中的A3B2C1進行驗證，組合A3B2C2酶法脫膠條件下中性油的含磷量為0.47 mg/kg，低于組合A3B2C1，因此選擇A3B2C2為磷脂酶A1 脫膠的最佳反應條件。

在最佳脫膠條件下，比較了加酶前后（酸法對比酶法）脫膠油含磷量、得率、脂肪酸組成和甘油酯組成的變化，結果如表2 和圖6所示。

表2 酸化和酶法脫膠條件下脫膠油含磷量和得率Table 2 Phosphorus content and yield of oil from acid degum?ming and enzyme?catalyzed degumming

圖6 酸化和酶法脫膠中性油的脂肪酸和甘油酯組成Fig.6 Fatty acid composition and glyceride composition in the oil obtained from acid degumming and enzyme?catalyzed degumming

由表2 可知，最佳酶法脫膠條件下中性油的含磷量（0.47 mg/kg）低于相應酸化脫膠條件下中性油的含磷量（1.93 mg/kg），而得率高于酸化脫膠油的得率，這是由于磷脂酶A1 水解使得磷脂轉化為更易溶于水的溶血磷脂而被去除，減少了水洗過程中磷脂引起的甘三酯損失。

由圖1 和圖6 可知，酸化脫膠和酶法脫膠中性油的脂肪酸組成與毛油的脂肪酸組成相比，均沒有明顯變化，說明脫膠工序基本不影響油脂的脂肪酸組成，這與文獻[20]的結果一致。與毛油的甘油酯組成相比，酸化脫膠和酶法脫膠中性油的甘油酯組成中甘一酯和甘二酯相對含量下降，而甘三酯相對含量升高。酸化脫膠和酶法脫膠中性油的甘油酯組成之間無明顯變化。

2.7 油腳中磷脂的表征

采用核磁對酸化和酶法脫膠油腳中的各磷脂組分進行測定，結果如圖7 和表3所示。

表3 酸化脫膠和磷脂酶A1 脫膠油腳中的磷脂組成Table 3 Phospholipid composition in the lecithin gum obtained after acid degumming and phospholipase A1?catalyzed degumming

圖7 酸化脫膠和磷脂酶A1 脫膠油腳中磷脂的31P NMR 圖譜Fig.7 31P NMR spectra of phospholipids in the lecithin gum ob?tained after acid degumming and phospholipase A1?catalyzed de?gumming

由表3 可知，酸化脫膠油腳中磷脂以磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和磷脂酸為主，未檢測到溶血磷脂，這與俞樂[21]的研究結果相似。與酸化脫膠油腳相比，磷脂酶A1 脫膠油腳中磷脂的組成中出現了溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰膽堿3 種溶血磷脂（總相對含量占48.0%），磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和磷脂酸的相對含量降至52.1%，這說明磷脂酶A1 脫膠有效地作用于磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和磷脂酸，使其形成易溶于水的溶血磷脂而被脫除。

3 結論

酶法脫膠試驗表明，磷脂酶A1 能有效脫除毛油中的磷脂。與酸化脫膠油相比，磷脂酶A1 脫膠中性油中含磷量降至0.47 mg/kg，油脂得率有所提高。與毛油的脂肪酸組成相比，酶法脫膠中性油的脂肪酸組成沒有明顯變化，甘油酯組成中的甘一酯和甘二酯相對含量降低，而甘三酯相對含量增加。磷脂酶A1 脫膠有效地作用于磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和磷脂酸，使其形成易溶于水的溶血磷脂而被脫除，從而使得油腳中溶血磷脂的相對含量增加至48.0%。